Kcnh6点突变单基因糖尿病家系的小鼠模型构建及表型分析

目的 通过CRISPR/Cas9技术构建Kcnh6基因P235L位点基因敲入定点突变小鼠模型,并验证该突变能否成功复制人类糖尿病家系表型,为接下来研究Kcnh6基因在糖尿病发病中的作用提供更精确的实验工具。方法 设计针对已知糖尿病家系点突变位点的sgRNA(small guide RNA,sgRNA),同时制作一个携带靶位点同源臂、突变位点序列的供体DNA敲入载体。将sgRNA、cas9 mRNA和敲入载体通过显微注射移入小鼠的受精卵,选取其中存活的受精卵将其移植入假孕小鼠子宫,繁育得到子代小鼠。采用聚合酶链反应和基因测序等方法检测子代小鼠Kcnh6基因碱基突变情况。监测基因敲入小鼠的体质量和并对小鼠做糖耐量和胰岛素分泌实验。结果 成功构建Kcnh6-P235L位点基因敲入纯合子小鼠。在高脂饲料喂养条件下,与同窝野生型(wild type, WT)小鼠相比,Kcnh6 基因插入(knock in, KI)点突变小鼠的体质量增加,糖耐量及胰岛素分泌功能受损。结论 成功构建了Kcnh6基因点突变敲入小鼠模型,且此模型具有糖尿病相关表型。     

应用CRISPR/Cas9技术制备MrgD基因敲除小鼠模型

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立MrgD基因敲除的小鼠模型,为研究MrgD基因在糖、脂代谢中的作用提供实验工具。方法 根据MrgD基因第一外显子碱基序列,设计针对MrgD基因的sgRNA（single guide RNA）,构建sgRNA表达质粒,利用T7RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9后,将Cas9 mRNA和sgRNA对C57BL/6J小鼠的受精卵进行显微注射。使用基因测序检测MrgD基因碱基的突变情况。结果 获得了MrgD基因突变的F2代纯合子小鼠,即MrgD基因缺失173bp的小鼠。并且,初步研究显示MrgD基因纯合突变小鼠在普通饲料喂养下糖、脂代谢正常。结论 成功构建了MrgD基因敲除小鼠动物模型,为探讨MrgD基因在糖尿病发生发展中的作用提供研究平台。     

重组pCMV-N-Tudor-SN点突变质粒的构建及表达

?目的: 构建Tudor-SN蛋白的Serine426 (S426)、Serine781 (S781)、Threonine240 (T240) 和Threonine429 (T429)的点突变质粒,并使该重组质粒能够在HeLa细胞中融合表达。 方法:利用定点突变技术,对Tudor-SN蛋白进行S426A、S781A、T240A、T429A点突变,通过双酶切的方法获得Tudor- SN.Mutants 片段,最后将其连入到pCMV-N-Flag载体中。在HeLa细胞中转染该质粒,利用Western blot技术检测质粒表达效率。 结果:（1）重组质粒经双酶切鉴定,可以观察到载体与Tudor-SN.Mutants的条带。 （2）转染突变质粒后可看出HeLa细胞中有Flag蛋白表达。结论:质粒构建成功,可以用于下一步科学研究使用。     

基于CRISPR/Cas9研究RFX6对斑马鱼胰腺发育的影响

目的 构建RFX6基因敲除斑马鱼动物模型及初步探究RFX6对斑马鱼胰腺发育的影响。方法 应用CRISPR/Cas9技术,设计针对靶点的gRNA,诱导靶点突变,经测序鉴定得到突变体。结果 成功构建了RFX6基因敲除斑马鱼动物模型,初步研究发现RFX6纯合突变体生长发育迟滞、体型瘦小、呈现糖尿病消瘦体型并且不能产生后代。结论 RFX6在斑马鱼胰腺的发育中占据重要地位,是控制斑马鱼胰腺发育的关键因子。     

二氢嘧啶脱氢酶基因的T85C和A1627G联合突变对乳腺癌患者预后的影响

目的:探讨二氢嘧啶脱氢酶基因(DPYD)的T85C和A1627G突变对浸润性乳腺癌患者生存的影响。方法:采用SPSS19.0软件进行统计学分析,使用临床资料完整的173例浸润性乳腺癌患者的石蜡包埋组织标本,检测并分析了DPYD基因编码序列的第85位点和第1627位点的核苷酸突变情况,并分析其与患者预后的关系。结果: T85C和A1627G位点联合突变与患者的淋巴结转移状态呈正相关。T85C和A1627G位点单突变对乳腺癌患者预后无影响,而与对照组相比,存在T85C和A1627G位点联合突变的乳腺癌患者预后较差,差异具有统计学意义。结论:中国乳腺癌患者中,DPYD基因T85C和A1627G联合突变与患者的淋巴结转移状态相关,且对患者预后具有重要影响,T85C和A1627G联合突变的患者预后较差。     

