60Co γ射线致死剂量全身照射对小鼠脾脏和肠系膜淋巴结T细胞亚群表面免疫分子表达水平的影响

目的 探讨小鼠接受60Co γ射线致死剂量全身照射(TBI)后,脾脏和肠系膜淋巴结T细胞活化分子和黏附分子表达水平的变化.方法 于2012年7月至10月,选择12只无特定病原体(SPF)级雄性BALB/c小鼠为研究对象.研究对象纳人标准:周龄为10～12周龄,体重为20～25 g.按照完全随机法将其分为TBI组(接受致死剂量TBI)和对照组(未照射),每组6只.TBI组予60C0 γ放射源一次性照射(剂量率为0.66 Gy/min,总剂量为7.5 Gy).于照射后第7天,脊椎离断处死两组小鼠,无菌条件下,取其脾脏、肠系膜淋巴结,研磨后采用密度梯度离心法收集单个核细胞.采用流式细胞术检测两组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中,CD4+T,CD8+T,辅助性T细胞(Th)1及细胞毒性T细胞(Tc)1细胞表面CD44和CD62L的表达水平.并采用统计学方法比较两组小鼠上述免疫分子表达水平.结果 照射后第7天,TBI组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结CD44+ CD4+T细胞比例为(88.1±1.1)％和(76.7±1.8)％,均低于对照组的(95.0±1.1)％和(92.8±1.4)％,且差异有统计学意义(t=-11.01、-17.82,P＜0.05);而CD44+ CD8+T细胞的比例分别为(99.0±0.3)％和(92.5±1.7)％,均高于对照组的(88.7±0.8)％和(83.4±1.6)％,差异亦有统计学意义(t=31.15、9.54,P＜0.05).TBI组小鼠肠系膜淋巴结CD44 Th1比例为(4.1±0.4)％,高于对照组的(1.0±0.2)％,且差异有统计学意义(t=14.78,P＜0.05);而两组小鼠脾脏CD44+Th1比例比较,差异无统计学意义(t=-0.93,P＞0.05).TBI组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结CD44+ Tc1比例分别为(65.5±4.6)％和(26.6±2.8)％,较对照组的(41.8±1.5)％和(18.7±1.3)％增高,且差异有统计学意义(t=9.97、6.51,P＜0.05).TBI组小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结中的CD4+T和CD8+T细胞表面CD62L的表达水平均低于对照组,脾脏中表达水平分别为(0.3±0.0)％比(66.7±4.7)％,(1.1±0.2)％比(64.4±5.1)％;肠系膜淋巴结中为(2.6±0.3)％比(89.7±2.8)％,(9.1±0.5)％比(79.4±3.3)％,两组上述4项指标比较,差异均有统计学意义(t=-24.52、-21.53、-53.75、-36.56,P＜0.05).结论 小鼠接受TBI后,脾脏和肠系膜淋巴结的T细胞被激活,表现为活化分子CD44在效应T细胞表达升高,而黏附分子CD62L表达下调,T细胞表型改变.通过检测T细胞表面CD44、CD62L等活化及黏附分子的表达水平,可在一定程度上反映体内T细胞活化情况,为评估TBI预处理方案应用后,机体T细胞功能状态的改变提供依据.     

再生障碍性贫血小鼠模型中免疫活化T细胞动力学研究北大核心CSCD

目的探索再生障碍性贫血(AA)小鼠模型中供者来源T细胞不同时间点动力学变化。方法构建AA小鼠模型, 分别于不同时间点采用流式细胞术测定模型小鼠脾脏与骨髓内供者T细胞比例、活化分子表达、细胞周期及功能亚群, 评估不同时期T细胞功能状态。结果①半致死剂量照射联合主要组织相容性抗原(MHC)半相合的淋巴结细胞输注成功构建T细胞免疫介导的AA小鼠模型。②AA小鼠脾脏中供者T细胞从移植第3天后开始明显浸润, 并逐渐出现CD4^(+)/CD8^(+)比例倒置, 第5天开始进入骨髓, 以CD8^(+)细胞浸润为主。③CD69在供者CD4^(+)细胞中表达高峰晚于CD8^(+)细胞, CD25在CD4^(+)细胞与CD8^(+)细胞中表达水平的变化趋势相同, 但在CD8^(+)细胞中的表达高于CD4^(+)细胞。④脾脏内供者CD4^(+)细胞S/G2/M期比例在移植后第3天即达高峰, 约12%, 而CD8^(+)细胞中S/G2/M期比例在移植后第5天达高峰, 约20%, 且两者在进入骨髓后S/G2/M期比例均再次升高, 但移植第3天后其比例在脾脏与骨髓CD8^(+)细胞中持续高于CD4^(+)细胞。⑤脾脏内免疫活化的T细胞经历短暂的中枢记忆T细胞(TCM)阶段后迅速分化为效应记忆T细胞(TEM), 进入骨髓后部分TEM分化为效应细胞进一步发挥效应功能。结论 AA小鼠模型中供者T细胞进入异体后迅速活化, 5天内达增殖高峰, 并完成向TEM细胞的分化, 5天后开始进入骨髓进一步增殖损伤造血。     

