实时荧光PCR检测沙门菌特异基因

目的：建立一种灵敏、快速检测沙门菌的实时荧光PCR方法.方法：针对沙门菌特异性基因invA设计引物、探针,在实时荧光PCR仪上进行扩增、检测和结果分析.结果：应用该实时荧光PCR方法,30株沙门菌检测结果均为阳性,19株非沙门菌结果均为阴性,96个肛门拭子样本增菌前后的PCR结果一致;检测灵敏度达到4 cfu/test,定量结果与培养计数无显著差异.结论：该方法检测沙门菌具有灵敏度高、快速方便的特点,且可用于定量检测.     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

[目的]建立一种快速、灵敏、准确的检测方法,预防沙门菌食物中毒。[方法]根据沙门菌保守基因序列fimY基因设计合成了引物和TaqMan探针,建立快速检测沙门菌的实时荧光定量方法,并对反应条件进行了优化,组装成快速检测试剂盒。[结果]其检测灵敏度达到4．5efu,比常规PER高100倍,而且稳定性良好,冷冻至少可以保存9个月。[结论]通过临床样品的检测,该试剂盒具有操作简便快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性强等优点,很适合大量样品的检测。     

沙门菌和志贺菌双重实时荧光定量PCR的应用效果评价

目的研究沙门菌和志贺菌双色实时荧光PCR法的应用价值。方法收集2017年8月到2018年4月深圳市西丽人民医院临床肛拭子样本2700份,运用双色实时荧光PCR法检测沙门菌与志贺菌,统计阳性检出率,并与培养法的检测结果进行对比。结果 2700份样本中,培养法检出沙门菌与志贺菌阳性分别为2株、0株,检出率分别为0.07%、0.00%,双色实时荧光PCR法检出沙门菌与志贺菌阳性分别为6株、3株,检出率分别为0.22%、0.11%,双色实时荧光PCR法检出率高于培养法,对比差异有统计学意义(P0.05)。结论双色实时荧光PCR法检测沙门菌和志贺菌的临床效果显著,具有较高的特异性、敏感度及准确率,值得临床推广与应用。     

荧光定量PCR快速检测沙门菌方法的建立及应用

目的:建立沙门菌实时荧光PCR的快速检测方法,探讨其可行性和应用价值。方法:根据沙门菌的特异性DNA作为靶序列,以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板进行荧光检测。结果:本研究在7种相关菌株的检测中,除沙门菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性;在纯菌条件下,定量检测低限为30 cfu/ml;同一样品检测3次Ct值的变异系数均小于5%;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论:该方法的建立,不仅为食源性沙门菌污染及食物中毒的快速检测提供依据,而且还可直接用于临床粪便标本的检测。     

食品中沙门菌实时荧光PCR快速检测方法的研究

目的利用荧光定量PCR技术，建立食品中沙门菌污染的快速敏感特异的检测方法。方法以沙门菌的fimY基因作为靶序列，设计一对引物和探针，以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板，优化引物和探针的浓度比和Mg^2＋浓度，以沙门菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性，并初步应用于样品的检测。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0．8μmol／L，1．0μmol／L，Mg^2＋浓度为3mmol／L时，具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中，除沙门菌出现很好的阳性外，其余菌株均为阴性。在纯菌条件下，定量检测低限33cfu／ml。稳定性分析表明：同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5％。检测样品结果显示实时PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。结论该方法特异性强，稳定性高，操作简便快捷，适应食品微生物检验发展需要，具有较大的推广及应用价值。     

