ATP1通过调节氧化应激促进白念珠菌逃逸巨噬细胞杀伤的研究

【摘要】 目的 通过反向遗传学方法，探索白念珠菌F1Fo?ATP合酶α亚基编码基因（ATP1）通过清除细胞内活性氧以逃逸巨噬细胞杀伤的生理作用。方法 以白念珠菌ATP1缺失株及其亲本株为研究对象，接种平板培养后计算菌落数评估其体外细胞活性，通过尾静脉接种小鼠后计算肾脏组织形成菌落数评估体内细胞活性。将培养过夜的白念珠菌菌液与巨噬细胞共培养后，接种平板，计算菌落数，测定菌的存活率，通过乳酸脱氢酶释放法测定巨噬细胞乳酸脱氢酶水平；以过氧化氢建立模拟巨噬细胞内氧化应激模型，过氧化氢作用白念珠菌后，通过计算菌落数比较各菌株细胞活性，采用DCFH?DA染色测定细胞内活性氧水平，实时荧光定量PCR检测过氧化氢酶1（CAT1）基因、超氧化物歧化酶4（SOD4）基因和超氧化物歧化酶5（SOD5）基因mRNA水平。采用双因素方差分析或Student t检验对数据进行统计学分析。结果 在体外，亲本株组和ATP1缺失组菌落数随培养时间逐渐增多，24 h后ATP1缺失组菌落数仅为亲本株组的10%，差异有统计学意义（F = 481.84，P < 0.001）。在小鼠体内，亲本株组肾脏组织形成菌落数随时间逐渐增多，但是ATP1缺失组逐渐减少，两组差异有统计学意义（F = 78.27，P = 0.001）。与体内实验结果一致，体外白念珠菌菌体与巨噬细胞共培养后，ATP1缺失组白念珠菌存活率（62.67 ± 3.51）%比亲本株组（82.33 ± 2.52）%显著降低（t = 7.88，P = 0.001），与ATP1缺失组共培养的巨噬细胞乳酸脱氢酶释放百分比（27.80 ± 3.54）%比与亲本株组共培养的巨噬细胞（87.78 ± 0.17）%显著降低（t = 33.89，P < 0.001）。在模仿的巨噬细胞内氧化应激模型中，ATP1缺失组细胞活性比亲本株组显著降低，差异有统计学意义（F = 3 440.65，P < 0.001）。在与巨噬细胞共培养以及模仿的巨噬细胞内氧化应激模型中，ATP1缺失组细胞内活性氧水平均比亲本株组显著增高，差异有统计学意义（均P < 0.001）。ATP1缺失组CAT1、SOD4、SOD5 mRNA水平均比亲本株组降低，差异均有统计学意义（均P < 0.001）。结论 ATP1缺失可能分别通过下调氧化应激和活性氧清除相关基因表达，使白念珠菌抵抗氧化应激和清除活性氧的能力明显减弱，最终不能逃逸巨噬细胞杀灭而被宿主清除。     

C型凝集素1受体参与人中性粒细胞体外杀伤白念珠菌活性的实验研究

【摘要】 目的 探讨人中性粒细胞能否通过C型凝集素1受体（dectin-1）识别白念珠菌细胞壁不溶性β葡聚糖来介导体外杀伤白念珠菌的活性。 方法 100 mg/L β葡聚糖体外作用于中性粒细胞1、6、24 h后,实时荧光定量逆转录PCR分析dectin-1和Toll样受体2 mRNA表达水平。100 mg/L β葡聚糖体外分别刺激中性粒细胞15 min、2 h、6 h,或先用dectin-1抑制剂昆布多糖100 mg/L和50 mg/L预处理30 min后,再予100 mg/L β葡聚糖刺激2 h,微量培养板荧光分析法检测中性粒细胞H2O2释放水平。昆布多糖预处理的中性粒细胞与白念珠菌体外共培养后,检测菌落形成单位（CFU）。结果 β葡聚糖作用中性粒细胞1、6、24 h后,dectin-1 mRNA水平分别为2.8195 ± 0.1669、5.4859 ± 0.7244、3.6041 ± 0.5372,均明显高于空白对照组（均P < 0.01）。β葡聚糖刺激中性粒细胞15 min后H2O2水平为（64.55 ± 15.67） μmol/L,2 h时为（290.34 ± 30.56） μmol/L,6 h时为（208.54 ± 26.88） μmol/L,与空白对照组（22.05 ± 3.99） μmol/L比较,差异均有统计学意义（均P < 0.01）;100 mg/L和50 mg/L昆布多糖预处理组分别为（80.45 ± 22.41） μmol/L和（130.42 ± 44.55） μmol/L,与β葡聚糖刺激组相比,分别降低了73%和45%,差异均有统计学意义（P < 0.01）。昆布多糖能明显抑制中性粒细胞体外杀伤白念珠菌的活性（均P < 0.01）。 结论 Dectin-1参与人中性粒细胞分泌H2O2以及对白念珠菌杀灭活性,为过继性粒细胞转输治疗系统性念珠菌感染提供初步依据。 【关键词】 念珠菌,白色; 中性白细胞; β葡聚糖类; 外源凝集素类,C型; 过氧化氢     

