脂肪酸对人血管内皮细胞纤溶酶原激活物抑制剂-1表达的影响

为探讨不同种类脂肪酸对血管内皮细胞(ECs)纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达的直接影响及影响水平，以不同浓度的亚麻酸、亚油酸、油酸、硬脂酸诱导培养ECs，逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附法。（ELISA)检测PAI-1的mRNA和蛋白表达，随后以上述脂肪酸诱导转染了由PAI-1启动子控制表达的报告基因的ECs，ELISA检测PAI-1启动子转录活性，结果ECs中亚麻酸、亚油酸和油酸均浓度依赖地诱导PAI-1 mRNA和蛋白表达，硬脂酸无影响，而它们对PAI-1启动子转录活性的影响与上述作用一致，提示不饱和脂肪酸通过提高PAI-1转录活性诱导其在ECs的表达。     

纤溶酶原激活物抑制剂-1与肥胖

纤 溶系统由纤溶酶原、纤溶酶原激活物 ( plasminogenac tivatorPA)和激活物特异性抑制剂 (plasminogenacti vatorinhibitorPAI)、纤溶酶及纤溶酶抑制物组成 ,其主要功能是通过纤溶酶溶解纤维蛋白而将其从循环系统中清除出去。PAI是纤溶系统活性主要的生理调节物 ,它在体内有多种形式 ,包括内皮细胞型 (PAI 1)、胎盘型 (PAI 2 )、尿型 (PAI 3)和连接蛋白酶 1(proteasenexin 1) ,其中PAI 1在纤溶活性调节中起着重要作用 ,它主要灭活组织型纤溶酶原激活物 (t PA)。PAI 1和t PA之间的平衡对维持纤溶系统正常功能十分重要。临床和流…     

基因重组纤溶酶原 Kringle 5 对血管生成抑制作用的研究

目的 研究基因重组纤溶酶原 (Kringle 5, K5) 对小鼠的血管生成的抑制作用。 方法 以体外 培养的小鼠内皮细胞为研究对象, 利用划痕实验和黏附能力测定实验观察重组 K5 对内皮细胞迁移、 黏附 能力的影响; 利用体外血管生成体系、 创伤愈合和鸡胚尿囊膜 ( chicken embryo allantoic membrane, CAM) 血管生成能力实验, 检测 K5 对血管生成作用的影响。 结果 200 nmol / L K5 显著抑制内皮细胞的迁移、 黏 附以及新生血管的生长长度。 并且 K5 在 2 ~ 18 mg / kg 浓度范围内对小鼠创伤愈合具有明显的抑制作用。 此 外, 6、 12 与 25 mg / L K5 显著抑制 CAM 血管生成, 25 mg / L K5 的抑制作用最强。 结论 K5 能明显抑制血 管生成, 为临床抑制血管生成治疗提供理论依据。     

重组纤溶酶原Kringle 5区基因杆状病毒载体的构建及表达研究

目的克隆人源性纤溶酶原Kringle5(K5)基因,构建K5分泌型杆状病毒载体,并检测其在肌细胞中的表达。方法引物中加入前胰岛素原信号肽基因序列,PCR产物经Age Ⅰ和Acc Ⅰ双酶切后装入pFB载体中构建为pFBK5,将其转染肌细胞C2C12,经Western印迹检测重组蛋白的表达并用MTT试验进行初步活性鉴定。结果成功扩增出了K5基因序列,测序正确,转染了pFBK5的C2C12细胞及上清中均检测到了特异性的14 ku蛋白条带且其对ECV304细胞产生剂量依赖性抑制作用,而转染空载体对照组无相应蛋白表达。结论人源性纤溶酶原K5分泌型杆状病毒载体构建成功,表达的重组蛋白具有生物活性,为进一步的病毒制备奠定了基础。     

纤溶酶原激活物抑制剂-1在SD大鼠胰腺的表达

目的研究纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)在大鼠胰腺组织中的表达,为临床上对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)患者使用抗凝剂及抗血小板药物治疗提供理论依据,并为进一步研究应用PAI-1抑制剂治疗胰腺炎提供形态学依据。方法应用免疫荧光组织化学双重标记技术,在激光共聚焦显微镜观察PAI-1在大鼠胰腺组织中的分布。结果 PAI-1免疫反应阳性细胞分布在SD大鼠胰腺的外分泌腺腺泡细胞,以及内分泌腺D细胞及PP细胞,阳性物质分布于细胞质。结论 PAI-1可能在胰腺起着非常重要的作用,为进一步研究应用PAI-1抑制剂治疗胰腺炎提供了形态学依据。     

