体外诱导K562细胞伊马替尼耐药及其机理的初步探讨

目的 体外诱导K562细胞伊马替尼(imatinib)耐药并对其耐药性进行检测.方法 以浓度递增的方法诱导K562对伊马替尼产生耐药, MTT法确定其耐药性.RT-PCR方法半定量测定耐药细胞中BCR/ABL基因水平,并进行BCR/ABL基因序列测定.流式细胞术测定P-gp表达.高效液相色谱仪(HPLC)测定耐药细胞内药物浓度.结论 ①浓度递增法成功诱导K562细胞伊马替尼耐药(K562R),K562R细胞能长期在含5.0 μmol/L的伊马替尼的培养液中生长.②细胞生长曲线显示5.0 μmol/L伊马替尼作用于K562R细胞120 h,其活细胞数量与0 h无明显差别.6个浓度梯度的伊马替尼(0、0.25、0.50、0.75、1.00、2.00 μmol/L)作用于K562细胞24 h,发现所有浓度(除0 μmol/L外)伊马替尼均可抑制K562细胞的生长,24 h细胞活力几乎为零.③MTT法抑制率测定K562细胞半数抑制浓度约为0.75 μmol/L,K562R细胞约为7.5 μmol/L,耐药倍数约为10倍.④HPLC细胞内药物浓度测定显示K562R胞内伊马替尼药物浓度低于K562细胞(P＜0.01),流式细胞检测未发现P-gp表达.⑤374 bp的BCR/ABL基因序列分析未发现常规热点区域基因突变.结论 体外成功诱导出伊马替尼耐药细胞--K562R细胞.K562R耐药主要环节为胞内药物浓度降低,而胞内药物浓度降低与P-gp无关.耐药机理需要进一步研究.     

慢性粒细胞白血病细胞株伊马替尼耐药与MDR1基因表达相关性探讨

目的 探讨慢性粒细胞白血病细胞株伊马替尼耐药与MDR1基因表达相关性.方法 采用Real-time PCR检测MDR1 mRNA表达,Western-blot检测P-gp蛋白表达,MTS法检测细胞药物敏感性.结果 耐伊马替尼细胞株K562/G01MDR1的mRNA表达明显上调,P-gp表达明显上调,维拉帕米能部分逆转K562/G01细胞株对伊马替尼的耐药.结论 MDR1基因参与伊马替尼耐药机制,P-gp抑制剂能改善伊马替尼临床疗效.     

慢性粒细胞白血病错配修复基因的研究

探讨慢性粒细胞白血病（CML）错配修复（MMR）基因的表达水平及调控机制。采用半定量RT—PCR方法检测62例CML患者及K562细胞的5个MMR基因（hMSH2、hMSH3、hMSH6、hMLH1、hPMS2）mRNA的表达；用RT-PCR方法动态检测26例进行异基因外周血造血干细胞移植（allo—PBSCT）及4例使用伊马替尼治疗的CML患者bcr-ab1及MMR mRNA的表达水平;用伊马替尼体外作用于CML患者的单个核细胞（MNC）及K562细胞后，用Westernblot方法检测BCR—ABL融合蛋白的酪氨酸磷酸化水平，RT—PCR方法检测MMR mRNA表达水平。     

桃儿七可促进慢性粒细胞白血病K562细胞的凋亡

目的 探讨藏药桃儿七对慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡的影响及相关机制.方法 用不同浓度的桃儿七对K562细胞株进行不同时间梯度的处理,应用CCK8试验筛选桃儿七的最佳作用浓度及时间;流式细胞术检测细胞凋亡;瑞氏染色观察细胞形态学改变,DAPI染色观察细胞核形态变化;Western blotting分别检测凋亡相关蛋白PARP、caspase-3、Cleaved-caspase3的活化情况以及BCR/ABL、p-BCR/ABL、STAT5、p-STAT5蛋白表达变化.结果 分别以1、2、3μg/mL浓度的桃儿七处理细胞12、24、36、48、72、96 h,K562细胞增殖呈浓度时间依赖性抑制,并筛选出2μg/mL,48 h为最佳处理方式.流式细胞术检测结果显示凋亡细胞数量呈时间依赖性增加,并在48 h凋亡最为显著;凋亡相关蛋白PARP、caspase-3以及Cleaved-caspase-3均呈时间依赖性活化.以2 μg/mL桃儿七处理细胞48 h后,K562细胞形态发生不规则改变,出现核碎裂、溶解等凋亡特征;BCR/ABL、p-BCR/ABL、STAT5、p-STAT5表达显著降低.结论 藏药桃儿七能够促进慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡,其机制可能通过抑制BCR/ABL-STAT5信号通路并激活线粒体凋亡途径来实现.     