实时荧光PCR方法检测水产品中沙门菌

[目的]探索沙门菌快速检验法，加快水产品检验检疫通关速度，促进外经贸经济的发展。[方法]用深圳太太基因工程有限公司提供的沙门菌实时荧光PCR试剂盒对水产品样本进行检验。[结果]用实时荧光PCR从多个水产品样品的增菌液中检出9份样品沙门菌阳性，用传统的微生物生理生化培养法从该9份样品中分离出9株沙门菌。根据血清分型、API鉴定和荧光PCR结果，确认所分离的菌株中有沙门菌B群3株、C1群4株、D群1株、其他群1株。[结论]实时荧光PCR方法在沙门菌的检验方面较传统方法具有快速、灵敏、特异性强等优势，有利于提高沙门菌的检出率，具有广阔的运用前景。     

实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌结果分析

目的 了解双重实时荧光PCR快速同时检测从业人员沙门菌和志贺菌的效果.方法 采集从业人员肛拭子样本,用双重实时荧光PCR法检测沙门菌和志贺菌,检出的疑似阳性样本按国标法进行培养鉴定.结果 采用双重实时荧光PCR反应体系共检测从业人员39 974人次,荧光PCR检测出沙门菌阳性41份,阳性率1.22‰,培养法检测出31份,阳性率为0.78‰,沙门菌荧光PCR检测法的灵敏度为100％,特异性为99.95％.荧光PCR检测出志贺菌10份,阳性率为0.25‰,培养法检测出3份,阳性率为0.08‰,志贺菌荧光PCR法的灵敏度为100％,特异性为99.98％.从样品处理到检测结果仅需要时间2h～ld.结论 双重实时荧光PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于从业人员体检的快速诊断和肠道传染病的初筛,为肠道传染病的分子流行病学调查提供新的检测手段.     

改良分子信标-实时荧光PCR同时检测猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌

目的 建立猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,应用于食品和食物中毒病人标本的猪霍乱沙门菌检测以及沙门菌属C群的鉴别诊断.方法 根据GenBank公布的猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌的保守序列(CP000857.1),设计引物和改良分子信标探针,优化PCR程序和PCR成分,以11种细菌为对照,建立...     

沙门菌和志贺菌二联实时荧光定量PCR的临床检测应用研究

目的:进行沙门菌和志贺菌二联实时荧光PCR检测的研究,并探讨在CDC体检中临床检测的应用.方法:在沙门菌、志贺菌的fimY基因和缸ipaH基因保守区设计特异性引物和探针,对引物、探针、Mg2 浓度、Taq酶的用量、反应条件等进行优化,并与传统检测方法进行对比.结果:该方法从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右,对两种菌的检测灵敏度均达到100 cfu/ml,检测自2007年11月以来CDC临床肛拭子样本5896份,实验结果与权威检验机构的结果符合率达100%.结论:二联实时荧光定量PCR可同时定量的检测出沙门菌和志贺菌,灵敏度高,特异性强,检测周期短.适用于CDC体检等同时对沙门菌和志贺菌的快速临床检测.     

液相芯片技术在沙门菌抗原缺失血清型鉴定中的应用

目的探讨液相芯片技术在检测、鉴定抗原缺失的沙门菌中的应用。方法依据国标GB 4789.4-2016和盲样考核手册,对3份考核盲样进行增菌分离培养和生化鉴定,分别采用血清凝集和多重PCR液相芯片技术进行血清型分型,比较其优缺点。结果 3份考核样经分离、纯化,以血清凝集法和多重PCR液相芯片技术进行分型分析,鉴定结果一致,2份样品为阿贡纳沙门菌和婴儿沙门菌,1份样品为未检出。2017S-10(5)-1 H相中第二相未观察到凝集现象,2017S-10(5)-3第一相观察不到凝集现象,分别经3次、2次诱导后才获得鉴定结果,分别耗时3d、2d,平均成本为1 000元/样本;液相芯片技术分型耗时4h,平均成本为500元/样本。结论利用液相芯片技术能够快速、准确鉴定抗原缺失血清型沙门菌,可在有条件的机构推广。     

