应用巢式聚合酶链反应和测序检测肺炎支原体23S rRNA中点突变

目的 建立快速检测肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,MP)耐药性的实验方法并应用于临床以了解MP耐药现状.方法 应用巢式PCR直接检测咽拭子标本MP-23S rRNA基因并对扩增产物进行电泳检测或DNA测序分析;通过MP培养及体外药物敏感性试验测定临床分离株的红霉素最小抑菌浓度,以验证23S rRNA基因检测结果的可靠性.结果 200例临床标本经MP-IgM抗体、咽拭子MP种特异性16S rRNA基因巢式PCR扩增和MP分离培养测定证实为MP 64例.应用巢式PCR技术扩增MP-23S rRNA基因,并对扩增产物进行测序,将基因序列与基因库中MP标准株基因序列进行比较,与标准株序列相同的共计26例,其余38例存在23S rRNA点突变:35例在2063位点发生了A到G的点突变,1例在2063位点有A到C的点突变,2例在2064位点有A到G的点突变;耐药率为59.4%.MP耐药基因检测方法灵敏度达102 ccu/ml,MP培养及药物敏感性试验证实23S rRNA基因检测结果可靠.结论 建立的MP耐药基因检测方法能直接检测临床标本中的MP耐药基因.59%的受检标本23S rRNA基因发生点突变.     

肺炎支原体肺炎患儿肺炎支原体耐药性与DNA载量和基因型的关系研究

目的探讨肺炎支原体(MP)肺炎患儿MP耐药情况及其与DNA载量和基因型的关系。方法选取2012年1月至2016年12月诊断为MP肺炎的230例住院患儿为研究对象,采集所有患儿咽拭子标本,采用快速培养基培养药敏法测定9种常用抗菌药物对MP临床分离株的药物敏感性;荧光实时定量PCR检测患儿咽拭子MP-DNA载量;PCR测序检测MP 23S r RNA V区2063位基因型。结果 230例MP患儿中,86例2063位基因型为A(37.4%),134例为G(58.3%),8例为C(3.5%),2例为T(0.9%)。突变基因型(G+C+T)MP-DNA载量高于野生基因型(A)菌株(P0.05);红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素耐药组MP-DNA载量高于非耐药组(P0.05)。MP对大环内酯类抗生素耐药率较高,60%以上产生大环内酯类耐药的病例均检测出A2063G突变,喹诺酮类药物少见MP耐药(低于2%)。结论 23S r RNA V区2063位点发生基因突变可能导致MP对大环内酯类药物耐药和DNA载量的变化,可作为MP治疗用药的选择依据。     

氯霉素、利福平对肺炎支原体的抗菌活性分析

目的探讨氯霉素、利福平对肺炎支原体(MP)的抗菌活性。方法对370例咽拭子标本进行MP分离培养,应用套式聚合酶链式反应(PCR)扩增MP种特异16SrRNA基因对临床分离株进行分子鉴定;通过药物敏感试验测定MP分离株的红霉素的最小抑菌质量浓度(MIC),应用套式扩增红霉素作用靶位23SrRNA基因,以鉴别敏感株和耐药株;应用药物敏感试验测定MP分离株的氯霉素、利福平的MIC。结果临床标本370例中分离MP50株。其中红霉素敏感株4株,耐药株46株。46株耐药株的红霉素作用靶位23SrRNA基因发生点突变,4株敏感株无点突变。所有MP分离株对氯霉素敏感,对利福平耐药。结论利福平对MP无效,氯霉素对MP红霉素敏感株及耐药株均有效。     

