早老蛋白增强子2基因沉默对HaCaT细胞增殖及γ分泌酶表达的影响

目的:构建早老蛋白增强子2（PSENEN）基因沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）模型,探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法:设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列,与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒,经酶切及测序鉴定后,进行慢...     

nicastrin基因沉默的HaCaT细胞基因表达谱分析

【摘要】 目的 通过沉默人永生化角质形成细胞HaCaT细胞中nicastrin（NCSTN）基因的表达,研究其下游细胞增殖及分化相关信号通路的改变。方法 将HaCaT细胞分为干扰组、阴性对照组和空白对照组：干扰组转染特异性NCSTN-siRNA,阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组转染等量转染试剂。实时PCR及Western印迹检测各组NCSTN mRNA和蛋白表达验证转染效率。运用Agilent人类全基因组表达谱芯片技术研究干扰组HaCaT细胞基因表达谱与阴性对照组之间的差异,以表达上调或者下调倍数 ≥ 2.0且P ≤ 0.05为标准,将差异基因用GO分析进行富集,筛选出表达差异显著且与角质形成细胞增生分化相关的基因,用实时PCR验证结果。结果 干扰组HaCaT细胞NCSTN mRNA及蛋白相对表达量分别为0.287 ± 0.090、0.443 ± 0.085,明显低于阴性对照组（0.969 ± 0.127、1.047 ± 0.114）以及空白对照组（1.000 ± 0.151、1.000 ± 0.111）,差异均有统计学意义（F值分别为30.787、31.139,P值均为0.001）。表达谱芯片显示,与阴性对照组相比,干扰组表达下调基因605条,上调基因444条。GO分析显示,干扰后差异表达基因富集到上皮发育、上皮细胞分化、角质形成细胞分化、角化4种生物学过程。对表达差异显著且与角质形成细胞增生分化相关的Sprouty相关蛋白2基因、表皮生长因子7基因、胰岛素样生长因子结合蛋白5基因、人Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶2基因和骨形成发生蛋白6基因通过实时PCR验证,验证结果与芯片结果显示的差异趋势一致。结论 NCSTN基因功能缺失有可能通过调节其下游细胞增殖及分化相关信号通路的表达,影响角质形成细胞的正常增殖和分化。     

维胺酯对HaCaT细胞增殖和分化的影响

目的 探讨维胺酯对体外培养角质形成细胞(HaCaT细胞)增殖和分化的影响.方法 将浓度为2,5,10,15,20,25,30 μg/mL的维胺酯作用于培养的HaCaT细胞,采用MTT法检测维胺酯对HaCaT细胞体外增殖的影响,流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率变化,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测分化标记物角蛋白10及内披蛋白mRNA的表达水平.结果 2 μg/mL维胺酯处理的HaCaT细胞,48 h时表现出对细胞增殖的抑制作用,随着时间延长和药物剂量加大,抗增殖作用愈明显;当药物质量浓度达到30 μg/mL时,48 h和72 h时的抑制率分别为57.67%和82.00%.与对照组相比,经维胺酯作用48 h后,细胞G₁期比例显著增加,S期与G₂期比例则显著下降,并可抑制G₁/G₂期转换,但对细胞凋亡无影响.细胞内披蛋白mRNA表达水平随维胺酯处理浓度增高而上升,药物浓度达30μg/mL时,表达水平由对照组的40.80%增高至156.12%;而角蛋白10 mRNA表达水平则下降,由96.46%降至14.60%.结论 维胺酯具有抑制角质形成细胞增殖及诱导其分化的作用.     

p53基因沉默对HaCaT细胞MicroRNA表达谱的影响

目的 研究p53基因沉默前后HaCaT细胞microRNA（miRNA）的差异表达谱并进行相关功能分析。方法 利用慢病毒介导的RNAi对培养的HaCaT细胞株进行p53基因沉默,通过Trizol法抽提细胞总RNA,PEG（聚乙二醇）方法分离miRNA,T4RNA连接酶荧光标记后进行miRNA芯片杂交,利用Genepix 4000B 图像分析软件和Genepix Pro 6.0软件进行数据分析,生物信息学方法检索出p53基因沉默前后HaCaT细胞差异表达的miRNA调控的靶基因,选取每个miRNA调控的前20个靶基因进行靶基因功能及KEGG分析。结果 p53基因沉默前后HaCaT细胞中发现53个差异表达的miRNA,其中41个表达上调,12个下调（差异 ＞ 2倍）。上调超过200倍的miRNA有：hsa-miR-141-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-19a-3p;下调超过75%的miRNA有：hiv1-miR-TAR-3p、hsa-miR-630、hsa-miR-1246、hsa-miR-1275。靶基因预测和靶基因KEGG分析结果显示,部分靶基因与MAPK信号通路、代谢通路、肿瘤侵袭等有关。结论 hsa-miR-141-3p等9个miRNA及其调控的靶基因可能参与p53的分子调控。 【关键词】 基因,p53; 角蛋白细胞; 微RNAs; 基因沉默; 芯片分析技术     