脐带间充质干细胞对CD34+细胞在小鼠体内归巢的影响及其机制研究

目的 探讨脐带来源间充质干细胞(MSC)对脐血来源CD34+细胞在NOD/SCID小鼠体内归巢的影响及其可能的机制.方法 将CD34+细胞与MSC细胞共移植入经放射线照射后的NOD/SCID小鼠,采用流式细胞术和RT-PCR检测移植后20 h NOD/SCID小鼠骨髓及脾脏中人CD34+细胞,计算其相应的骨髓和脾脏的归巢效率.将脐血CD34+细胞与脐带MSC体外共培养,检测MSC细胞对CD34+细胞趋化功能的影响;并于培养4、7 d检测培养后CD34+细胞表面CD49e、CD31、CD62L、CD11a等归巢相关黏附分子表达情况.结果 ①移植后20 h采用流式细胞术成功在小鼠骨髓和脾脏中检测到人CD45+细胞.共移植组CD34+细胞骨髓归巢率[(7.2±1.1)%]高于单移植组[(5.4±0.9)%](P<0.05).②RT-PCR结果 显示共移植组小鼠骨髓细胞和脾脏细胞,单移植组小鼠脾脏细胞扩增得到人GAPDH基因片段,而单移植组小鼠骨髓细胞未见明显扩增条带.③MSC存在时,CD34+细胞的体外迁移能力为(35.7±5.8)%,显著高于CD34+细胞自发迁移率[(3.5±0.6)%,P<0.05].④CD34+细胞与MSC体外共培养后细胞表面CD49e、CD31和CD62L黏附分子的表达水平高于CD34+细胞单独培养组.结论 MSC细胞与CD34+细胞共移植有利于CD34+细胞向骨髓、脾脏等造血器官归巢,这可能与MSC促进CD34+细胞迁移以及维持CD34+细胞表面归巢相关黏附分子的表达相关.     

线粒体解偶联蛋白1基因缺陷小鼠淋巴细胞的频率及活性变化

目的探讨解偶联蛋白1(UCP1)基因缺陷小鼠体内淋巴细胞的频率及其功能变化。方法利用流式细胞术检测UCP1-/-小鼠和对照组小鼠脾脏、外周血、胸腺或骨髓CD4~+T细胞、CD8~+T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和B淋巴细胞的频率;并利用胞内染色法,检测CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞的频率以及CD4~+和CD8~+产生干扰素-γ(IFN-γ)的活性。结果生理状态下UCP1-/-小鼠和对照小鼠相比,胸腺T细胞、NK细胞及骨髓B细胞的频率无显著差异; UCP1~(-/-)小鼠脾脏总CD8~+T细胞频率、活化性CD8~+T细胞(CD8~+NKG2D~+、CD8~+CD44~+CD62L-)和效应性CD8~+T细胞(CD8~+CD44~+KLRG1~+)频率下降,且IFN-γ分泌减少;脾脏和外周血CD4~+T细胞的频率及其活性,NK细胞和B细胞的频率均无显著变化。结论UCP1缺陷对淋巴细胞的发育无影响,但下调CD8~+T细胞的活性。     