氮掺杂碳纳米酶联合近红外光抗真菌体外试验研究

目的：评价氮掺杂碳纳米酶（N-Carbon nanozyme）联合近红外光对白念珠菌和红色毛癣菌体外抗菌的效果。方法：将白念珠菌和红色毛癣菌标准菌株常规接种培养，分别分为四组：(1)空白对照组：真菌不作任何处理；(2)光照组：真菌予以2.5 W/cm2近红外光照射8 min；（3）材料组：真菌予以250 μg/mL的N-Carbon nanozyme处理30 min；（4）实验组：真菌予以250 μg/mL的N-Carbon nanozyme及2.5 W/cm2近红外光照射8 min。SYTO 9/PI染色判断白念珠菌和红色毛癣菌的菌体活性；扫描电镜观察和平板计数法判定白念珠菌抗菌形态和菌落形成单位（CFU）的数量。结果：实验组中SYTO9/PI染色示红色荧光染色信号显著增加；与空白对照组比较，光照组、材料组间菌落数均未见明显差异，而实验组可见菌落明显减少。生物扫描电镜显示白念珠菌的细胞形态发生明显的变化。结论：氮掺杂碳纳米酶联合近红外光对白念珠菌及红色毛癣菌均有明显的抑制作用。     

白念珠菌诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞焦亡的初步研究

【摘要】 目的 探讨白念珠菌对小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）焦亡的影响。方法 通过活细胞工作站实时观察白念珠菌［感染复数（MOI） = 50,下同］体外诱导BMDM后是否发生焦亡;将BMDM分为对照组、白念珠菌组,分别用磷酸盐缓冲液和白念珠菌酵母诱导BMDM 6 h,实时荧光定量PCR检测NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 （NLRP3）、白细胞介素1β （IL-1β）、IL-18 mRNA表达水平,Western印迹法检测NLRP3、胱天蛋白酶1（Caspase-1）、Gasdermin D（GSDMD）的表达及剪切水平。用白念珠菌诱导BMDM不同时间（0、10、15、20及25 h）后,酶联免疫吸附试验检测IL-1β、IL-18分泌水平。白念珠菌体外诱导野生型（WT）BMDM及 GSDMD 敲除（KO）BMDM 15 min,采用流式细胞仪比较WT、GSDMD KO BMDM对白念珠菌的吞噬率;诱导6 h后,采用流式细胞仪及乳酸脱氢酶（LDH）释放法分别检测WT、GSDMD KO BMDM的死亡率。分别设置空白对照组、对照组、样品最大酶活性对照孔组、IL-1β组、白念珠菌组、IL-1β + 白念珠菌组,用IL-1β和/或白念珠菌酵母诱导BMDM后用LDH释放法分析WT及GSDMD KO BMDM死亡率。采用非配对t检验、Kruskal-Wallis 检验、方差分析等统计学方法进行统计分析。结果 白念珠菌体外诱导BMDM后细胞可出现气球样变及出泡现象,证实焦亡发生;与对照组相比,白念珠菌组诱导BMDM 6 h后NLRP3、IL-1β的mRNA表达水平明显升高（t = 13.02、17.51,P = 或＜0.001）,而IL-18 mRNA表达水平无明显变化（P = 0.486）,且白念珠菌诱导可引起炎症小体NLRP3表达增多及Caspase-1、GSDMD剪切。白念珠菌诱导BMDM不同时间（0、10、15、20及25 h）后IL-1β的分泌水平随时间逐渐升高（H = 12.90,P = 0.012）,而IL-18的分泌水平无明显变化（F = 0.48,P = 0.753）,且GSDMD KO组BMDM的IL-1β分泌水平低于WT BMDM组（F = 24.22,P = 0.008）。白念珠菌体外诱导15 min后,GSDMD KO BMDM［（50.3 ± 1.10）%］对白念珠菌的吞噬率低于WT BMDM［（58.53 ± 1.19）%,t = 5.09,P = 0.007］;白念珠菌体外诱导6 h后,流式细胞仪检测显示GSDMD KO组BMDM的死亡率（38.40% ± 0.50%）高于WT组BMDM（34.37% ± 0.52%）,t = 4.72,P = 0.009;LDH检测同样显示GSDMD KO BMDM的死亡率（22.52% ± 0.18%）高于WT BMDM（12.48% ± 0.15%）,t = 42.36,P＜0.001;IL-1β预处理后予白念珠菌体外诱导的WT BMDM及GSDMD KO BMDM 的细胞死亡率均较单纯白念珠菌诱导组降低（均P＜0.001）。结论 白念珠菌可诱导BMDM发生焦亡,焦亡的发生可促进IL-1β释放,并通过提高巨噬细胞的免疫活性,降低巨噬细胞死亡率。     