降钙素基因相关肽对HaCaT细胞增殖和分泌神经生长因子的影响

目的研究降钙素基因相关肽(CGRP)对HaCaT细胞增殖和神经生长因子(NGF)分泌的影响。方法以不同浓度(10-10～10-7mol/L)的CGRP作用于HaCaT细胞,MTT法检测HaCaT细胞增殖情况,ELISA法检测细胞上清液中NGF浓度的变化。结果CGRP促HaCaT细胞增殖作用的强度与CGRP的浓度和作用时间有关:CGRP浓度为10-10～10-8mol/L时,其促增殖作用呈浓度依赖性;当浓度上升至10-7mol/L时促增殖作用反而减弱;CGRP作用48h促增殖作用最强。HaCaT细胞上清液中NGF浓度随CGRP浓度升高和作用后时间延长而增加。结论CGRP可促进HaCaT细胞增殖和分泌NGF。NGF分泌增加可能是CGRP促进HaCaT细胞增殖的原因之一。     

慢病毒介导shRNA沉默Nicastrin基因的人永生化角质形成细胞模型构建

目的 构建Nicastrin(NCT)基因的RNA干扰慢病毒表达载体,并在人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)上鉴定其沉默效率,构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型,为后续研究NCT基因下调对角质形成细胞的生物学行为影响奠定实验基础.方法 设计3个靶向NCT基因特异性短发卡RNA(shRNA)表达序列并连接到慢病毒表达质粒pGLV3/H 1/GFP+ Puro中,成功构建慢病毒重组表达质粒,并通过测序鉴定.将构建的重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒,并测其滴度.将HaCaT细胞分为空白组(未感染病毒)、阴性对照组(NC组,感染空载病毒LV3-shNC)和干扰组(感染NCT-shRNA1、2、3慢病毒).流式细胞仪检测慢病毒转染效率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western印迹检测靶基因的沉默效率,筛选出沉默效果最佳的干扰序列.结果 测序表明,NCT-shRNA慢病毒重组表达质粒构建成功.重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生的慢病毒颗粒滴度为109 TU/ml.慢病毒感染HaCaT细胞后,流式细胞仪检测,慢病毒转染效率大于95％.qRT-PCR结果,与NC组相比,干扰组NCT mRNA表达量明显下降,其中NCT-shRNA1组NCT基因沉默效果最佳,干扰效率达到75％.Western印迹结果,与NC组相比,shRNA1组NCT蛋白表达抑制率为71.7％.结论 成功筛选出高效NCT-shRNA干扰序列,构建NCT-shRNA慢病毒重组表达载体,并构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型.     

决银方对HaCaT细胞增殖及细胞周期的影响北大核心CSCD

目的观察决银方对HaCaT细胞增殖及细胞周期的影响。方法用CCK-8法检测1%,2%,5%和10%浓度决银方作用HaCaT细胞后细胞增殖的变化,以相同体积的DMEM作为空白对照;用流式细胞仪检测1%,2%,5%和10%浓度决银方作用HaCaT细胞后细胞周期的变化,以相同体积的DMEM作为空白对照。结果 CCK-8法检测显示5%浓度的决银方作用HaCaT细胞24h,细胞增殖受到明显抑制(P<0.05);流式细胞仪检测显示,5%浓度的决银方作用于HaCaT细胞24h,G_1期细胞比例明显减少(P<0.05)。结论 5%浓度的决银方对HaCaT细胞增殖有明显抑制作用,其主要作用在细胞周期的G_1期。     