沙门菌invA基因荧光定量PCR检测

沙门菌是引起食源性感染的常见致病菌^[1],常规检测方法有分离培养、生化鉴定、血清学试验等.由于沙门菌有2 000多种血清型,因而监测工作多繁琐、费时、费力.实时荧光定量PCR检测技术是近年来的新方法,已经愈来愈多地用于病原体诊断^[2].研究表明,沙门菌侵袭基因invA高度保守,几乎存在于沙门菌所有血清型中,其编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白,决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力,与其致病性显著相关^[3].根据这一特点,为探讨快速、敏感、稳定的沙门菌检测方法,本研究应用沙门菌侵袭基因invA设计引物和探针序列,建立沙门菌荧光定量检测方法并研制沙门菌检测试剂盒.     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法检测沙门菌的比较

目的:比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法检测沙门菌的灵敏度与特异性。方法:采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR方法,同时对沙门菌等细菌进行检测。结果:实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达33 cfu/m l,且有很高的特异性,对金黄色葡萄球菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论:实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是2种方法中最为快速敏感的方法,适用于临床实验室的快速诊断。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测沙门菌的比较

沙门菌是一种常见的重要人兽共患病原菌，在自然界中分布广泛，它极易污染水源、食品及畜产品，引起人食物中毒、急性胃肠炎和动物腹泻等疾病。目前国内外对该菌的快速检测主要集中在免疫酶试验、免疫扩散法、乳胶凝集试验和免疫荧光法及酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链反应（PCR）技术等方法上。而实时荧光PCR（Real-timePCR）是近几年兴起的分子生物学检测技术，其检测灵敏性高，特异性好且操作简便，耗时少。     

荧光定量PCR方法在沙门菌鉴定中的应用

[目的 ]　用taqman技术建立沙门菌荧光定量聚合酶链反应 (PCR)检测方法 ,尝试快速、准确地鉴定沙门菌。　 [方法 ]　根据沙门菌GenBankAccessionNOU2 5 3 5 2基因序列 ,设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增的沙门菌基因片段克隆导入载体 ,构建的重组质粒经筛选、鉴定后 ,作为阳性模板 ,用于标准曲线的制定。利用荧光定量聚合酶链反应 (PCR)技术进行各类菌株的定性鉴定。　 [结果 ]　应用重组质粒制作的定量曲线 ,其循环阈值与模板浓度的对数值具有良好的线性关系 ,相关系数为 0 .999。检测各类菌株 ,其中沙门菌 41株、H抗原丢失的沙门菌 16株均阳性 ;非沙门菌 10 9株均阴性。　 [结论 ]　建立了鉴定沙门菌的荧光定量PCR方法 ,该方法简便、快速、准确 ,有很好的应用前景和研究价值     

实时荧光定量PCR方法在沙门菌鉴定及筛选中的应用

目的在沙门菌鉴定中运用taqman技术建立荧光定量聚合酶链反应(PCR)的方法,并考评该方法的特异性、灵敏度、抗干扰性及重复性。方法根据沙门菌GenBank Accession NO DQ644631基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针。建立实时荧光定量PCR反应体系,用沙门菌各种型别对该方法进行考评。结果实时荧光定量PCR技术在沙门菌鉴定中有良好的特异性、极高的灵敏度、较强的抗干扰性及重复性。结论在沙门菌的鉴定和筛选中实时荧光定量PCR方法准确、快速、简便,有很好的应用前景和研究价值。     

应用多重PCR检测食品中的沙门菌

目的 建立快速检测食品中沙门菌的多重PCR方法. 方法应用软件设计4对沙门菌群特异引物,优化多重PCR扩增条件与样品处理方法,分别对61株沙门菌、14株非沙门菌及模拟标本进行检测,观察方法的特异性、敏感性和可行性. 结果建立的多重PCR检测所有的沙门菌均能扩出清晰、特异的预期条带,而非沙门菌均未检出;每反应的灵敏度平均为100 cfu.对食品中人工污染的沙门菌的检测,最低检测量是10 cfu,检测时间为8～9 h,与培养法比较,阳性符合率100%;对市售的481份禽制品进行检测,阳性结果12份,而细菌培养法检测阳性结果为10份. 结论多重PCR检测沙门菌敏感、特异、省时、省力,适用于沙门菌快速检测.     