LY294002对小鼠体内调节性T细胞的影响

背景:研究已证实,磷酸肌醇3激酶特异性阻滞剂LY294002在体外具有剂量依赖性抑制细胞活性的作用,可以用于诱导肿瘤细胞凋亡,但LY294002对正常免疫系统的影响尚不清楚.目的:观察抗肿瘤药物LY294002对C57BU6小鼠体内调节性T细胞的影响.设计、时间及地点:以调节性T细胞比例为观察对象,分组对比实验,于2008-08/12在广州南方医科大学珠江医院移植免疫研究所完成.材料:14只8周龄SPF级C57BL/6小鼠随机分成实验组与对照组,每组7只.LY294002购自广州英韦创律公司.方法:实验组腹腔注射LY294002溶液200 μL(0.1 mg),对照组给予等体积PBS.1 0 h后后眼眶静脉从采血,并分离脾脏、胸腺,制备单细胞悬液,流式细胞术检测小鼠外周血、脾细胞和胸腺细胞中的CD4+CD25high T细胞.主要观察指标:小鼠外周血、脾细胞和胸腺细胞中CD4+CD25high T细胞的比例.结果:实验组小鼠外周血、脾脏、胸腺中CD4+CD25high T细胞比例分别为(0.787±0.036)%,(0.921±0.063)%,(1.230±0.131)%,对照组小鼠外周血、脾脏、胸腺中CD4+CD25high T细胞比例分别为(0.640±0.030)%,(0.639±0.046)%,(0.857±0.077)%.实验组和对照组比较差异有显著性意义(P＜0.01,P＜0.05).结论:腹腔注射LY294002可提升小鼠体内调节性T细胞的比例,提示其有可能会抑制机体免疫反应,从而不利于治疗.     

痕量小鼠骨髓造血干细胞移植体系的建立

目的:建立痕量小鼠骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)移植体系。方法:利用ESLAM(CD45~+EPCR~+CD150~+CD48-)组合流式分选成体GFP/CD45.2小鼠骨髓细胞与保护细胞(CD45.2小鼠),共同移植给致死剂量照射的受体小鼠(CD45.2小鼠),分析移植后不同时间点,受体小鼠外周血嵌合以及其重建效率和谱系分化情况,随后处死受体小鼠,获取骨髓、胸腺、脾脏和外周血等组织的细胞,检测各组织嵌合情况。结果:移植后受体小鼠外周血结果显示第4周之后重建效率为100%,GFP~+细胞在各系细胞(髓系、红系、B细胞、T细胞、巨核)中不同时间点的比例不同,且各系重建水平的变化趋势不同;6个月之后各组织(外周血、骨髓、脾脏、胸腺)嵌合情况显示外周血红系和巨核细胞中有较高比例GFP~+细胞,且在髓系和淋系细胞中无GFP~+细胞,而骨髓的髓系细胞含也有较高比例GFP~+细胞,脾脏中的B细胞也有较高比例的GFP~+细胞,胸腺中的T细胞也含有较高比例GFP~+细胞。结论:ESLAM组合能够较高效率的富集具有长期重建能力的HSCs;这群细胞移植后6个月外周血结果提示可能具有红系和巨核分化倾向。     

异基因骨髓移植小鼠供体骨髓细胞在受体内的分布及淋巴细胞供受体来源比例分析

目的观察小鼠异基因骨髓移植(alloBMT)后供体骨髓细胞在受体内的分布以及嵌合体内T、B淋巴细胞增殖分化规律。方法以绿色荧光蛋白(GFP)转基因C57BL/6J(H2b)小鼠为供体,以137Cs5.5Gy×2照射的BALB/c(H2d)小鼠为受体,分别于移植后3天(+3天)、+7天、+21天、+35天和+70天取外周血、骨髓、胸腺、脾脏、肠集合淋巴结及肝脏,用流式细胞仪和荧光显微镜观察供体来源的骨髓细胞分布。用藻红蛋白标记的抗CD4、抗CD8、抗B220抗体检测+21天小鼠体内骨髓、外周血及其他免疫器官中T、B淋巴细胞的构成比例。结果①+3天、+7天供体骨髓细胞在受体脾脏中分布最多,分别为(1.06±0.02)%、(76.60±1.80)%;骨髓中分别为(0.37±0.06)%、(39.70±5.38)%。②+21天受体骨髓、脾脏、淋巴结、胸腺及外周血中供体细胞达60%～90%。③+3天受体肠集合淋巴结中供体骨髓细胞达(0.36±0.04)%,与受体骨髓中供体骨髓细胞的比例相当。结论①alloBMT后早期供体骨髓细胞可分布到受体的骨髓、脾脏、肠集合淋巴结中,脾脏中最多。②+21天受体内骨髓及其他免疫器官以供体细胞为主。③受体肠道集合淋巴结也是移植后供体骨髓细胞的早期寄居点和B淋巴细胞增殖后的迁移部位。     