肺炎支原体感染性大叶性肺炎儿童耐药突变位点测定及临床分析

目的　了解儿童肺炎支原体（MP）感染性大叶性肺炎肺泡灌洗液（BALF）中23S rRNA V区耐药突变位点的检出情况,比较位点突变组及未突变组患儿的临床资料。方法　回顾性分析2018年1月至2019年1月石河子大学医学院第一附属医院儿科69例确诊为大叶性肺炎且行纤维支气管镜肺泡灌洗术患儿的临床资料。采用实时荧光定量PCR（RTQ-PCP）法对上述标本行MP-DNA及23 SrRNA V区突变位点（A2063G、A2064G、A2063C及A2063T）检测。根据结果将MP阳性患儿分为位点突变组及未突变组,比较两组患儿的临床资料。结果　48例MP感染性大叶性肺炎患儿中,共37例（77.1%）检测到位点突变,突变率由高到低依次为A2063G、A2064G、A2063C、A2063T;突变组患儿血清C反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）及乳酸脱氢酶（LDH）水平较未突变组高,合并肺外并发症比例增多,发热持续时间、住院时间、大环内酯类抗生素应用天数及退热天数延长,且应用甲泼尼龙、静脉注射免疫球蛋白（IVIG）比例显著增高,以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论　该地区MP感染性大叶性肺炎患儿23S rRNA V区耐药突变位点检出率高,仍以A2063G、A2064G为主,且同一患儿体内存在多种耐药突变位点;对于血清CRP、PCT及LDH水平显著增高,肺外合并症多、平均发热及住院时间长的大叶性肺炎患儿应考虑MP耐药可能。     

儿童感染幽门螺杆菌对克拉霉素耐药情况及耐药机制初步研究

目的了解儿童幽门螺杆菌(Helicobacter pylor,Hp)对克拉霉素的耐药情况,探讨Hp对克拉霉素耐药性与23S rRNA基因突变的关系。方法。108例胃黏膜标本均取自2002年10月-2004年1月在浙江大学医学院附属儿童医院进行胃镜检查的患儿,经分离培养鉴定为Hp菌株后,分别采用E-test法和琼脂稀释法检测克拉霉素的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),确定Hp菌株对克拉霉素的耐药性。提取所有108株Hp基因组DNA进行PCR扩增,用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)检测克拉霉素耐药菌株的点突变。结果Hp菌株对克拉霉素耐药率为14．8％(16／108)。16株耐药菌株23S rRNA V功能区PCR扩增片段RFLP分析,13株被BsaⅠ酶切,提示2144位点存在A→G点突变,3株被BbsⅠ酶切,提示2143位点存在A→G点突变,所有敏感菌株均不能被BsaⅠ和BbsⅠ酶切,提示无23S rRNA基因相应位点的点突变。同时本研究中并未发现突变形式与耐药程度的相关性。结论儿童Hp感染对克拉霉素耐药率较高;23S rRNA基因点突变是Hp对克拉霉素耐药的重要因素。耐药菌株存在A2144G和A2143G突变,以前者为主。     

肺炎支原体红霉素耐药机制研究

目的了解肺炎支原体(MP)对红霉素耐药情况及耐药机制。方法对60例临床证实为MP感染患儿鼻咽分泌物或咽拭子标本进行分离培养,药物敏感试验筛选耐药株,进行耐药基因检测。结果60例标本中,分离阳性株5例,耐药株4例,占80%。敏感株和标准株的23SrRNA基因序列与基因库的MP基因序列相同,4例耐药株的23SrRNA基因发生点突变,两株突变位点在2063,G替代了A,另两株突变位点在2064,G替代了A。5株分离株erm编码的甲基化酶基因均为阴性。结论MP对红霉素有耐药株产生,4株MP红霉素耐药株的耐药分子基础是23SrRNA基因发生点突变,未发现erm编码的甲基化酶基因。     