紫外线对HaCaT细胞中瞬时受体电位锚蛋白1的影响

目的 探讨HaCaT细胞中瞬时受体电位锚蛋白1(TRPA1)的光控作用及其机制.方法 培养的HaCaT细胞分为225 mJ/cm2 UVA刺激组和25 mJ/cm2UVB刺激组,UVA刺激组分为空白对照组(仅有HaCaT细胞)、视黄醛组、UVA组、视黄醛+UVA组(UVA-TRPA1对照组)、视黄醛+UVA+肉桂醛组(UVA-TRPA1激动组)、视黄醛+UVA+樟脑组(UVA-TRPA1抑制组);UVB刺激组分为空白对照组(仅有HaCaT细胞)、视黄醛组、UVB组、视黄醛+UVB组(UVB-TRPA1对照组)、视黄醛+ UVB+肉桂醛组(UVB-TRPA1激动组)、视黄醛+UVB+樟脑组(UVB-TRPA1抑制组).qPCR、Western印迹检测HaCaT细胞中TRPA1的表达.流式细胞仪检测各组HaCaT细胞钙离子内流的变化.结果 qPCR和Western印迹显示,HaCaT细胞中有TRPA1 mRNA及蛋白的表达.UVA作用后空白对照组、视黄醛组、UVA组、视黄醛+UVA组荧光强度分别为155.06±7.62、148.37±18.77、166.92±3.71、331.333±40.563,组间差异有统计学意义(F=44.509,P＜0.01).UVB作用后空白对照组、视黄醛组、UVB组、视黄醛+UVB组荧光强度分别为150.20±1.73、171.66±56.23、147.56±6.60、250.44±9.13,组间差异有统计学意义(F=85.261,P＜ 0.01),视黄醛+UVA/UVB组荧光强度均高于空白对照组(q值分别为18.442、6.052,P＜0.01).TRPA1激动剂和拮抗剂可调节UVA、UVB所引起的钙离子内流的变化(P＜ 0.001),在UVA、UVB作用下,TRPA1激动剂组荧光强度均高于对照组(q值分别为14.934、32.770,P＜0.001),TRPA1抑制剂组荧光强度均低于对照组(q值分别为7.986、14.596,P＜0.001).结论 TRPA1在皮肤HaCaT细胞中有表达,UVA或UVB可通过TRPA1调控HaCaT细胞的钙离子内流.     

角质形成细胞生长因子对HaCaT细胞增殖的影响

目的:研究角质形成细胞生长因子(KGF)对HaCaT细胞增殖的影响,探讨KGF与银屑病表皮过度增殖的关系。方法:利用HaCaT细胞体外培养,采用KGF为增殖诱导剂,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测不同浓度的KGF对HaCaT细胞增殖率的影响;检测KGF对细胞生长曲线及细胞集落形成的影响。结果:MTT实验表明,KGF可刺激HaCaT细胞增殖,刺激作用呈浓度依赖性(r=0.981,P<0.05);10 ng/mL KGF作用下HaCaT细胞的生长速度较对照组明显加快(P<0.05),集落形成率较对照组增加(P<0.05),且细胞呈明显的增殖形态,形成的集落较大,集落内细胞多呈星状,胞内染色质丰富。结论:KGF具有显著的促HaCaT细胞增殖作用,银屑病皮损区域KGF表达增加可能是引起表皮过度增殖的重要致病因子。     

依曲替酸和黄芪对HaCaT细胞增殖及细胞周期的影响

目的: 研究依曲替酸和黄芪对HaCaT细胞增殖及凋亡的影响.方法: 采用MTT比色法检测依曲替酸和黄芪对HaCaT细胞增殖的影响;应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡并于透射电镜下观察凋亡细胞形态.结果: 依曲替酸和黄芪均对HaCaT细胞增殖有明显的抑制作用;在一定浓度范围内其抑制率呈时间和剂量依赖性,但黄芪的抑制率较依曲替酸为低.细胞明显阻滞于G1期,有明显的凋亡峰出现,电镜下见典型的凋亡细胞形态学特征.结论: 依曲替酸和黄芪均可抑制HaCaT细胞的增殖并诱导其凋亡,提示二者治疗银屑病机制可能与此有关.     