泛T淋巴细胞结合照射诱导的再生障碍性贫血小鼠模型的优化

目的:建立适用于研究T淋巴细胞功能的获得性再生障碍性贫血(acquired aplastic anemia,AA)动物模型以及应用于再生障碍性贫血发病机制及治疗研究的动物模型。方法:对X射线联合淋巴细胞注射诱导的获得性再生障碍性贫血小鼠模型进行优化。AA组:富集C57BL/6J小鼠的脾脏泛T细胞,按细胞数5×10⁶/只经尾静脉注射至分别经3、4和5 Gy X射线照射的CB6F1小鼠体内;单纯照射组(total body irradiation,TBI):经尾静脉注射与AA组相同体积的PBS至分别经3、4和5 Gy X射线照射的CB6F1小鼠体内;对照组:经尾静脉注射与AA组相同体积的PBS至CB6F1小鼠体内;检测外周血血常规,计数骨髓有核细胞数,骨髓病理切片检测骨髓造血,流式细胞术检测骨髓T细胞分布比例、骨髓细胞凋亡和脾脏T细胞的分化程度。结果:相较于4、5 Gy照射的AA组,3 Gy照射的AA组生存期明显延长;经3、4、5 Gy X射线照射联合泛T淋巴细胞注射均可成功诱导受体鼠外周血红细胞、白细胞、血小板数严重减少,骨髓有核细胞严重减少,骨髓造血衰竭,骨髓中T淋巴细胞占比明显增加,CD4⁺T和CD8⁺T细胞均增加但以CD8⁺T细胞为主,并促进T细胞从初始T细胞向效应记忆T细胞分化。结论:3、4和5 Gy X射线的照射联合5×10⁶泛T细胞注射均可通过引起T淋巴细胞功能亢进,成功构建AA动物模型;较4、5 Gy照射剂量,3 Gy照射组生存期明显延长,外周血血象与AA临床患者表现更接近。     

多发性骨髓瘤原代细胞异种移植小鼠模型的建立

目的 利用人多发性骨髓瘤(MM)原代细胞在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中建立人MM异种移植模型.方法 将2例MM终末期患者骨髓或外周血单个核细胞(MNC)悬液通过尾静脉分别输注给3只NOD/SCID小鼠.每周称量体重,移植2周后以流式细胞术(FCM)检测小鼠外周血中CD45+细胞百分比.当小鼠出现苍白、竖毛、精神萎靡或体重下降20％时,取小鼠脾脏及肝脏行组织病理学检查,FCM检测外周血、骨髓、脾脏和淋巴结细胞悬液中CD45+ CD38+细胞的百分比.结果 来源于病例1和病例2的MNC移植小鼠的平均体重分别自输注MM原代细胞第7周和第5周后开始下降;以对照组小鼠的单个核细胞做阴性设门,分别于移植(26±4)d和(16±4)d后,在病例1细胞来源组和病例2细胞来源组的小鼠外周血中检测到人CD45+ CD38+细胞,且其比例随时间延长而逐渐增高,实验终点时分别达(16.2±3.0)％和(31.3±3.5)％;组织病理大体形态观察发现小鼠脾脏、肝脏及淋巴结均不同程度增大,镜下可见典型的恶性浆细胞浸润;FCM检查骨髓、淋巴结和脾脏细胞表面标志,均发现一群人源CD45+ CD38+细胞.结论 成功建立了人MM原代细胞异种移植的免疫缺陷小鼠模型.     

CD19嵌合抗原受体T细胞制备条件优化及其体内外杀伤作用研究北大核心CSCD

目的优化小鼠CD3^(+)T细胞体外刺激活化体系及最佳感染时间,构建小鼠CD19嵌合抗原受体T细胞(mCD19CAR-T),并验证其在体内外的杀伤效果.方法磁珠分选纯化小鼠的脾脏CD3^(+)T细胞,在可溶性抗CD3/CD28抗体、佛波酯+离子霉素、包被抗CD3/CD28抗体3种不同条件下刺激培养,分别于8、24、48和72h流式细胞术检测细胞活性情况;用包含小鼠CD19抗体的scFv质粒转染Plat-E细胞,包装逆转录病毒后感染活化的CD3^(+)T细胞,制备鼠特异性的CD19嵌合抗原受体T细胞(mCD19 CAR-T).mCD19 CAR-T细胞在体外与B淋巴瘤细胞株A20细胞共培养,利用流式细胞术检测其对A20细胞的靶向杀伤效果;建立淋巴瘤小鼠模型,体内输注mCD19CAR-T细胞,检测CAR-T细胞的体内杀伤和分布情况.结果包被抗CD3/CD28抗体的刺激活化效果最佳,且在刺激后24~48h具有较好的细胞活性;抗mCD19的逆转录病毒感染CD3^(+)T细胞效率[(32.27±7.56)%]稳定,制备的mCD19 CAR-T细胞可特异性杀伤A20肿瘤细胞,48 h时A20细胞凋亡率为24.3%;体内检测发现输注mCD19CAR-T细胞第6天即可检测到脾脏中CD19+细胞比例[(1.83±0.58)%]显著降低,到建模后第12天骨髓和脾脏中CD19+细胞清除更为显著,与A20细胞组相比差异具有统计学意义[脾脏:(0.36±0.04)%对(47.00±13.46)%,P<0.001;骨髓:(1.82±0.29)%对(37.30±1.44)%,P<0.0001].且mCD19 CAR-T细胞在外周血、脾脏和骨髓中均有分布,GFP+CD3^(+)CAR-T细胞比例分别为(2.90±1.12)%、(4.96±0.80)%、(13.55±1.56)%,以骨髓中占比最高.结论获得优化的CD3^(+)T细胞活化刺激体系和最佳感染时间,稳定构建了抗mCD19 CAR-T细胞,并在体内外验证其具备良好的杀伤能力.     