新生儿百日咳致病株抗菌药物敏感性和抗原基因型研究

目的 探讨新生儿百日咳抗菌药物的可选方案,阐明致病株的抗原基因型。方法 以2013年5月至2018年7月分离到的32株新生儿百日咳鲍特菌为研究对象。采用E-test法检测红霉素、磺胺甲基异噁唑-甲氧苄啶（SMZ）、氨苄西林等共18种抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）;扩增分离株23S rRNA基因并测序,检测红霉素耐药基因的突变位点,分析菌株抗原相关的7个基因型（ptxA、ptxC、ptxP、prn、fim2、fim3和tcfA）。结果 25株（25/32,78%）百日咳鲍特菌对红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素的MIC值均>256 mg/L,且23S rRNA基因均有红霉素耐药A2047G突变。所有菌株对SMZ的MIC值均≤ 0.064 mg/L。氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林‐克拉维酸和头孢曲松的MIC值波动在0.032~1 mg/L。大环内酯类耐药菌株的抗原基因型均为ptxA1/ptxC1/ptxP1/prn1/fim2-1/fim3-1/tcfA2。结论 新生儿百日咳鲍特菌对大环内酯类抗菌药物耐药常见,体外试验支持超说明书使用磺胺类抗菌药物是治疗大环内酯类耐药的新生儿百日咳的可靠方案。耐药菌流行更加强调了免疫预防的重要性。     

肺炎链球菌β-内酰胺类抗生素最小抑菌质量浓度与青霉素结合蛋白1A和2B变异的关系

目的探讨肺炎链球菌（Sp）β-内酰胺类抗生素最小抑菌质量浓度（MIC）与青霉素结合蛋白（PBP）1A和2B变异的关系。方法对55株Sp用E-test法进行7种β-内酰胺类抗生素进行药敏试验,并提取每株Sp的DNA,分别对其青霉素结合蛋白基因（pbp）1a和pbp2b中编码青霉素结合区域（PBD）进行套式PCR扩增和直接测序,并用Clustalx软件进行序列比对,分析PBP1A和PBP2BPBD保守序列的氨基酸置换。结果青霉素敏感株4株中发现PBP2B保守序列SSN后苏氨酸（Thr）445→丙氨酸（Ala）,Thr451→Ala和谷氨酸（Glu）481→甘氨酸（Gly）置换,其余6株PSSP未发现PBP1A和PBP2B保守序列氨基酸置换。4株青霉素中介株（PISP）（MIC0.19～0.38mg/L）PBP2BThr445→Ala,Thr451→Ala和Glu481→Gly置换,其中1株发现PBP2B保守序列SVVK后第431-432位点处脯氨酸（Pro）的插入,余3株存在谷氨酰胺（Gln）432→亮氨酸（Leu）置换。另16株PISP（MIC0.5～1.0mg/L）在此基础上出现PBP1ASRN后Pro432→Thr,STMK中Thr371→丝氨酸（Ser）/Ala和KTG附近的短镶嵌序列Thr574→天冬氨酸（ASn）Ser575→Thr,Gln576→Gly,苯丙氨酸（Phe）577→酪氨酸（Tyr）置换,且后二种变异存在于所有青霉素和头孢类中介和耐药株中。20/25株青霉素耐药株存在PBP2B保守序列KTG附近Ala624→Gly,包含Ala624→GlySp组青霉素、头孢呋新、阿莫西林等抗生素平均MIC值明显高于不包含这一置换的Sp组。在青霉素MIC≥0.5mg/L的菌株中均同时存在PBP1A和PBP2B的变异。结论β-内酰胺类抗生素对肺炎链球菌临床分离株MIC值与PBP1A和PBP2B编码青霉素结合活性区域的保守序列中或附近的氨基酸置换有关。     

肺炎支原体耐药机制、检测方法及控制策略

肺炎支原体(MP)是引起肺炎和肺外并发症的一种常见病原体.儿童MP感染的主要治疗药物是大环内酯类抗生素.近年来临床上分离到耐药MP株.现就MP的耐药机制、耐药检测方法和如何对耐药MP进行控制与治疗进行介绍.实用儿科临床杂志,2009,24(10):721-723     

