编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体.为进一步研究其蛋白功能提供工具.方法:穿梭质粒pAdTrack-CMV-PGC1α线性化后与骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183菌中完成同源重组,筛选并提取重组正确的腺病毒质粒,PacI线性化,脂质体转染293细胞包装出成熟的具有感染活力的腺病毒颗粒,TCID50法测定病毒滴度,Western bloting检测PGC1α蛋白在293细胞的表达.结果:测序及酶切鉴定表明目的基因正确插人穿梭质粒,读码框未发生移位.重组腺病毒扩增后滴度约3×1010TCID50/ml,能在293细胞中表达PGC1α蛋白.结论:利用细菌内同源重组的方法成功构建了编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体,并观察到其蛋白表达.     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DehaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法从pcDNA3-DeltaNp73α—HA中酶切出DehaNp73α基因，并插入pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒；pAdTrack-CMV—DehaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli．BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒，PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒；并在293T细胞中反复扩增；增强离心法转染树突状细胞，Western blot检测目的蛋白的表达。结果经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒；Western blot检测出预期相对分子质量为67×10^3的特异条带。结论成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组病毒。     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的 利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DeltaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒.方法 从pcDNA3-DeltaNp73α-HA中酶切出DeltaNp73α基因,并插入pAdTrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒;pAdTrack-CMV-DeltaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli.BJ5183菌株内同源重组.筛选正确的重组质粒,PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒;并在293T细胞中反复扩增;增强离心法转染树突状细胞,Western blot检测目的蛋白的表达.结果 经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DeltaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒;Western blot检测出预期相对分子质量为67×103的特异条带.结论 成功构建了携带DeltaNp73α cDNA的重组病毒.     

大鼠ZnT1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 利用GatewayTM技术构建含大鼠锌转运体1(ZnT1)基因重组腺病毒载体,鉴定外源基因在真核细胞中的良好表达.方法 采用化学合成的方法,合成ZnT1/RES/EGFP目的基因片段,通过PCR方法 在基因片段两端加入attB重组位点,与含有attP重组位点的pDonr221供体载体BP反应形成入门载体pDown-ZnT1.将含有attL重组位点的入门载体与含有attR位点目的载体Ad/CMV/V5-DEST通过LR反应形成腺病毒表达载体pAd-ZnT1.酶切和测序鉴定后,由PacⅠ酶切线性化转染HEK293A细胞包装,提取病毒颗粒.采用终点稀释法测定重组腺病毒滴度;Western bl     

APE/Ref-1基因重组腺病毒的构建表达和鉴定

目的 构建表达氧化还原因子-1（APE／Ref-1）基因的复制缺陷型重组腺病毒，为进一步研究APE／Ref-1在耳蜗螺旋神经节氧化损伤病理过程中的作用机制提供实验基础。方法 应用RT-PCR技术从大鼠脑组织总RNA克隆出APE／Ref-1基因，将APE／Ref-1基因定向克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上，经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183内同源重组后，转染293细胞进行包装，并反复感染293细胞进行扩增。对其进行安全性、滴度以及活性等检测。采用Western blot对APE／Ref-1蛋白表达进行检测和鉴定。结果 克隆出大鼠APE／Ref-1基因，经测序证实结果正确：得到高滴度的重组腺病毒，提取病毒DNA证实含目的基因。结论 成功构建了表达APE／Ref-1的复制缺陷型重组腺病毒。为进一步研究APE／Ref-1在耳蜗螺旋神经节的氧化损伤过程中作用机制奠定了实验基础。     

重组腺病毒相关病毒载体基因治疗研究进展

在基因治疗的研究过程中，已经报道过的载体包括病毒性载体和非病毒性载体，但都因其目的基因表达的一过性和较为严重的宿主免疫排斥反应而使其应用受限。相比之下，重组腺病毒相关病毒载体（rAAV载体）有明显的优势：（1）对宿主没有致病性；（2）能稳定转染宿主细胞，具有较长时期的基因表达能力；（3）极低的免疫原性；（4）有广泛的宿主群，可转染分化及未分化细胞。本文就rAAV载体在基因治疗中的研究进展做一综述。     

HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建pAdeno-EGFP-HIF-1α 重组腺病毒载体,探讨其在脊髓损伤中的作用。 方法 采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR） 法扩增目的基因HIF-1α 并亚克隆到含有报告基因EGFP 的pShuttle-CMV-EGFP 穿梭载体中,得到pShuttle-EGFP-HIF-1α 重组穿梭质粒。将已构建的重组穿梭质粒转移至pAdeno 骨架载体上,获得pAdeno-EGFP-HIF-1α 重组腺病毒质粒,继而在H293 细胞中扩增,纯化后进行PCR 鉴定并测定病毒滴度。 结果 pShuttle-EGFPHIF-1 α 经KpnI/BamHI 双酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组在2.5 kb 和5.1 kb 处出现两条带,而阴性克隆组只有5.1 kb 处一条带,证明pShuttle-EGFP-HIF-1α 重组穿梭质粒构建成功;pShuttle-EGFP-HIF-1α 重组穿梭质粒与pAdeno 载体重组后,经XhoI 单酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组出现14.5 kb,11.7 kb,2.66 kb,2.6 kb,2.48 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb 八条带,而阴性克隆的腺病毒空载组有14 kb,11.8 kb,4.0 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb 六条带,证明重组pAdeno-EGFP-HIF1α 腺病毒质粒构建成功;pAdeno-EGFP-HIF-1α 重组腺病毒成功包装纯化后经PCR 鉴定,实验组和阳性对照组中均扩增到2.5 kb 片段,证明目的病毒中成功整合了HIF-1α 基因;TCID50 法测定纯化后的病毒滴度为2×10 10 PUF/ml 。 结论 成功构建了HIF-1α 和EGFP 双基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究其在脊髓损伤中的作用奠定了基础。     