铁过载对小鼠脾脏CD8~+ T淋巴细胞凋亡及分泌功能的影响

目的:探讨铁过载对小鼠脾脏CD8~+T细胞凋亡及分泌功能的影响。方法:将40只C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组、铁剂组、去铁组、抗氧化组,每组10只。腹腔注射右旋糖酐铁建立小鼠铁过载模型,观察小鼠铁负荷情况及脾脏CD8~+T淋巴细胞内可变铁池(LIP)水平,活性氧(ROS)水平;用流式细胞术检测脾脏CD8~+T细胞比例以及IFN-γ、TNF-α、Granzyme-B和perforin细胞因子的分泌情况,Annexin/PI标记流式细胞术检测CD8~+T细胞凋亡。免疫磁珠分选小鼠脾细胞获得CD8~+T细胞,RT-PCR检测CD8~+T细胞的IFN-γ、TNF-α、G ranzyme-B、perforin、BCL-2和BAX表达。结果:脾组织铁染色及流式细胞术检测均显示脾发生铁过载。与对照组相比外周血中CD8~+T细胞中ROS明显上升(108.45±9.22 vs 187.48±5.36,P0.01)。与对照组相比,铁过载组小鼠脾脏CD8~+T细胞比例明显降低(7.41±1.23)%vs(14.05±0.79)%,(P0.01)。流式细胞术检测显示,与对照组相比,铁过载组小鼠脾CD8~+T细胞IFN-γ显著降低(11.62±1.99)%vs(3.77±0.84)%,(P0.05),GranzymeB表达显著降低(11.36±1.48)%vs(5.29±1.74)%,(P0.05);小鼠脾CD8~+T细胞中IFN-γ(×10-4)表达(10.94±0.13 vs 2.19±0.78,P0.05)明显下降,Granzyme-B(×10-3)表达(7.70±0.75 vs 4.88±0.08,P0.05)明显下降。与对照组相比,小鼠脾CD8~+T细胞凋亡率明显增高(11.33±0.48)%vs(2.27±0.33)%,(P0.05);小鼠脾CD8~+T细胞中BCL-2表达(×10-3)明显下降(48.29±5.81 vs 1.17±0.21,P0.05),BAX表达(×10-2)明显上升(13.90±2.67 vs 446.93±76.64,P0.05)。上述铁过载对小鼠脾CD8~+T细胞的作用经去铁以及抗氧化治疗后可部分逆转。结论:铁过载可通过上调脾CD8~+T细胞内ROS进而上调BAX并下调BCL-2,增加CD8~+T细胞凋亡率,抑制CD8~+T细胞IFN-γ、Granzyme-B和蛋白的表达。经去铁以及抗氧化治疗后可部分逆转此作用。     

静脉输注过氧化氢溶液上调小鼠脾脏和外周血CD4+Fox03+调节性T细胞

背景:现已证实,天然生成的调节性T细胞在维护机体免疫稳态、抑制炎性反应、抗移植排斥、抑制抗肿瘤免疫应答以及防治自身免疫病中都有重要的功能和作用.目的:探讨静脉输注过氧化氢对BALB/c小鼠CD4+CD25+Foxo3+调节性T细胞的影响.方法:取BALB/c小鼠12只,随机分为两组.H2O2处理组小鼠尾静脉注射含有H2O2的PBS;PBS组小鼠静脉注射无菌PBS.分别在注射2周后处死小鼠,采集小鼠外周血、脾脏和胸腺,采用流式细胞仪检测其中CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例.结果与结论:H2O2处理组小鼠外周血和脾脏CD4+Foxp3+T细胞比例、CD4+Foxp3+/CD4+细胞比例均高于对照组小鼠(P<0.05).提示静脉注射H2O2能上调小鼠外周血和脾脏内CD4+Foxp3+调节性T细胞的比例.     