肝细胞条件性Eva1a/Tmem166基因敲除小鼠的表型分析

目的 应用Cre-LoxP技术构建自噬相关基因Eva1a肝细胞条件性敲除小鼠初步探讨Eva1a基因敲除对小鼠表型的影响。方法 LoxP标记的Eva1a^flox/+小鼠与Alb-Cre工具鼠通过多次繁殖杂交,构建纯合型肝细胞条件性Eva1a基因敲除(Eva1a^flox/flox: Alb-Cre)小鼠模型。选取Eva1a^flox/flox: Alb-Cre小鼠与同窝野生(Eva1a^flox/flox)小鼠雌雄进行体质量、肝指数、肝脏组织学、肝功能、糖脂代谢以及细胞自噬等表型分析。结果 Eva1a纯合型基因敲除小鼠无胚胎致死现象,出生后一般生理状况良好。常规饲养条件下,肝脏Eva1a基因条件性敲除在小鼠体质量、肝脏外观以及组织结构、肝指数、肝功能、糖脂代谢及自噬等与野生型小鼠差异无统计学意义。结论 肝细胞条件性Eva1a基因敲除对小鼠生理条件下的表型无显著影响,为进一步探讨Eva1a在肝脏疾病状态下的作用及分子机制提供了动物模型。     

空卵泡综合征患者家系的LHCGR基因突变检测及系谱分析

目的 探究促黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体(LHCGR)基因突变与空卵泡综合征(EFS)的关系,指导相关生殖疾病的诊治。方法 通过基因测序对一例EFS的不孕症患者进行LHCGR基因突变和家系分析。结果 该患者LHCGR 基因第11 外显子处存在纯合突变:chr2:48915113A>G,c.1823T>C,p.Leu608Pro,突变使LHCGR 蛋白在第 608 位由亮氨酸(Leucine, Leu)突变为脯氨酸(Proline ,Pro)。对该患者进行家系分析并对其家庭成员测序发现,父母在此位点属于杂合突变,先证者弟弟(46,XY。未育)属于纯合突变,先证者妹妹(育有一女孩、一男孩)属于杂合突变。结论 LHCGR基因突变可导致EFS,进而导致相关生殖疾病的发生。     

微管相关蛋白tau转基因细胞和动物模型的建立及tau蛋白病变表征

目的 构建并表征tau及突变tau蛋白细胞和动物模型,检测模型tau蛋白及磷酸化tau蛋白表达情况及微管的形态,为tau蛋白及相关疾病的研究提供疾病模型。方法 将不同的质粒分别转染到HEK293细胞中,构建过表达野生型tau以及P301L/P301S突变tau的细胞模型。引进并繁育rTg4510小鼠（P301L突变tau转基因小鼠）以及PS19小鼠（P301S突变tau转基因小鼠）。通过Western blotting法检测总tau及磷酸化tau蛋白的表达,应用免疫组织化学的方法检测转基因小鼠脑内磷酸化tau蛋白的表达情况,应用免疫荧光的方法检测HEK293细胞微管形态的变化。结果 本研究成功构建过表达tau蛋白的细胞模型,繁育了两种tau转基因小鼠,在这些模型中tau蛋白表达及tau蛋白的磷酸化水平显著高于对照组。在不同突变类型的细胞和动物模型中,tau蛋白不同位点的磷酸化水平变化以及微管形态变化略有差异。结论 本研究成功构建了P301L/P301S突变tau蛋白的细胞和动物模型,这些模型均表现了显著的tau蛋白过度磷酸化的病变,并引起了细胞微管形态或tau蛋白病理的变化,进而为包括AD在内的tau蛋白病变提供了实验模型。     