纤溶酶原激活剂抑制剂-1基因4G/5G多态性与卵巢早衰相关性研究

目的探讨纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)基因启动子区4G/5G多态性与卵巢早衰(POF)发病的相关性。方法应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析,检测了83例POF患者(POF组)和56例正常妇女(对照组)的PAI-1基因4G/5G多态性;经阴彩色多普勒检测卵巢大小、卵巢动脉内径、RI指数。结果(1)POF组PAI-1基因分布:4G/4G型为38.6%,4G/5G型为47%,5G/5G型为14.4%;POF组4G等位基因频率(0.621)和4G/4G型频率(38.6%)显著高于正常对照组(0.455和16.1%)(P(0.01)。(2)POF组卵巢大小(2.03 cm×1.1 cm)明显小于对照组(2.9 cm×2.3 cm),卵巢动脉内径明显小于对照组,而卵巢动脉血流阻力指数(0.72±0.04)明显高于对照组(0.47±0.04)。(3)4G/4G基因型妇女发生POF的相对风险率的比数比为3.28,95%的可信区间为1.45~7.43。结论PAI-1基因4G/5G多态性与POF的发病密切相关,纯合子4G/4G基因型可能是POF发病的重要危险因素之一。     

儿童脓毒症纤溶酶原激活物抑制剂-1基因启动子区4G/5G多态性的研究

目的探讨纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）基因启动子区单核苷酸插入或缺失（4G/5G）多态性与广州地区汉族脓毒症患儿的相关性,对脓毒症的发生、发展和临床预后的影响。方法选取2007年4-12月广州市妇女儿童医疗中心诊治的汉族脓毒症患儿为病例组,同期收集健康查体儿童为对照组。应用等位基因特异性扩增多聚酶链（AS-PCR）法对病例组和对照组行PAI-1基因启动子区4G/5G多态性检测和分析。采用基因计数法计算各组基因型频率和等位基因频率,χ^2检验分析比较两组人群各基因型的分布差异,计算OR值及其95%CI评估各基因型的风险。结果研究期间病例组纳入148例,对照组181名。病例组和对照组PAI-1基因启动子区4G/5G多态性的基因型和等位基因频率分布差异无统计学意义（χ^2=0.79,P〉0.05）。等位基因4G（χ^2=4.35,P〈0.05）及其纯合子（χ^2=4.44,P〈0.05）与脓毒症发展相关;携带等位基因4G患儿发展至重症脓毒症的风险比5G高,OR=4.05（95%CI：1.09-15.08）,4G/4G纯合子患儿发展至重症脓毒症的风险比其他基因型高,OR=4.57（95%CI：1.11-18.78）。等位基因4G（χ^2=9.17,P〈0.05）及其纯合子（χ^2=7.35,P〈0.05）与脓毒症病死率相关,携带等位基因4G患儿脓毒症病死风险较5G高,OR=4.30（95%CI：1.50-12.29）,4G/4G纯合子患儿脓毒症病死风险较其他基因型高,OR=3.14（95%CI：1.49-6.61）。结论PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与广州地区汉族脓毒症患儿进展及预后相关,等位基因4G及其纯合子是其高危遗传因素;PAI-1基因启动子区4G/5G点多态性与脓毒症的易感性无关。     

尿激酶型纤溶酶原激活物受体mRNA表达与胃癌进展、血管生成及生存期的关系

1．资料：105例标本来自1986年9月至1998年10月间本院外科胃癌患者根治手术切除标本,均有5年以上完整随访资料,生存期的计算从手术日期至随访截止日期,或由于复发、转移而死亡的时间。患者平均年龄57．6(38～78)岁,男女比为2：1(70：35)。膨胀性生长48例,浸润性生长57例;按WHO1999年胃癌分类标准,管状腺癌37例,乳头状腺癌17例,低分化腺癌34例,印戒细胞癌8例,黏液腺癌9例;高、中分化腺癌63例,低、未分化腺癌42例。T120例,T224例,T329例,T432例;脉管侵犯76例,无脉管侵犯29例;远处转移42例(腹膜24例,肝18例),无远处转移63例。取同期距癌边缘5cm以上的邻近无增生或无异型增生的非肿瘤胃黏膜20例作对照。     

抗PAI抑制作用的组织纤溶酶原激活剂在大肠杆菌中的表达

目的:构建t-PA活性不被PAI-1抑制的新一代t-PA突变体。方法:根据t-PA的结构特点,去除t-PA分子中的指状区、表皮生长因子和Kringle1区,以含全长t-PA编码区序列的pUC18质粒为模板,经PCR扩增编码氨基酸1~3和176~527位的截短式t-PADNA序列;并将该t-PA分子中的PAI-1结合位点,即第373~384位核苷酸(AAGCACAGGAGG)突变为(GCGGCCGCGGCG),相应的氨基酸KHRR则变为AAAA。结果:测序证实,t-PA突变体的DNA序列正确,将其克隆于大肠杆菌表达载体中,并在大肠杆菌中得到高效表达。表达蛋白占总菌体蛋白的30%,以包涵体形式存在。经蛋白质变性、复性,得到有活性的t-PA突变体。t-PA突变体与PAI-1反应后t-PA的活性未受到抑制。结论:t-PA突变体可能是一种用于治疗心肌梗死和脑血栓等血栓性疾病的强效且剂量要求低的新型生物工程药物。     