淋巴细胞亚群在鉴别低增生性骨髓增生异常综合征和再生障碍性贫血中的价值（英文）

目的:探讨低增生性骨髓增生异常综合征(hypo-MDS)和再生障碍性贫血(AA)外周血淋巴细胞亚群及其他临床指标的差异。方法:应用流式细胞术检测hypo-MDS(n=25)和AA(n=33)患者的淋巴细胞亚群，同时分析两组间外周血象、生化指标、骨髓各细胞组分以及异常染色体的差异。结果:AA组CD8⁺ T细胞比例明显高于hypo-MDS组(P=0.001),而CD4⁺ T细胞比例和CD4⁺/CD8⁺比率明显低于hypo-MDS组(P=0.015;P=0.001)。与hypo-MDS组相比，AA组CD4⁺、CD8⁺活化T(TA)细胞及记忆Treg比例均明显下降(P=0.043;P=0.015;P=0.024),而AA组CD8⁺初始T(TN)细胞比例较高(P=0.044)。与AA组相比，Hypo-MDS组外周血淋巴细胞数明显降低(P=0.025),总胆红素(TBil)、乳酸脱氢酶(LDH)、维生素B12水平及骨髓原始细胞比例均明显升高(P=...     

骨髓源性而非脾源性树突状细胞能够诱导产生调节性T细胞

越来越多的证据表明,树突状细胞(DC)能够通过刺激CD4+T细胞产生调节性T细胞(Treg)而参与免疫耐受。本研究旨在探索骨髓源性DC(bone marrow-derived DC,BM-DC)或脾源性DC(spleen derived DC,spDC)诱导CD4+CD25+FOXP3+Treg产生的可能性。以GM-CSF和IL-4从C57BL/6小鼠骨髓前体细胞诱导产生骨髓未成熟DC(immature DC,imDC);6 d后,imDC经脂多糖(LPS)进一步刺激16 h得到成熟树突状细胞(mature DC,mDC);同时用免疫磁珠从小鼠脾脏分选得到spDC,以这3种DC分别与新鲜分离的BALB/c小鼠脾CD4+T细胞混合培养,诱导CD4+CD25+FOXP3+Treg的产生;用流式细胞仪检测CD4+T细胞中FOXP3的表达,对比分析3种DC诱导产生CD4+CD25+FOXP3+Treg的能力。结果表明:经C57BL/6小鼠骨髓imDC、mDC的刺激,BALB/c小鼠CD4+T细胞中的FOXP3表达率从(8.57±1.14)%分别提高到(15.80±1.35)%、(17.93±1.45)%(P<0.01);经spDC的刺激,BALB/c小鼠的CD4+T细胞中的FOXP3表达率则从(8.57±1.14)%下降到(3.95±0.79)%(P<0.05)。结论:体外诱导的BM-DC而非spDC能够诱导Treg的产生,具有介导免疫耐受的作用。     

霉酚酸酯诱导Balb/c小鼠调节性T细胞的分化和增殖

目的:观察霉酚酸酯对Balb/c小鼠调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)分化和增殖的影响,进一步探讨其可能的免疫耐受诱导机制。方法:取8周龄的SPF级Balb/c小鼠24只,随机分为3组,霉酚酸酯组(MMF组):每只灌胃霉酚酸酯40mg/(kg·d),环孢素组(CsA组):每只灌胃CsA10mg/(kg·d),对照组:灌胃每天予等体积生理盐水。3周后眼眶静脉取血,无菌条件下分离脾脏,制备单细胞悬液。采用流式细胞仪检测小鼠外周血和脾细胞CD4+CD25+Treg细胞,免疫组化法检测小鼠脾脏Foxp3蛋白的表达。结果:霉酚酸酯组小鼠外周血和脾细胞中CD4+CD25+Treg细胞的比例分别为(6.35±0.09)%和(11.62±1.10)%,CsA组小鼠外周血和脾细胞中CD4+CD25+Treg细胞的比例分别为(2.57±0.09)%和(5.46±0.75)%,对照组小鼠外周血和脾细胞中CD4+CD25+Treg细胞的比例分别为(4.64±0.13)%和(7.61±0.73)%,差异均有显著性(P<0.01)。霉酚酸酯组小鼠脾脏Foxp3蛋白的表达水平明显高于对照组,差异有显著性(P<0.01),CsA组小鼠脾脏Foxp3蛋白的表达水平明显低于对照组。结论:霉酚酸酯能够明显诱导Balb/c小鼠体内CD4+CD25+Treg细胞的增殖,并能提高Foxp3蛋白的表达,有利于免疫耐受的形成,其免疫抑制机制与CsA不同。     