多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌

目的 建立改良分子信标，多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法，应用于食源性致病菌的快速诊断。方法 根据GenBank公布的沙门菌侵袭性基因invA和ssaR基因，分别设计一对引物和改良分子信标探针，用同色荧光标记，用于同体系检测沙门菌。志贺菌根据ipaH基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，加入沙门菌检测体系中，建立三重实时PCR一改良分子信标检测体系，应用于同时对沙门菌、志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果 改良分子信标一多重实时PCR反应体系DNA灵敏度为69～93fg/μl。菌液灵敏度为32～64CFU／ml或1～2CFu／PCR反应体系，无交叉反应。该反应体系同时检测134株沙门菌和67株志贺菌，均出现特异的荧光信号，两种细菌检测互不干扰。对细菌性食物中毒样本等共1100份同时进行沙门菌和志贺菌检测，569份沙门菌实时PCR阳性，其中551份沙门菌培养阳性；42份志贺菌实时PCR阳性，其中41份志贺菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需时间2h至1d。结论 改良分子信标-多重实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于沙门菌和志贺菌食物中毒的快速诊断，伤寒、痢疾等肠道传染病的初筛及预防医学门诊的健康人群体检，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

PCR快速检测沙门菌试剂盒的研制与应用

目的 在优化聚合酶链反应(PCR)检测沙门菌程序的基础上,研制沙门菌PCR检测试剂盒。方法 通过样品检测，确定试剂盒的组成及各种组分对保存期的影响，对PCR和ELISA2种快速检测试剂盒进行比较。结果 该试剂盒能检测出20Pg的沙门菌DNA；在含有Taq酶、未冻干、-20℃的条件下，试剂盒保存期为12个月；以国标法做参照，ELISA试剂盒的敏感性和特异性分别为100％，97.2％．PCR试剂盒的敏感性和特异性均为100％；ELISA和PCR试剂盒的符合率为97．2％；PCR试剂盒检测临床粪便样品150份，检测结果与国标法相符。结论 沙门菌PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速等优点，适用于沙门菌快速检测。     

免疫PCR检测沙门菌方法的建立及其应用

1992年Sano等人^〔1〕首次报告用免疫PCR方法检测微量的牛血清白蛋白。该方法将PCR技术的高敏感性与抗原抗体反应的特异性结合起来,具有极高的敏感性和特异性,更使PCR技术应用于对蛋白等非核酸类物质的检测。随后的报道大都用于检测HBsAg^〔2〕、TNF^〔3〕等可溶性蛋白。本文利用链亲和素和生物素之间的高度亲和力,采用生物素化羊抗鼠IgG作二抗,将单抗与DNA相连接,建立免疫PCR检测方法,用以检测颗粒性抗原细菌,并与ELISA方法进行了比较。     

12小时PCR技术快速检测沙门菌

[目的]本课题根据致痫性沙门菌的invA基因序列设计引物，进行PCR反应，扩增出389bP的特异性片断，从而检测出目标菌。[方法]将试验菌种BPw中非选择性增菌6h：45min沸水浴破细胞，释放染色体DNA制作模板：PC及扩增约3h(1：95℃ 5min预变性：2：95℃ 1．5min变性3：62℃ 1min退火：4：72℃ 45S延伸：5：72℃ 7min延长其中4至2步循环35次)。[结果]所得扩增产物经1．5％的琼脂糖凝放电泳约1h，紫外灯下可见扩增条带。[结论]通过调节Mg^2 浓度，引物浓度和模板量和纯化方法，优化反应条件，初步建立了一种12h内快速检测沙门菌的方法，灵敏度可达40-50cft/ml。