伊马替尼、柔红霉素和硼替佐咪对两种Ph(+)白血病细胞株抗肿瘤效应的比较研究

目的 比较研究化疗药物伊马替尼、柔红霉素和硼替佐咪对两种Ph(+)白血病细胞株K562(髓系白血病细胞株,表达P210蛋白)和SUP-B15(急性淋巴细胞白血病细胞株,表达P190蛋白)的抗肿瘤效应.方法 采用MTT法测定不同浓度的伊马替尼、柔红霉素与硼替佐咪分别作用72 h后两种细胞株的增殖活性,并计算3种化疗药物对两种细胞株作用的半数抑制浓度(IC50);RT-PCR法检测不同浓度伊马替尼作用48 h后两种细胞株bcr-abl基因表达的改变.结果 ①不同浓度伊马替尼、柔红霉素与硼替佐咪分别作用K562和SUP-B15细胞株72h,其对细胞株的IC50值分别为(0.286±0.060)μmol/L、(0.303±0.009)μmol/L、(22.127±3.592)nmol/L和(1.387±0.180)μmol/L、(0.117±0.017)μmol/L、(12.35±0.740)nmol/L,提示伊马替尼对K562细胞敏感性明显高于SUP-B15细胞,而柔红霉素对SUP-B15更敏感,硼替佐咪对两种细胞的敏感性无差异;②伊马替尼0、0.35、1.0μmol/L作用48 h后,两株细胞bcr-abl基因表达均无明显变化.结论 伊马替尼、柔红霉素、硼替佐咪对Ph(+)细胞株K562和SUP-B15均有较好的抗肿瘤效应,伊马替尼对K562更敏感,而柔红霉素和硼替佐咪对SUP-B15均有较好的抑制作用,短时间伊马替尼作用后不影响bcr-abl基因的表达.     

地西他滨逆转白血病K562细胞株多药耐药的作用观察

目的:探讨地西他滨逆转白血病K562细胞株多药耐药的作用。方法:实验室培养K562细胞株,设立空白对照组、伊马替尼(IM)单药组(0.1μmol/L)、地西他滨(DAC)单药组(1μmol/L),以不同的药物处理细胞,利用酶标仪检测处理后细胞在570 nm吸光度(OD值),计算细胞抑制率。结果:DAC单药组K562细胞株抑制率为(20.73±0.33)%,IM单药组抑制率(24.85±1.22)%,空白对照组的抑制率为0,IM的抑制率与DAC的抑制率对比差异无统计学意义(t=0.965,P>0.05)。结论:地西他滨和甲磺酸伊马替尼对K562细胞的增殖有抑制作用,可为耐药选择提供参考。     

抗ABL胞内抗体对K562细胞酪氨酸激酶活性的影响

目的:观察人慢性粒细胞白血病(CML)细胞转导抗ABL胞内抗体基因后,对其酪氨酸激酶活性的影响。方法:构建逆转录病毒载体MSCV-ib-IRES-eGFP,转导K562细胞,分选eGFP 的细胞,用RT-PCR检测胞内抗体mRNA的表达,观察细胞内BCR/ABL、c-ABL酪氨酸激酶活性及细胞总蛋白酪氨酸激酶活性的变化。结果:获得表达胞内抗体的K562细胞:K562-ib-eGFP。RT-PCR证实胞内抗体mRNA在K562-ib-eGFP细胞内表达。与对照组相比,K562-ib-eGFP细胞内BCR/ABL和c-ABL蛋白酪氨酸激酶活性及总蛋白酪氨酸激酶活性明显受抑制。结论:转导抗ABL胞内抗体能有效降低CML细胞内ABL酪氨酸激酶活性,为进一步研究打下基础。     