小鼠肿瘤坏死因子α增强造血干/祖细胞归巢效率的机制研究

目的 探讨肿瘤坏死因子(TNF)α在调节造血干/祖细胞(HS/PC)归巢中的增效作用及其机制.方法 将荧光染料CFSE标记的脐血CD34+细胞移植入接受照射(对照组)或联合TNFα预处理(实验组)的BALB/c受鼠.移植后20 h,采用流式细胞术(FACS)检测脐血CD34+细胞在BALB/c受鼠中的分布(外周血、肝脏、肺脏)与归巢(骨髓、脾脏)特征,计算其相应的归巢效率;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测BALB/c受鼠血清基质衍生因子(SDF)-1α水平;FACS检测TNFα预处理前、后脐血CD34+细胞表面CXCR4表达水平的变化;免疫组化法检测BALB/c受鼠骨髓及脾脏组织切片中SDF-1α的表达水平.结果 脐血CD34+细胞主要归巢于BALB/c受鼠骨髓和脾脏;经TNFα预处理的实验组BALB/c受鼠骨髓归巢率[(0.65±0.13)%]显著高于对照组[(0.30±0.09)%,P<0.01];但TNFα预处理同时显著抑制脐血CD34+细胞归巢于BALB/c受鼠脾脏(P<0.01);不同剂量的TNFα预处理不影响受鼠血清SDF-1α水平;新鲜分离的脐血CD34+细胞与不同浓度TNFα共孵育18 h后,其表面CXCR4表达水平并无明显变化;但TNFα预处理受鼠骨髓龛组成细胞SDF-1α表达增高,且脾脏红髓区小梁动脉和小梁静脉内皮细胞SDF-1α表达增高.结论 TNFα通过提升骨髓龛SDF-1α浓度梯度促进HS/PC归巢于骨髓,这一发现将有助于为临床提供可行性HS/PC归巢增效剂.     

间充质干细胞与人脐血CD34+细胞共移植对NOD/SCID小鼠造血重建的影响

目的 观察间充质干细胞(MSC)与不同比例脐血CD34+细胞共移植对NOD/SCID小鼠造血重建的影响,明确MSC与脐血CD34+细胞共移植的最适数量.方法 给60Coγ射线照射的雌性NOD/SCID小鼠共移植人MSC和不同比例的脐血CD34+细胞,观察共移植后42 d内小鼠外周血白细胞和血小板变化,并于移植后42 d处死小鼠,用流式细胞术检测外周血、骨髓和脾脏人源细胞含量.结果 与单纯脐血CD34+细胞移植相比较:①脐血CD34+细胞与1、5和10倍数量的MSC共移植时,可明显减轻外周血白细胞和皿小板的下降幅度(P<0.01),提前1周使白细胞和血小板恢复至正常水平(P<0.05),三组间差异无统计学意义(P>0.05);②MSC与不同比例的脐血CD34+细胞共移植均可明显提高外周血、骨髓和脾脏造血细胞植入率.比例为10:1时,外周血、骨髓和脾脏中的人源细胞(huCD45+细胞)含量分别增加了(2.8±0.6)倍、(3.5±0.9)倍和(5.2±0.6)倍,增加倍数差异均有统计学意义(P<0.01),达到了最佳的植入效果.结论 脐血CD34+细胞与10倍数量的MSC共移植可达到最佳的促进造血重建作用.     