白念珠菌菌丝调控小鼠巨噬细胞自噬关键分子微管相关蛋白1轻链3的实验研究

【摘要】 目的 探讨白念珠菌菌丝对小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）自噬流的影响。方法 白念珠菌菌丝分别体外诱导BMDM细胞0.5、4、12 h,以不加菌丝处理的0 h组作为对照,Western印迹法检测各时间点自噬关键蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换及磷酸化雷帕霉素机制性靶蛋白（p-mTOR）的表达。白念珠菌菌丝分别联合4种溶酶体阻断剂,包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64d + 胃蛋白酶抑制剂pepstatin、巴弗洛霉素-A1（BAF-A1）、氯化铵及氯喹,体外诱导小鼠BMDM细胞4、12 h,观察白念珠菌菌丝对BMDM细胞基础自噬流的影响。统计分析采用非配对t检验、析因设计的方差分析及LSD-t检验。结果 白念珠菌菌丝体外处理小鼠BMDM 0.5、4和12 h后,与0 h组（0.983 ± 0.030）相比,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换均增加（1.254 ± 0.118、1.629 ± 0.391、1.598 ± 0.379）,差异有统计学意义（t值分别为3.875、2.856、2.804,均P < 0.05）,但各组p-mTOR的蛋白表达无明显差异。白念珠菌菌丝联合E-64d + pepstatin体外处理BMDM细胞4和12 h后,LC3-Ⅱ的蓄积水平较E-64d + pepstatin单独处理组明显增高,差异均有统计学意义（t值分别3.691、6.648,均P < 0.05）。与相应溶酶体阻断剂组相比,白念珠菌菌丝联合BAF-A1、氯化铵或氯喹4和12 h后,LC3-Ⅱ的蓄积水平均显著升高（均P < 0.05）。结论 白念珠菌菌丝体外诱导可增加小鼠BMDM细胞基础自噬流中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换。     

H2O2对人皮肤成纤维细胞衰老标记蛋白30及自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达的影响北大核心CSCD

目的 探讨H2O2对人皮肤成纤维细胞（NHSF）衰老标记蛋白30（SMP30）以及细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型（LC3Ⅱ）的影响。方法 用150 μmol/L H2O2处理2 ~ 4代NHSF 2 h,构建细胞衰老模型作为H2O2组,而未处理的NHSF作为对照组。细胞衰老β半乳糖苷酶（SA？β？gal）染色法检测衰老细胞比例,间接免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3的表达,反转录PCR（RT？PCR）检测SMP30 mRNA的表达,Western印迹法检测SMP30和LC3蛋白的表达。结果 H2O2组NHSF的SA？β？gal染色阳性率（41.70% ± 2.95%）显著高于对照组（3.03% ± 0.25%,t = 22.59,P 〈 0.05）。间接免疫荧光结果显示,H2O2组NHSF LC3阳性率（12.60% ± 1.57%）明显低于对照组（23.67% ± 3.04%,t = 5.61,P 〈 0.05）。Western印迹显示,H2O2组LC3Ⅰ/GAPDH比值（0.40 ± 0.02）与对照组（0.41 ± 0.04）比较差异无统计学意义（P 〉 0.05）,而H2O2组LC3Ⅱ/GAPDH比值（0.20 ± 0.02）明显低于对照组（0.80 ± 0.03,t = 29.69,P 〈 0.05）,且H2O2组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（0.51 ± 0.03）亦明显低于对照组（1.98 ± 0.23,t = 10.967,P 〈 0.05）。H2O2组SMP30 mRNA和蛋白水平（与GAPDH mRNA和蛋白的比值分别为0.16 ± 0.01和0.27 ± 0.02）明显低于对照组（分别为0.35 ± 0.01和0.63 ± 0.02）,均P 〈 0.05。结论 H2O2可降低NHSF中SMP30及LC3Ⅱ的表达水平,加速NHSF衰老。     