Novel Mutation of the NCSTN Gene Identified in a Chinese Acne Inversa Family

Acne inversa is a chronic inflammatory follicular disease with autosomal dominant inheritance. In recent years, many functional mutations in the NCSTN genes have been identified as the cause of familial acne inversa. Herein, we recruited four patients and seven unaffected individuals from a Chinese family and performed Sanger sequencing of the NCSTN gene. One novel frameshift mutation, c.450_459del (p.Ser 151GlnfsX48), was identified in exon 5 of the NCSTN gene. Three normal-looking children carrying the mutation were proven to be patients. We also presented a literature review from previous studies of acne inversa, suggesting that NCSTN is a hotspot gene for acne inversa. Most affected individuals experienced onset in adolescence. We confirmed the diagnosis in this family based on the mutation. This finding will help expound the relationship between the NCSTN gene and the pathogenesis of acne inversa and emphasize the value of genetic diagnosis in monogenic disorder.     

贝伐珠单抗对HaCaT细胞凋亡及周期的影响

目的:评价贝伐珠单抗对HaCaT细胞凋亡的影响。方法:体外培养HaCaT细胞,不同浓度贝伐珠单抗分别作用:HaCaT细胞48 h后,Hoechst 33258荧光染色法观察贝伐珠单抗诱导HaCaT细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术检测贝伐珠单抗HaCaT细胞凋亡及细胞周期的影响。结果:贝伐珠单抗处理HaCaT细胞48 h后,Hoechst 33258荧光染色显示细胞核染色质凝聚、边集、核裂解;流式细胞术检测结果显示细胞凋亡增加,G0/G1期细胞的比例增加。结论:贝伐珠单抗可诱导HaCaT细胞凋亡,同时可有效阻滞HaCaT细胞的周期进程,细胞周期被阻滞在G0/G1期。     

鳄梨油和橄榄油对HaCaT细胞增殖和分化的影响

目的 探讨天然植物鳄梨油和橄榄油对HaCaT细胞系增殖及分化的影响。方法 将培养的HaCaT细胞分为鳄梨油组、橄榄油组及对照组。应用MTT实验确定鳄梨油和橄榄油对HaCaT细胞的适用剂量。以免疫细胞化学、免疫斑点印迹技术分别检测各组HaCaT细胞的c-myc原癌基因（c-myc）、有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）、NF-κB、丝聚蛋白、内披蛋白、角蛋白10的表达。结果 对照组c-myc、MAPK、NF-κB免疫化学反应的扫描灰度均值（GSM）分别为101.9 ± 8.9、91.4 ± 5.1、94.3 ± 7.0,鳄梨油组分别为131.4 ± 6.6、136.3 ± 4.5、134.3 ± 5.2,与对照组比较均显著增加（P < 0.05）;橄榄油组分别为121.1 ± 4.5、107.9 ± 7.3、106.4 ± 5.4,与对照组比较均亦显著增加（P < 0.05）;而鳄梨油组与橄榄油组相比,前者各项GSM均高于后者（P < 0.05）。鳄梨油组和橄榄油组丝聚蛋白、内披蛋白、角蛋白10免疫化学反应的GSM均高于对照组（P < 0.05）;而鳄梨油组与橄榄油组相比,后者均高于前者（P < 0.05）。此外,各组各项免疫斑点印迹的GSM与免疫细胞化学的GSM数据基本相符,在鳄梨油组两者呈显著正相关,r = 0.94,P < 0.01;在橄榄油组两者也呈现显著正相关,r = 0.97,P < 0.01。结论 一定浓度鳄梨油和橄榄油,尤其是鳄梨油对HaCaT细胞可呈现显著的促生长、增殖效应;橄榄油和鳄梨油,尤其橄榄油对HaCaT细胞可呈现显著的促分化效应。     

龙胆草对HaCaT细胞增殖和凋亡及表皮生长因子受体磷酸化的影响

【摘要】 目的 探讨龙胆草提取物对表皮生长因子（EGF）刺激后HaCaT细胞增殖和凋亡及表皮生长因子受体（EGFR）磷酸化的影响。 方法 取0 ~ 50 g/L龙胆草提取物作用于EGF刺激后的HaCaT细胞24 h,噻唑蓝法检测细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western印迹法检测磷酸化EGFR。 结果 龙胆草提取物浓度依赖性地抑制EGF刺激后HaCaT细胞的增殖（r = -0.991,P < 0.01）,促进EGF刺激后HaCaT细胞的凋亡（r = 0.996,P < 0.05）。同时,龙胆草提取物使EGF刺激后的HaCaT细胞EGFR的磷酸化水平降低,该作用随着药物浓度的增加而增加。 结论 龙胆草可能通过降低EGFR的磷酸化,阻断相关细胞内信号通路来抑制角质形成细胞的过度增殖并促进细胞的凋亡。     