慢性粒细胞白血病伊马替尼耐药机制探讨

慢性粒细胞白血病是一种严重危害人们生命健康的造血系统恶性肿瘤,伊马替尼作为酪氨酸激酶抑制剂的出现更是带给了患者生存的希望,但近年来伊马替尼在治疗慢性粒细胞白血病的耐药性不断增加,因此清晰的了解其耐药机制对于我们更好的利用该药和后续研发新药都至关重要,本文主要分析了常见的引起伊马替尼耐药的原因包括BCR/ABL相关性耐药和非BCR/ABL相关性耐药。     

硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562的凋亡作用及机制

目的 探讨硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562(K562R)的诱导凋亡作用及机制.方法 采用浓度梯增法建立耐伊马替尼K562细胞系.应用CCK-8法检测不同浓度硼替佐米分别作用K562和K562R细胞24 h、48 h后,对细胞的增殖抑制的效果.使用流式细胞术方法分别检测硼替佐米单独或联合伊马替尼作用于K562R细胞48 h后的细胞凋亡.应用Western blotting检测不同浓度硼替佐米作用K562R细胞48 h后,Mcl-1、Bcl-2、Bcr/Abl蛋白表达的异同.结果 成功将对伊马替尼敏感的K562细胞诱导为K562R,耐药倍数为31.8;硼替佐米对K562及K562R细胞的增殖抑制呈浓度、时间依赖(P均<0.05);随着硼替佐米浓度增加,对K562R细胞的诱导凋亡作用增强,且硼替佐米与伊马替尼联合具有协同作用(P<0.05);硼替佐米可抑制K562R细胞Mcl-1,Bcr/Abl蛋白的表达,Bcl-2无变化.结论 硼替佐米具有对K562R细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用,其机制可能与下调K562R细胞Bcr/Abl和MCL-1的表达以及促进MCL-1发生切割有关.     

异基因造血干细胞移植联合伊马替尼治疗成人Ph+急性淋巴细胞白血病临床观察

目的 观察异基因造血干细胞移植(allogenic hematopoietic stem-cell transplantation,allo-HSCT)联合伊马替尼治疗成人Ph+急性淋巴细胞白血病的效果.方法 2008年3月至2010年3月,我科对20例成人Ph+急性淋巴细胞白血病患者采用异基因造血干细胞移植联合伊马替尼方案,其中9例接受同胞间HLA全相合移植,6例接受同胞间HLA单倍型移植,3例接受非血缘关系HLA全相合移植,2例接受非血缘关系HLA半全相合移植.20例患者在明确诊断后开始予化疗联合伊马替尼治疗,移植前2周至移植造血重建前停用伊马替尼,造血功能稳定后继续予伊马替尼维持治疗,移植后应用RT-PCR和FISH方法监测BCR/ABL表达水平.结果 20例患者均成功植入,均未出现严重的移植相关并发症.移植前20例患者接受伊马替尼联合化疗均达到完全缓解(complete remission,CR),BCR/ABL均转为阴性.随访至2012年3月,20例患者中15例骨髓持续CR,BCR/ABL持续阴性,5例复发.结论 异基因造血干细胞移植联合伊马替尼是治疗Ph+急性淋巴细胞白血病的有效方法.     

STAT5-ROS信号通路介导K562细胞伊马替尼耐药的机制研究

目的 探讨信号转导与转录因子5-氧化物(STAT5-ROS)细胞信号转导通路在慢性髓细胞白血病细胞(K562)伊马替尼(IM)耐药中的作用机制.方法 以浓度递增的方法诱导K562对IM产生耐药, CCK-8法检测其耐药性.RT-PCR方法定量测定K562/G细胞中STAT5A和STAT5B mRNA表达.流式细胞术测定ROS和细胞凋亡水平.Western blot法检测细胞中总STAT5和p-STAT5蛋白表达.结果 实验成功诱导K562/G耐药细胞,CCK-8法测定耐药倍数为80倍.细胞生长曲线显示20 μmol/L IM作用于K562/G细胞48 h,活细胞数量减半.0.1 μmol/L IM作用于K562细胞24 h,活细胞数量几乎为零.流式细胞检测K562/G细胞内ROS水平明显高于K562细胞(P=0.000 1),相同浓度IM作用于两株细胞相同时间,K562/G细胞凋亡比例低于K562(P<0.05).RT-PCR结果显示K562/G细胞中STAT5A和STAT5B水平均高于K562(P=0.000 1、0.017 0).Western blot结果表明K562/G细胞中STAT5蛋白水平显著升高(P=0.009 0).结论 STAT5在慢性髓细胞白血病中高表达,STAT5-ROS通路的活化与K562细胞IM耐药密切相关.     