β联蛋白对体外过氧化氢所致人皮肤成纤维细胞衰老表型的影响

目的 观察高表达的β联蛋白对体外过氧化氢（H2O2）所致正常人皮肤成纤维细胞（NHSF）衰老表型的影响。方法 NHSF分别转染pcDNA3.1-β联蛋白或空载体pcDNA3.1,然后150 μmol/L H2O2处理2 h。实验分为转染H2O2处理组（NHSF + β联蛋白 + H2O2）、转空载体H2O2处理组（NHSF + 空载体 + H2O2）以及转空载体组（NHSF + 空载体）。用RT-PCR和Western印迹分析β联蛋白的表达,显微镜观察细胞形态,试剂盒检测衰老相关的β半乳糖苷酶（SA-β-gal）、细胞活性氧（ROS）以及超氧化物歧化酶（SOD）的活性。所有数据均用SPSS 13.0软件进行统计分析,多组间比较采用ANOVA检验。结果 pcDNA3.1-β联蛋白明显上调了NHSF中β联蛋白的表达。NHSF + 空载体 + H2O2组β联蛋白mRNA和蛋白水平（与GAPDH mRNA和蛋白的比值分别为0.2900 ± 0.0195和0.3130 ± 0.0171）明显低于NHSF + 空载体组（分别为0.5963 ± 0.0400和0.6190 ± 0.0090）,两组比较,均P ＜ 0.05;NHSF + β联蛋白 + H2O2组β联蛋白表达水平（0.7953 ± 0.0074）高于NHSF + 空载体 + H2O2组（P ＜ 0.05）。SA-β-gal染色率在NHSF + 空载体组、NHSF + 空载体 + H2O2组、NHSF + β联蛋白 + H2O2组分别为（2.9667 ± 0.2517）%、（37.70 ± 0.9539）%、（29.330 ± 0.6359）%,各组比较,差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。NHSF + 空载体、NHSF + 空载体 + H2O2、NHSF + β联蛋白 + H2O2组ROS活性分别为（50.9963 ± 9.2688）%、（109.9190 ± 11.5215）%、（75.1063 ± 3.0138）%,SOD水平分别为（88.0856 ± 3.9181）、（35.5585 ± 3.4438）、（61.7029 ± 3.1716） U/mg,各组比较,差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。结论 高表达的β联蛋白能够抑制细胞衰老相关β-半乳糖甘酶（SA-β-gal）和细胞活性氧（ROS）的表达,同时上调了SOD的活性。 【关键词】 β连环素; 过氧化氢; 成纤维细胞; 氧化性应激; 细胞衰老     