稳定表达组织型纤溶酶原激活因子基因的人脐静脉内皮细胞株的建立

为建立稳定表达组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)基因的人脐静脉内皮细胞株,为其在基因修饰的组织工程血管中的应用奠定基础。首先构建t-PA基因的真核表达载体pcDNA3.1-Myc-HisB(-)/t-PA,将该表达载体用阳离子脂质体介导,转染人脐静脉内皮细胞系细胞,经G418筛选,获得阳性细胞克隆,扩增后分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹(Western-blotting)检测t-PA转录和蛋白表达水平,用底物发色法检测t-PA的活性。逆转录聚合酶链反应检测出了t-PA的稳定转染细胞克隆,免疫印迹证实该克隆细胞有含Myc标签的t-PA蛋白表达,底物发色法检测发现其表达产物的活性增加。结果证明成功建立了稳定表达t-PA基因的人脐静脉内皮细胞株。     

人纤溶酶原kringle5功能区基因在大肠杆菌中克隆和表达

目的:构建含有人纤溶酶原kringle5功能区基因的表达质粒,了解在E.coli中表达情况。方法:采用基因工程技术将人纤溶酶原kringle5功能区基因插入载体PBV220E.coRI位点,再转化到E.coliTGI中,SDS-PAGE观察基因表达。结果:构建出表达质粒PBVK5,42℃诱导获得表达。结论:人纤溶酶原kringle5功能区基因表达产物以可溶性蛋白形式存在,表达量占菌体总蛋白9.8%。     

登革病毒E蛋白区段基因克隆及高效表达

目的进行登革病毒Ｅ蛋白区段的高效表达,制备抗原,为分析Ｔ、Ｂ细胞表位及免疫功能的研究奠定基础。方法以含有Ｄ２ＶＥ区的质粒ｐ３０．ＶＤ２为模板,ＰＣＲ扩增了编码Ｄ２ＶＥ蛋白３０８～４６８ａａ区段的基因片段,以ｐＭＹ为表达载体,构建了表达质粒ｐＤＥ１,并用酶切法使之缺失跨膜区疏水ａａ较多的编码序列,又构建了表达质粒ｐＤＥ２,分别转化大肠杆菌,获得了不同的工程菌株。经诱导培养,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,免疫印迹及酶联检测分析表达产物。结果含ｐＤＥ１质粒工程株只能表达微量的特异性蛋白;而含ｐＤＥ２质粒的工程菌株则能高效表达Ｄ２Ｖ特异性Ｅ蛋白,重组表达产物占菌体蛋白的２５．３１％。用４ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解包涵体,上清中Ｅ蛋白纯度可达８０％。以粗提物包板进行酶联检测,结果表明,该重组Ｅ蛋白具有ＤＶ４个型交叉抗原的特性。结论缺失Ｃ末端疏水区编码序列的Ｄ２ＶＥ基因片段,可在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得高效表达,其表达产物具有ＤＶ属特异性。     

人TPO全长分子在大肠杆菌中的表达及其活性分析

利用反转录－ＰＣＲ从人胎肝中获得编码血小板生成素（ｈＴＰＯ）全长ｃＤＮＡ，在大肠杆菌中表达了人ＴＰＯ全长分子。电镜观察结果，目的蛋白在菌体内以包涵体形式存在，表达量约占菌体总蛋白的２７％；表达产物经初步纯化后，与ＣＯＳ－７细胞中表达的人ＴＰＯ３５３个氨基酸全长分子分别做ＢＡＬＢ／ｃ小鼠体内活性分析，结果表明，原核与真核系统表达的ＴＰＯ均具有明显促进血小板生成的作用。这为进一步研究ＴＰＯ的糖基化与其生物学活性及半衰期关系打下基础。     

抗-D抗体Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：于大肠杆菌表达抗-D抗体Fab段基因，为真核载体表达完整的人抗-D抗体奠定基础。 方法： 将已克隆测序的Fab段基因亚克隆到pComb3噬粒载体，用PCR和限制性内切酶酶切鉴定后于大肠杆菌进行表达，表达产物用SDS-PAGE和ELISA等方法分析。 结果： SDS-PAGE电泳表明重组克隆表达了1条约48 kD的蛋白条带, ELISA结果显示，所表达的抗体和Rh+的人红细胞呈阳性反应，和Rh-红细胞反应为阴性，阴性对照和Rh+及Rh-红细胞反应均为阴性。 结论： 于大肠杆菌表达了具有抗原结合特性的人抗-D抗体Fab段抗体分子。     