抗ABL酪氨酸激酶区胞内抗体对K562细胞在裸鼠体内生长的影响

目的观察人慢性粒细胞白血病细胞转导抗ＡＢＬ蛋白酪氨酸激酶区胞内抗体基因后,对其在裸鼠体内生长的影响。方法应用基因重组技术构建逆转录病毒载体ＭＳＣＶ－ｉｂＥ－ＩＲＥＳ－ｅＧＦＰ,将胞内抗体基因转导Ｋ５６２细胞,观察胞内抗体的表达和细胞内ｃ－ＡＢＬ及ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白酪氨酸激酶活性的变化;将表达胞内抗体的细胞与对照组Ｋ５６２细胞及转导空载体的细胞分别移植裸鼠,动态观察肿瘤的生长。结果获得表达胞内抗体基因的细胞模型：Ｋ５６２－ｉｂＥ,其靶蛋白酪氨酸激酶活性明显受抑。移植裸鼠后第１４,２１,２８天肿瘤体积均小于对照组的１／２。结论转导抗ＡＢＬ蛋白酪氨酸激酶区胞内抗体的细胞在裸鼠体内生长明显受抑制,这可能与胞内抗体显著抑制细胞内ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白酪氨酸激酶活性,阻断ＢＣＲ／ＡＢＬ信号途径,促进细胞凋亡,降低了细胞的体内致肿瘤性有关。     

反义BCR/ABL寡核苷酸体外抑制K562细胞的研究

目的：探讨反义ＢＣＲ和ＡＢＬ融合基因（ＢＣＲ／ＡＢＬ融合基因）寡核苷酸体外抑制Ｋ５６２细胞的作用及机制。方法：采用Ｋ５６２细胞培养,观察反义ＢＣＲ／ＡＢＬ寡核苷酸体外对Ｋ５６２细胞数、台盼蓝拒染率及克隆形成等的影响。结果：经反义ＢＣＲ／ＡＢＬ寡核苷酸ｂ３ａ２（ＡＳｂ３ａ２）处理后培养８ｄ的Ｋ５６２克隆抑制率达６０６９％,液体培养中细胞数从２４ｈ开始较对照组减少,细胞存活率从８ｈ开始即较对照组明显下降,ＢＣＲ／ＡＢＬ寡核苷酸ｂ２ａ２（ＡＳｂ２ａ２）及无义寡核苷酸对Ｋ５６２细胞数和存活率无明显影响;３种寡核苷酸对ＨＬ６０细胞数和存活率也无影响。结论：ＡＳｂ３ａ２对Ｋ５６２细胞有序列特异性的抑制作用。ＡＳｂ３ａ２的这种抑制作用可能在于它诱导Ｋ５６２细胞的凋亡。     

吲哚美辛对K562细胞株BCR/ABL-Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的探讨吲哚美辛对K562细胞增殖的影响及其分子机制。方法采用不同浓度的吲哚美辛作用于K562细胞,MTT法
检测其对细胞增殖的影响,克隆形成实验检测吲哚美辛对K562细胞克隆形成能力的影响。RT-PCR分别检测bcr-abl、β-catenin
的mRNA表达变化,Western blot分别检测pBCR/ABL、总BCR/ABL、β-catenin、pGSK-3β、c-myc的蛋白表达变化。结果100、
200、400 μmol/L吲哚美辛作用细胞48 h后,以浓度依赖性方式抑制K562细胞的增殖和克隆形成能力。3种浓度的吲哚美辛处
理K562细胞后,pBCR/ABL、总BCR/ABL的蛋白表达依次减少,而bcr-abl mRNA水平没有明显变化。β-catenin mRNA和蛋白
水平依次减少;pGSK-3β、c-myc 的蛋白水平均明显降低。结论吲哚美辛可通过抑制BCR/ABL-Wnt/β-catenin 信号通路的活
性,从而抑制白血病K562细胞的增殖和克隆形成能力。
     