京尼平苷通过P13K-Akt途径拮抗黑素细胞氧化损伤北大核心CSCD

目的 探讨京尼平苷对体外培养的人黑素细胞氧化损伤的拮抗作用,以及PI3K-Akt途径在其中的作用。方法 取健康青少年环切术后包皮,分离并培养表皮黑素细胞。取第2 ～ 3代黑素细胞,分为对照组（不做任何处理）、京尼平苷组（125 μmol/L京尼平苷处理）、LY294002组（5 μmol/L LY294002处理）、H2O2组（250 μmol/L H2O2处理）、京尼平苷 ＋ H2O2组（125 μmol/L京尼平苷处理24 h后,加入250 μmol/L H2O2作用4 h）、京尼平苷 ＋ LY294002 ＋ H2O2组（125 μmol/L京尼平苷处理24 h后,加入5 μmol/L LY294002作用1 h,然后用 250 μmol/L H2O2作用4 h）。作用完成后,用噻唑蓝（MTT）法检测黑素细胞增殖活性,Western印迹检测Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、血红素加氧酶1（HO-1）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GPx-1）蛋白的表达,生物化学方法检测超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性,流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）含量。通过单因素方差分析（ANOVA）对各组间数据进行比较,采用SNK-q检验进行组间两两比较。结果 H2O2组细胞增殖率较对照组明显降低（P 〈 0.01）,p-Akt（P 〈 0.01）、HO-1（P 〈 0.01）、GPx-1（P 〈 0.05）蛋白表达水平下降,SOD活性、CAT活性降低（均P 〈 0.01）,ROS含量显著升高（P 〈 0.01）。与H2O2组相比,京尼平苷＋ H2O2组黑素细胞增殖率上升（72.98% ± 8.92%比50.53% ± 10.85%,P 〈 0.05）,p-Akt（P 〈 0.05）、HO-1（P 〈 0.01）、GPx-1（P 〈 0.01）蛋白表达上调,SOD［（6.82 ± 1.03） U/mg比（1.29 ± 0.43 ） U/mg,P 〈 0.05］和CAT［（46.08 ± 4.16） U/mg比（18.71 ± 3.09） U/mg,P 〈 0.05］酶活性增高,ROS含量（1 284.33 ± 110.64比2 158 ± 222.75,P 〈 0.01）减少;京尼平苷 ＋ LY294002 ＋ H2O2组黑素细胞增殖率（44.35% ± 14.85%）较京尼平苷 ＋ H2O2组降低（P 〈 0.05）,p-Akt（P 〈 0.01）、HO-1（P 〈 0.05）、GPx-1（P 〈 0.01）蛋白表达下调,SOD活性［（1.31 ± 0.65） U/mg,P 〈 0.05］和CAT活性［（23.25 ± 5.56） U/mg,P 〈 0.05］减弱,ROS含量增加（1 668 ± 62.03,P 〈 0.05）。结论 京尼平苷可通过PI3K-Akt途径促进黑素细胞HO-1和GPx-1表达,增强SOD和CAT活性,拮抗黑素细胞氧化应激损伤。     

重组白介素18抗小鼠系统性白念珠菌感染的研究

目的 探讨重组白介素18在抗小鼠系统性白念珠菌感染中的作用。方法 建立环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠系统性白念珠菌感染动物模型，设置对照组（单纯白念珠菌感染组）与处理组（白念珠菌感染前注射重组白介素18）。用平皿稀释法检测肾脏、脾脏组织菌落形成单位（cfu）数目；制作肾、脾脏组织病理学标本，评估其病理学分级；并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测脾脏干扰素γ分泌水平。结果 感染后2，3，7天，处理组肾脏cfu分别为4.996 ± 0.063，4.765 ± 0.188，3.985 ± 0.133，对照组肾脏cfu分别为5.786 ± 0.110，6.097 ± 0.079，5.996 ± 0.082，处理组显著低于对照组（P < 0.01）；脾脏组织cfu值也低于对照组，但两组差异无统计学意义（P > 0.05）。肾脏组织病理学评分处理组低于对照组，处理组较对照组感染程度减轻，差异有统计学意义（P < 0.05）；脾脏组织病理学评分处理组也低于对照组，但差异无统计学意义（P > 0.05）。同时检测脾脏干扰素γ分泌水平，感染后2，3，7天，处理组分别为73.529 ± 6.070，92.181 ± 7.820，108.564 ± 9.802 pg/mL，对照组分别为40.511 ± 4.456，59.414 ± 5.041，64.455 ± 5.272 pg/mL，处理组明显高于对照组，差异具有统计学意义（P < 0.01）。结论 重组白介素18在小鼠系统性白念珠菌感染中具有保护作用。     