PSMD6基因rs831571位点多态性与2型糖尿病易感性的病例对照研究

目的 探讨PSMD6基因rs831571位点多态性与河南汉族人群2型糖尿病(T2DM)易感性的关系以及基因-环境危险因素的交互作用。 方法 研究对象来自“农村糖尿病、肥胖及生活方式”研究。从中选取T2DM患者1 052例,作为T2DM组,按年龄(±3岁)同性别进行1∶1匹配;选取非T2DM患者1 052例,作为对照组。使用SNPscan^TM高通量SNP分型技术对PSMD6基因rs831571位点进行分型。采用Logistic回归分析基因多态性与T2DM的关联强度及PSMD6基因-环境危险因素对T2DM的交互作用。 结果 T2DM组和对照组PSMD6基因rs831571位点基因型频率分布差异有统计学意义(P<0.05)。调整相关影响因素后,rs831571位点TT(OR=0.623, 95%CI: 0.456~0.853)和CT+TT(OR=0.825, 95%CI: 0.685~0.995)基因型携带者T2DM易感性降低。联合作用结果显示,携带PSMD6突变基因型且中重度体力活动者或携带PSMD6突变基因型且BMI正常者,T2DM的患病风险降低,但PSMD6基因-体力活动以及PSMD6基因-BMI在T2DM的发生中没有交互作用(P>0.05)。 结论 PSMD6基因rs831571位点多态性与T2DM易感性有关,携带PSMD6突变基因型且中重度体力活动者或携带PSMD6突变基因型且BMI正常者,T2DM的患病风险降低,PSMD6基因-体力活动以及基因-BMI对T2DM的发生无交互作用。     

白假丝酵母ERG11基因突变分析

目的 探讨白假丝酵母氟康唑作用的靶酶编码基因(ERG11)突变与氟康唑耐药性的关系。方法 选择从尿道、阴道、口咽部、呼吸道、血液和前列腺液分离的10株氟康唑耐药白假丝酵母菌和3株敏感菌株,以抽提的白假丝酵母菌基因组DNA为模板,对ERG11基因序列进行PCR扩增,PCR产物直接DNA序列测定,最后应用BLAST和ClustalW软件对测序结果进行比较。结果 13株白假丝酵母菌的ERG11基因序列(以已知序列第1个ATG起始密码的A作为第1个记数单位)共有21个位点发生突变,其中17个同义突变位点和4个错义突变位点;在第348bp位点和第383bp位点,耐药菌株和药物敏感株均可发生D116E和K128T变异;在靶酶活性中心血色素结合区和疏水端螺旋区的对应基因片段,耐药株在第1309bp位点可致V437I变化;在第1320bp位点耐药菌株发生碱基突变,形成A、C基因杂合子,有可能导致N440K变化。结论 (1)ERG11基因的D116E和K128T位点变异可能与白假丝酵母菌耐药无关;(2)ERG11基因的V437I和N440K位点的改变,可能与耐药形成有关。     

利用CRISPR/Cas9技术建立NOD/SCID/IL2Rγ-/-免疫缺陷小鼠

目的NOD/SCID/IL2Rγ-（/- NSG）小鼠品系是最严重的免疫缺陷品系,广泛应用于异种移植的研究。然而,SCID突变是 Prkdc 基因的一个自发性突变,会导致T细胞发育阻滞后渗漏而且很难进行基因型鉴定。因此,开发一个敲除Prkdc和IL2Rγ基 因的新品系NSG小鼠非常重要。方法使用CRISPR/Cas9系统实现Prkdc和IL2Rγ基因的靶向敲除。将基因敲除小鼠与NOD 背景小鼠杂交,我们产生了新品系NOD/SCID/IL2Rγ-（/- NSG）小鼠,称为cNSG（中国NSG）小鼠。结果cNSG 小鼠完全缺乏T 细胞,B细胞以及NK细胞而且表达NOD突变。体内成瘤实验证实cNSG鼠是一种比免疫缺陷裸鼠更有效的异种移植模型。 结论cNSG 小鼠与Jackson实验室的NSG鼠的免疫缺陷一致,有望成为中国生物医学研究的重要异种移植模型。     

MYH9综合征的免疫荧光检测与基因分析

目的研究两个MYH9综合征家系中性粒细胞包涵体的本质及基因突变。方法瑞氏染色观察先证者及其家系患者的外周血片血小板和中性粒细胞的特殊形态。间接免疫荧光方法结合DAPI复染技术观察正常对照和患者血片非肌性肌球蛋白11A的亚细胞定位。从先证者及家系成员外周血中自细胞中提取基因组DNA，PCR扩增MYH9的40个外显子及侧翼内含子序列，检测其基因突变。结果患者外周血片中性粒细胞胞浆中可见明显团块状、半月形的绿色荧光聚集，其大小、位置与瑞氏染色的中性粒细胞包涵体相同。Fechtner综合征MYH9基因改变为外显子40第5981位核苷酸C→T杂合改变，使第1933位密码子（CGA，编码Arg）突变为终止密码TGA。May-Hegglin异常MYH9基因改变为外显子38第5701位核苷酸G—A杂合改变。使1841位各氨酰氨变为赖氨酸。结论建立了诊断MYH9综合征的一种独特的免疫荧光方法。R1933X和E1841K杂合改变是导致Fechtner综合征和May-Hegglin异常的原因。     