本维莫德对HaCaT细胞增殖、炎症因子分泌及皮肤屏障因子产生的影响

【摘要】 目的 研究本维莫德对人角质形成细胞增殖、炎症细胞因子分泌、皮肤屏障蛋白合成以及信号转导与转录激活蛋白1（STAT1）磷酸化的影响。方法 体外培养HaCaT细胞,采用0.1 ~ 1 000 μmol/L本维莫德处理24 h,用CCK8法检测细胞增殖。部分HaCaT细胞分为6组,对照组仅加入DMEM培养基,刺激剂组加入10 μg/L肿瘤坏死因子α（TNF-α）和干扰素γ（IFN-γ）,本维莫德组加入10 μg/L TNF-α和IFN-γ以及终浓度为1 ~ 10或1 ~ 100 μmol/L本维莫德,AhR拮抗剂组加入10 μg/L TNF-α和IFN-γ、10或100 μmol/L本维莫德以及10 nmol/L StemRegenin1（SR1）,处理24 h后,酶联免疫吸附实验检测细胞培养上清液中白细胞介素（IL）-4、IL-10、IL-22和胸腺活化调节趋化因子（TARC）的水平,RT-PCR检测HaCaT细胞芳香烃受体（AhR）、细胞色素P450 1A（CYP1A1）、聚丝蛋白、内披蛋白、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）和TARC mRNA的表达水平,Western印迹法检测聚丝蛋白、内披蛋白、TSLP和STAT1及磷酸化STAT1（p-STAT1）的蛋白表达水平,免疫荧光检测本维莫德对HaCaT细胞中AhR核转位的影响。计量资料采用非配对Student t检验和单因素方差分析进行比较,Spearman检验分析各指标间的关系。结果 0.1、1、10、100、1 000 μmol/L本维莫德干预HaCaT细胞24 h后,细胞存活率分别为（90.2 ± 2.4）%、（85.4 ± 11.9）%、（52.8 ± 14.0）%、（39.4 ± 7.9）%、（27.5 ± 3.4）%,各组间差异有统计学意义（F = 162.5,P < 0.001）,50%抑制浓度为48.54 μmol/L。与刺激剂组相比,10和100 μmol/L本维莫德组HaCaT细胞分泌的IL-10水平上升（F = 16.110,P < 0.001）,但100 μmol/L组IL-22（F = 6.884,P < 0.001）和10、100 μmol/L组 TARC水平（F = 7.052,P < 0.001）显著下降。与刺激剂组相比,1 和10 μmol/L本维莫德组CYP1A1 mRNA表达（P = 0.004）和10 μmol/L本维莫德组FLG mRNA表达（P = 0.040）水平显著增高,而10 μmol/L组 TARC mRNA和10 μmol/L组TSLP mRNA表达显著降低（均P < 0.01）,而刺激剂组和本维莫德组间AhR mRNA的表达差异无统计学意义（P = 0.193）。与刺激剂组相比,10 μmol/L本维莫德组聚丝蛋白（P = 0.020）和1、10 μmol/L本维莫德组内披蛋白表达水平（P < 0.001）显著上升,而10 μmol/L TSLP蛋白表达水平显著下降（P < 0.001）,1和10 μmol/L本维莫德组p-STAT1蛋白表达水平显著下降（P < 0.001）。与100 μmol/L 本维莫德组相比,AhR拮抗剂组IL-10分泌水平显著下降（t = 4.794,P = 0.003）,TSLP mRNA的表达显著上升（t = 3.769,P = 0.005）;与10 μmol/L 本维莫德组相比,AhR拮抗剂组 IVL蛋白表达显著下降（t = 5.117,P = 0.002）,TSLP蛋白表达显著上升（t = 3.117,P = 0.043）, p-STAT1蛋白表达无明显变化（t = 1.400,P = 0.719）。免疫荧光染色显示对照组和1 μmol/L本维莫德组中AhR绿色荧光主要表达于HaCaT细胞胞质中,细胞核中基本无荧光表达;而在10 μmol/L和20 μmol/L本维莫德组HaCaT细胞的细胞质和细胞核均可见高密度绿色荧光。结论 本维莫德可通过活化AhR信号通路抑制HaCaT细胞增殖,调节炎症因子分泌,上调皮肤屏障相关因子的产生和抑制STAT1磷酸化。