复发性念珠菌颈部淋巴结炎1例易感基因筛查及免疫学研究

【摘要】 目的 探究1例复发性念珠菌性颈部淋巴结炎患者的遗传学病因及抗真菌免疫功能。方法 采用二代测序技术筛查患者及父母真菌病易感基因,提取患者及6例健康对照者外周血单个核细胞（PBMC）以及中性粒细胞,与白念珠菌进行体外共培养,采用Western印迹检测患者PBMC中胱天蛋白募集域蛋白9（CARD9）表达水平,酶联免疫吸附试验检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6、IL-17A、IL-1β和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的分泌水平,菌落计数法检测中性粒细胞处理后白念珠菌存活率。两组间均数比较采用t检验。结果 患者CARD9基因存在2号外显子c.68C>A（p.S23X）和6号外显子c.820dupG（p.D274Gfs*61）复合杂合突变,两突变分别来自其父母。Western印迹显示,健康对照组PBMC中CARD9蛋白相对表达水平为0.41 ± 0.07,而患者表达缺如。热灭活白念珠菌孢子刺激后,患者PBMC的TNF-α、IL-6、IL-17A、IL-1β和GM-CSF分泌水平均低于健康对照组（P < 0.001）。体外培养30、120 min时,与患者中性粒细胞共培养的白念珠菌存活率（78.00%、74.00%）均高于健康对照（70.91% ± 1.75%、34.55% ± 5.35%）,差异有统计学意义（t值分别为3.743、6.988,P <0.05）。结论 1例复发性念珠菌颈部淋巴结炎患者CARD9基因存在复合杂合突变,导致CARD9蛋白表达缺如,该患者存在抗白念珠菌免疫功能缺陷。     

白念珠菌伊曲康唑耐药性与乳酸脱氢酶抗体结合水平的关系研究

目的:探讨白念珠菌与乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)抗体的结合水平与伊曲康唑耐药性的关系.方法:实验用白念珠菌临床株共30株,包括伊曲康唑耐药株、中介株和敏感株各10株,采用P0013B放射免疫沉淀分析裂解液提取白念珠菌总蛋白,应用ELISA法与LDH抗体反应,检测并比较三组菌株与LDH抗体结合的水平.结果:ELISA检测耐药株与LDH抗体相对结合量为348.71±34.36,中介株与LDH抗体相对结合量为327.00±85.60,敏感株与LDH抗体相对结合量为443.43±35.64,三组差异有统计学意义(F=8.52,P＝0.003).结论:白念珠菌耐药株与LDH抗体相对结合量较敏感菌株低,提示白念珠菌与LDH抗体相对结合量下降可能与菌株耐药的发生有关.     

白念珠菌感染对小鼠皮肤Caspase-14表达及屏障功能的影响

目的：检测小鼠皮肤白念珠菌感染时半胱氨酸蛋白酶-14（Caspase-14）的表达,探讨其对皮肤屏障的影响。方法：检测小鼠对照组正常皮肤（C）、受损皮肤（A1）、外用乳酸的受损皮肤（A2）、外用Caspase抑制剂Z-VAD-FMK的受损皮肤（A3）和接种白念珠菌的受损皮肤（A4）在实验前后pH值及经表皮水分流失量（TEWL）的变化。同时分别采用real-time PCR及western blotting检测各组小鼠皮肤的Caspase-14的表达,并比较其差异。结果：C、A1、A2、A3、A4各组处理后即刻及处理后12h的pH值为5.46±0.10、6.82±0.09、5.38±0.12、6.79±0.17、6.65±0.13和5.50±0.11、6.18±0.14、5.76±0.19、6.42±0.26、5.73±0.21,处理后12hTEWL值为27.2±7.3、39.2±8.2、51.0±9.1、47.4±8.5、58.5±9.6。C、A1、A2、A3、A4各组Caspase-14的转录水平分别为1.00±0.07、6.51±0.48、2.92±0.18、7.63±0.27、3.66±0.31,蛋白表达水平分别为1.00±0.12、5.17±0.38、3.24±0.27、6.31±0.33、3.02±0.24,各组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：受损皮肤Caspase-14的表达较正常皮肤明显增高,Caspase-14对受损皮肤屏障功能恢复具有重要作用;而白念珠菌感染可能通过降低皮肤表面pH值,下调受损皮肤Caspase-14的表达,从而影响皮肤屏障功能的恢复。     