新型人白细胞介素-13在大肠杆菌中的表达及生物活性分析

目的 :在大肠杆菌中表达人白细胞介素 13的新型拼接体蛋白。方法 :用植物凝集素 (PHA)和刀豆凝集素 (ConA)共刺激人Jurkat细胞 ,通过半巢式RT PCR扩增在 98位缺失Gln、不含信号肽的人IL 13新拼接体基因 ,并克隆入 pBV2 2 0 ,构建 pBVIL 13表达载体 ,经温度诱导后在大肠杆菌DH5α中表达新型人IL 13蛋白。表达产物经S 2 0 0纯化、复性后 ,用TF 1细胞进行MTT比色测定其活性。结果 :成功地分离了人IL 13新拼接体基因 ,并在大肠杆菌中表达。分离纯化的新型IL 13蛋白 ,其比活性为 1.6× 10 6U/mg。结论 :获得具有生物学活性的新型人IL 13细胞因子 ,为用其治疗肿瘤和脓毒症提供了新的手段     

睾丸肿瘤抗原MAGE-E1基因片段的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆及表达人胶质瘤特异性抗原MAGE-E1基因片段。方法：从人胶质瘤细胞系BT-325提取总RNA，用RT—PCR从中扩增出MAGE-E1基因片段。将MAGE—E1基因片段插入载体pGEM—Teasy中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆至表达载体pGEX—4T—2中，构建重组表达载体pGEX—4T—2—MAGE—E1，并转化大肠杆菌进行表达。结果：用1mmoL／L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h，MAGE—E1蛋白的表达即达高峰。SDS—PAGE及凝胶密度扫描分析表明，表达出MT约41000大小的蛋白，占菌体总蛋白35％。结论：该基因片段的高效表达为进一步制备其抗体，以及制备肿瘤疫苗奠定了基础。     

人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外区2-3loop在Pichia.pastoris酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的研究人Flt-1胞外区2-3loopcDNA在Pichia.pastoris酵母中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的重组Flt-1(2-3)。方法采用PCR扩增Flt-1(2-3)基因,经DNA序列分析后,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia.pastoris酵母表达载体中,构建重组质粒pPIC9K/Flt-1(2-3),转化酵母宿主菌GS115,筛选His     

人白介素1受体拮抗剂的cDNA克隆和原核表达

从活化的正常人外周血单核细胞中提取总ＲＮＡ，经逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）获得了人白介素１受体拮抗剂（ＩＬ－１Ｒａ）ｃＤＮＡ。经过ＤＮＡ测序分析，发现该片段和国外发表的ＩＬ－１ＲａｃＤＮＡ序列一致，将该目的基因插入ｐＢＶ２２０载体，并转入大肠杆菌ＨＢ１０１中，经热诱导表达重组蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后发现，菌体超声裂解后，在可溶性上清中有一Ｍ１７０００的特异带，约占菌体可溶性总蛋白的８０％以上     

人神经营养素-3全基因在大肠杆菌内的表达

目的　应用基因工程方法制备人神经营养素 3(hNT 3)蛋白 ,为研究hNT 3的生物学作用和开展应用hNT 3进行中枢神经损伤和退行性疾病的治疗提供材料。方法　将经过序列分析确定的hNT 3全基因重组至原核表达质粒pBV2 2 0中 ,构建了重组表达载体pBV/hNT 3,在大肠杆菌中表达后 ,SDS PAGE法测定目的蛋白的相对分子质量 ,鸡胚背根节培养法检测其生物学活性。结果　pBV/hNT 3在大肠杆菌中表达出了三个分子质量分别为 1 5× 1 0 3、1 8× 1 0 3和 33× 1 0 3的蛋白质 ,恰与hNT 3蛋白、其前导肽及前体的分子量相符。表达蛋白主要以包涵体形式存在 ,经纯化复性后 ,可明显促进鸡胚背根节的存活和神经元突起的生长。结论　人神经营养素 3全基因可在大肠杆菌内正确地转录和翻译 ,并可部分性地进行加工     

抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 构建人源抗HIV-1单链抗体和白喉毒素融合基因的原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达重组蛋白.方法通过PCR扩增,获得目前应用较多的DAB389基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定.结果酶切及DNA序列测定鉴定正确.SDS-PAGE和Western Blot分析证实,重组质粒可表达出相对分子质量为75 200的蛋白,与DT-hs120融合基因子量一致,其表达量约占菌体总蛋白的21%,表达形式主要为包涵体.结论 成功构建了DT-hS120表达载体,并获得了高效表达.