Unc13基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠模型的构建和鉴定

目的 构建Cre重组酶系统调控的Unc13基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠,为Unc13基因在胰岛素分泌中扮演的角色和作用机制的体内实验研究提供更特异的动物模型。方法 运用CRISPR/Cas9技术构建Unc13^flox/flox转基因小鼠,将其与胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶（Ins2-cre）工具鼠进行杂交,采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）和测序等方法对其子代小鼠的基因型进行鉴定,并对该基因敲除（knock out,KO）小鼠及其同窝野生（wild type,WT）小鼠的体质量、糖耐量、胰岛素分泌水平进行测定。结果 成功构建胰岛β细胞特异性Unc13基因条件性敲除小鼠（以下简称为Unc13 KO鼠）。进一步研究显示Unc13 KO鼠与WT鼠相比,体质量无明显变化,但糖耐量受损,胰岛素第一时相分泌下降。结论 成功构建了Unc13基因胰岛β细胞条件敲除小鼠动物模型,为探讨Unc13基因在糖尿病发生、发展中的作用提供研究平台。     

中药益肾平肝方对脱髓鞘模型小鼠社会交互行为的影响及作用靶点

目的 观察中药益肾平肝方对精神分裂症的治疗效果以及探究其作用的潜在靶标。方法 实验动物采用成年雄性C57BL/6小鼠,6周龄,实验分为3组,每组10只：对照组,cuprizone（CPZ）模型组和益肾平肝方（Yishenpingganfang,YSPGF）治疗组,实验共进行6周。社会交互实验以及组织采集在最后一次给予中药治疗24h后进行。采用社会交互实验以评价YSPGF对小鼠精神分裂症样行为的影响;采用髓鞘特异性免疫组化和Western blotting观察成熟少突胶质细胞及少突胶质细胞前体细胞的表达变化。结果 CPZ模型组小鼠于第3周出现明显体质量下降（P<0.05）,YSPGF治疗组与CPZ模型组相比,体质量差异无统计学意义（P>0.05）;社会交互实验：Trial 1实验中：对照组小鼠围绕陌生小鼠1（Stranger 1）的时间明显大于围绕空杯子（Empty）的时间（P<0.001）。YSPGF组与对照组类似,围绕Stranger 1与Empty的时间差异有统计学意义（P<0.01）。但模型组小鼠围绕Stranger 1与Empty的时间之间差异无统计学意义（P>0.05）。Trial 2实验中：对照组小鼠对新加入的Stranger 2较之已经熟悉的Stranger 1更加感兴趣（P<0.001）第;成熟少突胶质细胞特异性抗体髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）免疫组织化学染色和Western blotting显示：CPZ模型组小鼠成熟胶质细胞/髓鞘在胼胝体有一定程度缺失,YSPGF组与CPZ模型组相比,髓鞘脱失有所好转。进一步实验显示：少突胶质细胞前体细胞血小板源生长因子受体α（platelet-derived growth factor receptor-alpha,PDGFR-α）在CPZ诱导脱髓鞘后有反应性增生。结论 中药YSPGF可以改善CPZ诱导小鼠的社会退缩,改善少突胶质细胞/髓鞘结构的损害。     

一起学校甲型H1N1流感聚集疫情的流行特征和全基因组测序分析

目的 了解济宁市一起聚集流感疫情的甲型H1N1流感病毒全基因组特征,为甲型H1N1流感防控提供依据。方法 对在一起聚集流感疫情采集的12份患者咽拭子标本进行流感病毒实时荧光定量PCR法核酸检测,对阳性标本进行病毒培养和全基因组测序,利用DNASTAR软件分析核苷酸和氨基酸同源性,利用MEGA软件构建进化树,利用NetNGlyc、GPS-SUMO、NetPhos软件分别分析糖基化位点、类泛素蛋白修饰分子化位点和磷酸化位点。结果 12份咽拭子标本中,4份标本甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性,分离流感病毒株4株。同2018—2019年度北半球疫苗株A/Brisbane/02/2018相比,8个基因节段核苷酸同源性范围为98.5%～99.8%;编码的10种蛋白氨基酸同源性范围为98.2%～100.0%。在进化树上,4株毒株位于两个进化簇,其中3株毒株位于同一进化簇,1株毒株位于不同进化簇。4株毒株编码的10种蛋白共发生50处氨基酸位点置换,血凝素蛋白抗原表位2个氨基酸位点发生置换,神经氨酸酶蛋白酶活性位点和神经氨酸酶抑制剂耐药位点均未发生变异,聚合酶酸性蛋白、聚合酶碱性蛋白1和聚合酶碱性蛋白2...     