咖啡酸衍生物WSY6对黑素细胞氧化应激损伤的保护作用及机制研究

目的 探讨咖啡酸衍生物WSY6对过氧化氢（H2O2）诱导的黑素细胞氧化损伤的保护作用和潜在分子机制。方法 体外培养原代人表皮黑素细胞,分为对照组（不做任何处理）、H2O2组（1 mmol/L H2O2处理）和6.25、12.5、25 μmol/LWSY6组（分别用6.25、12.5、25 μmol/L WSY6预处理1 h后再用1 mmol/L H2O2处理1 h）。继续培养24 h后,用MTS法测定黑素细胞存活率,乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测LDH释放量。部分黑素细胞分为抑制剂组（用p38抑制剂预处理1 h,再用1 mmol/L H2O2处理1 h）和H2O2组（直接用1 mmol/L H2O2处理1 h）,处理完成后继续培养24 h,用试剂盒检测LDH的释放量。部分黑素细胞用25 μmol/L WSY6预处理1、2、4 h后,再用H2O2处理1 h,流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平;部分黑素细胞用6.25、12.5、25 μmol/L WSY6处理1 h后,再用H2O2处理1 h,Western印迹法检测细胞色素C（cyto?c）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase?3）、caspase?9和磷酸化丝裂原活化的蛋白激酶（p?p38 MAPK）、细胞外调节蛋白激酶（p?ERK）及c?Jun氨基末端激酶（p?JNK）的表达。结果 与对照组相比,H2O2组黑素细胞存活率明显降低（29.22% ± 1.31%,P < 0.05）,细胞内LDH释放量增加（47.19% ± 4.85%,P < 0.05）,ROS水平明显升高（18.37 ± 1.59,P < 0.05）,caspase?3和caspase?9的表达亦均升高。与H2O2组相比,6.25、12.5、25 μmol/L WSY6组细胞存活率明显增加（52.48% ± 1.17%、60.21% ± 0.25%、78.32% ± 1.73%,P < 0.05）,LDH释放量明显下降（21.99% ± 0.22%、15.38% ± 0.45%、13.18% ± 0.38%,均P < 0.05）,25 μmol/L WSY6处理1、2、4 h组细胞内ROS显著下降（7.59 ± 1.00、6.22 ± 0.52、5.15 ± 0.48,均P < 0.05）。同时p38抑制剂组黑素细胞LDH释放量较H2O2组显著下降（P < 0.05）。Western印迹法显示,WSY6预处理后,与H2O2组相比,caspase?3和caspase?9表达明显降低,p?p38表达下降,但p?ERK和p?JNK表达无明显变化;同时WSY6组p38 MAPK下游产物p?p53表达也下降,且WSY6浓度越高,下降越明显。结论 WSY6对H2O2诱导的黑素细胞氧化应激损伤有显著的保护作用,可能通过p38 MAPK途径发挥作用。     

申克孢子丝菌酵母相与白念珠菌诱导中性粒细胞活性氧簇的差异性表达

目的 研究人中性粒细胞吞噬申克孢子丝菌酵母相和白念珠菌后胞内活性氧簇（ROS）的实时表达水平及对两者杀菌能力的差异。 方法 应用密度梯度离心法分离人外周血中性粒细胞,并通过ROS探针（DCFH-DA）、流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测申克孢子丝菌酵母相临床株和白念珠菌标准株ATCC 90028作用后,中性粒细胞内ROS的实时表达水平及对上述2种真菌孢子的杀菌率。 结果 申克孢子丝菌酵母相临床株和白念珠菌标准株ATCC 90028作用中性粒细胞60 min后,申克孢子丝菌组中性粒细胞内ROS表达水平达到峰值（平均荧光强度159.67 ± 11.34）,并显著高于白念珠菌组（112.22 ± 9.66）,经LSD-t检验,P < 0.01;而作用120 ～ 180 min后,胞内ROS表达水平（120 min为89.01 ± 9.81;180 min为57.63 ± 8.46）迅速下降,显著低于白念珠菌组中ROS的同期表达水平（120 min时为110.25 ± 7.28;180 min时为109.98 ± 9.00,经LSD-t检验,120 min时P < 0.05,180 min时P < 0.01）。激光共聚焦显微镜观察到,ROS主要表达于吞噬上述真菌孢子的中性粒细胞中,并被募集到被吞噬的部分孢子表面。中性粒细胞对申克孢子丝菌180 min杀菌率（19.21% ± 3.68%）亦显著低于其对白念珠菌孢子的杀菌率（26.63% ± 4.97%）,经LSD-t检验,P < 0.01。 结论 中性粒细胞吞噬上述2种真菌孢子后,胞内ROS呈明显的差异性表达。与白念珠菌相比,中性粒细胞内ROS水平的迅速下降在一定程度上抑制了其对申克孢子丝菌的杀伤效能。 【关键词】 孢子丝菌属; 念珠菌,白色; 中性白细胞; 活性氧