小鼠骨髓腔内输注人脐血造血干/祖细胞植活水平的观察

目的 探讨小鼠骨髓腔内输注能否增强人脐血造血干/祖细胞(HS/PC)异种移植的植活能力.方法 将不同数量(1×103、1×104、0.5×105、1×105、5×105)的人脐血CD34+细胞经尾静脉和骨髓腔途径移植入经亚致死剂量照射的NOD/SCID小鼠.于指定时间点处死小鼠,用PCR法检测人17号染色体α-微卫星特异性片段及用流式细胞术检测人源CD45+细胞,观察脐血CD34+细胞在移植小鼠左、右两侧胫骨和股骨及脾脏等部位的归巢及其长期植活能力.结果 异种移植后24h,经骨髓腔移植5×105 CD34+细胞的小鼠肝、脾、肺组织,外周血,左右两侧胫骨和股骨、骨髓细胞均表达人17号染色体α-卫星特异性片段.不同数量的人脐血CD34+细胞经骨髓腔途径移植入NOD/SCID小鼠后,8周时其植活良好(检测部位包括输注部位右侧胫骨,以及非输注部位右侧股骨、左侧胫骨、左侧股骨、脾脏及外周血).分别经尾静脉和骨髓腔两种途径输注同一来源的人脐血CD34+细胞1.0×105,8周时两组间人造血细胞植活水平分别为(44.063±20.095)%和(45.881±22.316)%,差异无统计学意义(P＜0.05);而将移植CD34+细胞数降至1.0×104时,则经骨髓腔途径输注的人脐血CD34+细胞小鼠植活水平(54.019±31.338)%显著优于尾静脉输注途径[(12.197±10.350)%,P＜0.01)];当CD34+细胞输注量降至1.0×103时,仅有骨髓腔内输注组小鼠能见到人脐血CD34+细胞植活,且植活部位通常为非输注部位骨骼.结论 小鼠骨髓腔内移植能够增强人脐血造血干/祖细胞的植活水平.     

再生障碍性贫血患者CD4+ CD25+ CD127low调节性T细胞及Notch1表达水平的变化

目的 测定再生障碍性贫血(AA)患者治疗前后外周血CD4+ CD25+ CD127low调节性T细胞(Treg)的数量及叉头翼状螺旋转录因子(FOXP3)mRNA、Notch1 mRNA的表达水平,探讨Treg在AA发病中的作用及其机制.方法 流式细胞术检测29例初发AA患者、14例环孢素(CsA)治疗后恢复期及11例治疗后未恢复期患者外周血中CD4+ CD25+ CD127low T细胞、CD4+ CD25+ T细胞的数量,并与正常对照比较;采用RT-PCR检测FOXP3 mRNA和Notch1 mRNA的表达水平,分析两者相关性.结果AA初发组及治疗后未恢复组患者外周血中活化CD4+ CD25+ T细胞占CD4+ T细胞比例分别为(4.3±0.7)%、(4.2±0.6)%,明显高于正常对照组[(2.4±0.8)%](P＜0.05).CsA治疗后恢复组患者比例下降为(2.6±0.7)%(P＜0.05),与对照组比较差异无统计学意义.AA初发组及未恢复组CD4+ CD25+ CD127low T细胞在CD4+ T细胞中的比例分别为(2.4±1.2)%、(2.5±1.1)%,较正常对照组[(7.1±2.7)%]及恢复组[(5.3±1.0)%]明显降低(P值均＜0.01);但后两组比较差异无统计学意义.AA初发组患者FOXP3 mRNA及Notch1 mRNA分别为(0.260±0.011)和(0.018±0.005),较正常对照[(1.307±0.011)和(0.308±0.028)]表达明显下调(P值均＜0.01),治疗后分别为(1.287±0.012)和(0.281±0.013),表达较初发组显著提高(P值均＜0.01),与对照组比较差异无统计学意义(P值均＞0.05).AA患者CD4+ CD25+ CD127low T细胞、FOXP3均与Notch1表达呈正相关性(P值均＜0.01).结论AA患者外周血CD4+ CD25+ CD127low Treg减少,其抑制作用减弱,导致自身反应性T细胞过度活化,抑制造血.其作用机制之一可能与靶细胞表面Notch1分子表达降低相关.     

淋巴细胞亚群在MDS和AA患者中的变化和意义

目的研究骨髓增生异常综合征(MDS)和再生障碍性贫血(AA)患者骨髓血淋巴细胞亚群的变化及其临床参考意义。方法选取本院2010-2016年住院或门诊的骨髓增生异常综合征(MDS)和再生障碍性贫血(AA)患者各28例。另选取无贫血、感染等健康成人20例作为健康组,采用四色流式细胞术检测各组淋巴细胞亚群。结果与健康组相比,MDS组CD19~+B淋巴细胞比例明显降低,CD3~-CD56~+NK细胞比例降低,CD3~+CD4~+/CD3~+CD8~+(Th/Ts)值明显减低,差异均有统计学意义(P0.05),而CD3~+T淋巴细胞比例差异无统计学意义(P0.05);与健康组相比,AA组CD3~+T淋巴细胞、CD19~+B淋巴细胞比例差异无统计学意义(P0.05),CD3~-CD56~+NK细胞比例明显降低及Th/Ts值明显降低,差异均有统计学意义(P0.05)。结论MDS和AA患者骨髓血中淋巴细胞亚群与健康组存在一定差异,淋巴细胞亚群检测对2种疾病的诊断和鉴别诊断具有一定价值。