Effects of TYROBP Deficiency on Neuroinflammation of a Alzheimer’s Disease Mouse Model Carrying a PSEN1 p.G378E Mutation

ObjectiveTo study the effects of TYRO protein kinase-binding protein (TYROBP) deficiency on learning behavior, glia activation and pro-inflammatory cycokines, andTau phosphorylation of a new Alzheimer’s disease (AD) mouse model carrying a PSEN1 p.G378E mutation.MethodsA new AD mouse model carrying PSEN1 p.G378E mutation was built based on our previously found AD family which might be ascribed to the PSEN1 mutation, and then crossed with TYROBP deficient mice to produce the heterozygous hybrid mice (PSEN1^G378E/WT; Tyrobp^+/–) and the homozygous hybrid mice (PSEN1^G378E/G378E; Tyrobp^–/–). Water maze test was used to detect spatial learning and memory ability of mice. After the mice were sacrificed, the hippocampus was excised for further analysis. Immunofluorescence was used to identify the cell that expresses TYROBP and the number of microglia and astrocyte. Western blot was used to detect the expression levels of Tau and phosphorylatedTau (p-Tau), and ELISA to measure the levels of pro-inflammatory cytokines.ResultsOur results showed that TYROBP specifically expressed in the microglia of mouse hippocampus. Absence of TYROBP in PSEN1^G378E mutation mouse model prevented the deterioration of learning behavior, decreased the numbers of microglia and astrocytes, and the levels of interleukin-6, interleukin-1β and tumor necrosis factor-α in the hippocampus (all P < 0.05). The ratios of AT8/Tau5, PHF1/Tau5, pT181/Tau5, pT231/ Tau5 and p-ERK/ERK were all higher in homozygous hybrid mice (PSEN1^G378E/G378E; Tyrobp^–/– mice) compared with PSEN1^G378E/G378E mice (all P < 0.05).ConclusionsTYROBP deficiency might play a protective role in the modulation of neuroinflammation of AD. However, the relationship between neuroinflammation processes involving microglia and astrocyte activation, and release of pro-inflammatory cytokines, and p-Tau pathology needs further study.     

小鼠脂肪组织中免疫细胞分离方法的优化及亚群在肥胖小鼠中的作用

目的 尝试提供一种高效的、低损伤的分离脂肪组织免疫细胞的方式,以期为肥胖过程中免疫学机制的研究提供技术支持。方法 首先分离正常小鼠附睾周围的脂肪组织,并采用机械研磨或酶消化(包括Ⅱ型/Ⅳ胶原酶、Liberase酶)的方式分离其中的免疫细胞,并结合流式细胞检测技术筛选最高效的免疫细胞分离方式。再通过高脂饮食(high fat diet,HFD)建立肥胖小鼠模型,并进一步分析肥胖过程中,小鼠脂肪组织中巨噬细胞及T淋巴细胞的比例及亚群变化。结果 比较不同酶消化及机械研磨方式发现,通过高纯度的Liberase酶消化的方式获得CD45⁺免疫细胞死亡率最低,活细胞数最多;而通过机械研磨方式获得免疫细胞死亡率最高,活细胞数最低。与正常饮食小鼠相比,肥胖小鼠脂肪组织中固有免疫细胞如中性粒细胞、巨噬细胞比例增加,尤其是M1型巨噬细胞比例增加,M2型降低,同时巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)增加,髓样细胞表达激发受体1(triggering receptor expressed on myeloid cells 1,TREM1)表达增加。而适应性免疫细胞中,T淋巴细胞比例增加,特别是Th1/Treg细胞的比例增加最为明显。结论 建立了一种从小鼠脂肪组织中高效获取有活力的免疫细胞的方法,并证实肥胖小鼠脂肪组织中巨噬细胞、T淋巴细胞比例增加,促炎作用增强,它们在诱发脂肪组织炎症反应中发挥重要作用。