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目的研究北京儿童医院脓疱疮患儿临床分离A组β溶血性链球菌(GAS)及其对抗菌药物的敏感性情况。方法收集北京儿童医院2003—2008年收治的1735例脓疱疮儿童皮损部位分离出的52株GAS菌株,采用琼脂稀释法测定9种抗菌药物的最低抑菌质量浓度(MIC)值;用聚合酶链反应方法对上述菌株进行大环内酯类抗生素耐药基因ermB、ermA和mefA检测以及emm分型情况。结果分离株对四环素及大环内酯类抗生素耐药率均为100%,MIC>256mg/L;对青霉素、头孢拉啶及氧氟沙星的敏感率高达100%。大环内酯类抗生素耐药基因ermB、ermA和mefA和阳性率分别为92.30%、7.70%和0;分离株的emm分型最常见的为emm12.0(53.85%),emm1.0(36.54%)。结论北京儿童医院收治的脓疱疮儿童GAS感染流行菌株对大环内酯类抗生素耐药率很高,主要耐药机制为ermB编码的23SrRNA甲基化酶导致靶位改变,在北京地区青霉素类和头孢菌素类抗生素仍是治疗GAS感染首选药物。     

核糖体DNA聚合酶链反应诊断新生儿败血症

目的比较１６ＳｒＤＮＡ高度保守区引物聚合酶链反应（ＰＣＲ）与血培养及非特异性诊断指标对新生儿败血症的诊断价值。方法对１３１例拟诊为败血症的新生儿血标本进行细菌ＤＮＡ检测。结果１３１例中，ＰＣＲ检测阳性５６例，阳性率为４３％，明显高于血培养的阳性率（血培养阳性２３例，阳性率１８％）。１３１例拟诊败血症中，发现２３例确诊败血症及３１例临床败血症，对这５４例败血症（血培养阳性２３例＋临床败血症３１例）作ＰＣＲ检查，结果阳性４８例，阴性６例；对１３１例中的７７例“非败血症”病例，ＰＣＲ检测阴性６９例，阳性８例。对血培养阳性的２３例进行ＰＣＲ，结果阳性２２例。以血培养作为确诊标准，ＰＣＲ检测的敏感性为９６％，并不受抗生素治疗的影响。３０例阴性对照组ＤＮＡ的ＰＣＲ分析均为阴性。结论在严格控制污染的条件下，细菌共同引物ＰＣＲ技术能为新生儿败血症提供可靠的病原菌诊断依据     

亚低温治疗对缺氧缺血性脑病新生儿血清神经胶质酸性蛋白和泛素羧基末端水解酶L1的影响

目的 研究缺氧缺血性脑病(HIE)新生儿亚低温治疗后血清神经胶质酸性蛋白(GFAP)和泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)的表达水平并探讨其价值.方法 选取64例HIE新生儿,其中33例轻度患儿采取一般治疗,31例中、重度患儿给予一般治疗和亚低温治疗,采用ELISA检测患儿治疗前和治疗后(6~12 h)血清GFAP和UCH-L1的水平.结果 治疗前中、重度HIE组患儿血IL-6、IL-8、GFAP以及UCH-L1水平高于轻度HIE组(P<0.01).相关性分析显示血GFAP水平与IL-6、IL-8呈正相关(分别r=0.54、0.63,P<0.05),与Apgar评分呈负相关(r=-0.47,P<0.05).治疗后,中、重度组患儿血IL-6、IL-8、UCH-L1水平低于治疗前(P<0.05),但GFAP水平高于治疗前(P<0.01).生后15~18个月后的随访发现神经发育不良的患儿血GFAP水平高于预后良好的患儿(P<0.01).ROC曲线显示GFAP和UCH-L1的诊断曲线下面积为0.714和0.703;当GFAP的诊断阈值为0.07 ng/mL时,其诊断的敏感性为77%,特异性为78%.结论 亚低温治疗可致HIE患儿血清UCH-L1水平降低,GFAP水平升高;血清GFAP、UCH-L1水平可反映HIE患儿治疗前后脑细胞的变化,有望成为新的HIE的血清学辅助诊断指标.     