双标记原位杂交法检测间期细胞BCR/ABL融合基因

目的 :应用双标记原位杂交方法检测 BCR/ ABL融合基因。方法 :BCR基因探针用地高辛标记 ,碱性磷酸酶显色 ;ABL基因用3 H- d ATP标记 ,核子乳胶放射自显影。结果 :检测 9例初治的慢性粒细胞白血病 ( CML)病人均为阳性 ,阳性细胞比例为 93% ;检测 CML来源的 K5 62细胞株阳性细胞占 98.8% ;正常人假阳性率为 0 .75 %。结论 :该方法简便、快速 ,适用于 CML微小残留病的检测     

硫利达嗪增强伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞 K562的抑制作用及机制

目的：观察硫利达嗪（THZ）、伊马替尼（IM）单药及联合对人慢性粒细胞白血病（CML）细胞 K562的诱导作用,并探讨其机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定THZ、IM单药及联合对细胞的抑制作用,计算两药协同指数（CI）。检测 THZ、IM单药及联合对细胞凋亡的影响。West-ern blot 法检测凋亡蛋白 Cleaved-Bid、Procaspase 3,凋亡调节蛋白 Bcl-2、Bax、pPI3K、pAKT 表达的变化。结果 THZ 16μmol／L 作用24 h 后 K562细胞增殖明显抑制,低剂量细胞毒性作用不明显。IM低剂量即有较强的细胞毒性作用,两药联合后经计算有较好的协同作用。根据 CI 值选定药物浓度作用 K562细胞24 h,流式细胞术结果显示,THZ 单药组无明显细胞凋亡,IM单药组、IM联合 THZ 组均存在不同程度的细胞凋亡,与对照组比较差异有统计学意义（P ＜0．01）。Western blot 法结果显示各实验组细胞胞内 Cleaved-Bid 表达量增加,Procaspase 3表达量下降。抗凋亡蛋白 Bcl-2、pPI3K、pAKT 下调、促凋亡蛋白 Bax 表达明显上调,各实验组与对照组比较,差异有统计学意义（P ＜0．01）。结论低剂量 THZ 联合 IM对 CML 细胞 K562具有显著的增殖抑制作用,其作用较 IM单用作用强,THZ 有明确增敏 IM的作用。与 IM、THZ 单药组比较,IM联合 THZ 组 Cleaved Bid 表达量上调、Procaspase 3表达量下降,其杀伤机制可能与线粒体通路及抑制 PI3K-AKT 通路均有关。     

凋亡调节蛋白的表达与K562／VCR多药耐药性的关系

目的探讨K562/VCR细胞中凋亡调节蛋白表达的变化与其多药耐药性(MDR)的关系。方法通过免疫细胞化学法和免疫印迹法(westernblot)对凋亡调节蛋白Bcl-2、Bcl-X     

甲基莲心碱联合mdr 1shRNA对K562/A02 细胞mdr 1/P gp表达的影响

目的：探讨甲基莲心碱(Nef)联合mdr 1shRNA表达的载体对K562/A02细胞mdr 1/ P gp表达的影响。 方法：采用MTT方法比较Nef,mdr 1shRNA单独或二者联合对K562/A02细胞增殖的抑制作用;采用RT PCR和Western印迹法检测mdr 1/P gp的表达。 结果：Nef与mdr 1shRNA联合组对K562/A02细胞的抑制率显著高于mdr 1shRNA,Nef单独处理组(P＜0.01);联合组对K562/A02细胞mdr 1/P gp表达的抑制作用强于单独处理组（P＜0.01）。 结论：甲基莲心碱能增强mdr 1shRNA表达载体对K562/A02细胞的增殖抑制作用及mdr 1/P gp表达的抑制作用,逆转mdr 1基因编码蛋白P gp介导的多药耐药。