细菌16S-23S rRNA 基因特异DNA图谱的分子诊断

目的　应用聚合酶链反应 (PCR)、限制性内切酶片段长度多态性分析 (RFLP)及测序技术 ,建立检测不同属种细菌的 16S 2 3SrRNA基因区间的特异图谱。方法　对临床上常见的细菌进行PCR扩增、RFLP、分子克隆及序列分析 ,同时对临床标本进行培养与PCR RFLP比较。结果　 2 7株不同细菌行PCR扩增后 ,得到不同DNA图谱。其中 15种细菌经PCR扩增即可区分 ,另 10种经HinfI或AluI酶切后才能区分。肺炎克雷伯菌与坚韧肠球菌的差异只在第 779位碱基上不同 ,XmaIII酶能区别。 42例临床诊断为新生儿败血症者 ,15例培养阳性 ,阳性率 3 5 7% ;而PCR阳性者则为 2 7例 ,阳性率为 64 2 9% ,明显高于血培养 (P <0 0 1)。 6例脑脊液标本中 ,1例PCR及培养均阳性 (表皮葡萄球菌 ) ;2例培养阴性标本 ,其PCR也阳性 ;经图谱分析为葡萄球菌 ,1例培养为新型隐球菌的脑脊液标本PCR检测为阴性。另 2例PCR及培养均阴性。结论　建立了PCR RFLP技术快速检测细菌 16S 2 3SrRNA基因区间的方法 ,具有特异、敏感、快速、准确的特点 ,为临床细菌感染的病原诊断提供新的科学依据。     

Isolation of a Kawasaki disease-associated bacterial sequence from peripheral blood leukocytes

BACKGROUND: The clinical and epidemiologic features of Kawasaki disease (KD) suggest an infectious etiology, but the agent(s) remains unknown. We aimed to isolate the causative bacterial gene from peripheral blood leukocytes of patients with acute KD. METHODS: Nested polymerase chain reaction (PCR) assay was used to amplify the bacterial 16S ribosomal RNA gene (rDNA). The amplified DNA were cloned into a plasmid vector and sequenced. Phylogenetic analysis was performed with clustal W program and the neighbour-joining method. RESULTS: First, the PCR reagents were examined by the PCR assay using conservative primers and we found more than 10 16S rDNA sequences contaminating the reagents. We then examined five KD patients using the PCR assay, excluding the contaminated sequences, and obtained five 16S rDNA sequences as possible KD-associated sequences. The primers specific to each 16S rDNA sequence were synthesized and used for specific PCR assays. Only the PCR assay specific to the 16S rDNA sequence termed 16S71-33 did not show any false positives with the control DNA from non-KD patients. The 16S71-33 sequence was positive in three of 20 patients with acute KD before gamma-globulin therapy, but it became negative after therapy. The phylogenetic analysis showed a new species of the genus Corynebacterium as the origin of the 16S71-33 sequence. CONCLUSIONS: These data show that an infectious KD agent is traced in peripheral leukocytes and that a new Corynebacterium species may be responsible for KD in some cases. The true frequency and the role of the new Corynebacterium in KD would be clarified by measuring specific antibodies to it.     

实时荧光定量聚合酶链反应快速诊断22q11微缺失

目的 探讨实时荧光定量PCR技术用于诊断22q11微缺失的可行性。方法 采用实时荧光定量PCR技术，对140例先天性心脏畸形（CHI）和20例健康儿童外周血样品22号染色体上基因UFD1L和管家基因S100β进行实时检测，并计算两者比值。其结果与荧光原位杂交技术（FISH）或短串联重复序列（STRP）标记分析结果进行比对。结果 FISH检测9例有22q11微缺失患儿，其中8例与STRP标记结果一致，而有1例STRP标记分析未发现22q11缺失，UFD1L／S100β比值为0.449～0．557；余130例CHD患儿和20例健康儿童的UFD1L／S100β比值为0．709～1.149。结论 实时荧光定量PCR技术可快速可靠地诊断22q11微缺失。