小鼠窖蛋白-1 基因重组腺病毒载体的构建

目的应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠窖蛋白-1(caveolin-1)编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-caveolin-1。方法将质粒pTRE2-caveolin-1中的小鼠caveolin-1编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-caveolin-1,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组。筛得的病毒质粒pAd-caveolin-1经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒。荧光显微镜观察绿色荧光表达。扩增并纯化病毒,测定病毒滴度和重组病毒插入片段的序列。结果重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带caveolin-1基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,caveolin-1基因测序鉴定与GenBank中公布序列一致。重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/mL。结论应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-caveolin-1,通过该系统携带的绿色荧光蛋白(GFP)标记基因可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究caveolin-1在牙齿发育中的作用奠定了基础。     

用CRISPR/Cas9技术编辑KLF4基因对GES-1细胞生物学行为的影响

目的 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建靶向KLF4的基因编辑质粒,建立CRISPR/Cas9-sgKLF4人正常胃黏膜GES-1细胞株,观察KLF4基因敲除效果及其对细胞生物学行为的影响.方法 设计靶向KLF4基因的sgRNA序列,将合成的片段插入到CRISPR/Cas9质粒骨架载体pX459中,再将重组后的质粒做转化,挑取克隆,扩增后提质粒进行测序验证正确性.将构建好的重组质粒体外转染入人胃黏膜细胞GES-1中,利用嘌呤霉素进行筛选获得KLF4敲除的克隆细胞,应用Western blot技术检测未转染细胞和克隆细胞中KLF4蛋白的表达情况,平板克隆实验检测KLF4敲低后克隆形成能力,MTT实验检测其增殖能力,Transwell实验检测其迁移能力.结果 经测序验证,成功构建了靶向KLF4的重组质粒pX459-KLF4-sgRNA,经Western blot方法验证,转染该重组质粒后人胃黏膜上皮细胞株GES-1的KLF4蛋白表达量明显降低,行为学实验结果表明,GES-1细胞敲低KLF4基因后克隆形成能力、增殖能力以及迁移能力都明显增强.结论 成功构建了靶向KLF4的CRISPR/Cas9基因编辑质粒载体及KLF4基因敲低的稳定细胞株GES-1,KLF4基因敲低后GES-1细胞生物学行为的改变证实其抑癌基因活性.     

小鼠MIP1-α重组腺病毒载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的:构建小鼠趋化因子MIP1-α(mMIP1-α)的重组腺病毒载体并在小鼠肝癌细胞中表达,为肝癌基因治疗提供实验基础.方法:PCR扩增含有mMIP1-α的质粒,将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1以及线性化的重组穿梭质粒pTrack-CMV- mMIP1-α共转化BJ5183受体菌并在其中发生同源重组,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子,重组腺病毒质粒经过293细胞的包装、扩增和纯化后,感染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6,一步法提取细胞总RNA,RT-PCR检测mMIP1-α的mRNA.琼脂糖凝胶打孔法体外观察感染上清中mMIP1-α对小鼠脾细胞的趋化活性.结果:得到了携带mMIP1-α的重组腺病毒,纯化后滴度为4×1011 efu/ml,在感染后的Hepa1-6细胞中检测到mMIP1-α的表达,上清中mMIP1-α的趋化指数为6.3.结论:成功地构建了携带mMIP1-α的重组腺病毒载体,为下一步应用于肝癌的基因治疗提供了基础.     

人HIF-1α基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的重组腺病毒载体,并观察其对HepG2细胞的转染情况.方法 采用基因工程技术,经过亚克隆将人HIF-1α基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,经脂质体转染HEK293细胞,进行重组腺病毒的包装、扩增.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HepG2细胞感染效率的监测.结果 酶切鉴定及PCR结果证明重组腺病毒载体成功,人HIF-1α重组腺病毒滴度达1.15×1010 pfu/ml,阴性对照腺病毒的滴度为8×1010 pfu/ml,并对HepG2细胞具有很强的感染力.结论 应用细菌内同源重组法成功构建了含人HIF-1α基因的重组腺病毒载体.     

携带凋亡抑制蛋白Livinα基因的重组腺病毒载体的构建

目的构建携带凋亡抑制蛋白Livinα和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒pAd-Livinα。方法 PCR扩增Livinα基因片段,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在人胚肾293细胞中包装扩增得到携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒pAd-GFP-Livinα。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果经酶切及PCR鉴定证实携带Livinα的重组腺病毒载体构建成功,并可在人胚肾293细胞中表达,病毒滴度2.15×1010 pfu/mL。结论成功构建了携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒载体系统,为进一步研究Livinα的生物学特性奠定了基础。     

小鼠雌激素受体α基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建C57BL/6小鼠雌激素受体α（Esr1）重组腺病毒表达载体,扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法：采用RT-PCR方法从C57BL/6小鼠卵巢细胞扩增目的Esr1 CDS区基因片段,至pMD19-TSimple载体后测序鉴定.亚克隆Esr1CDS区基因片段至腺病毒穿梭质粒pDNR-CMV,再与骨架质粒pLP-Adeno-X-CMV在感受态大肠杆菌ElectroMAXTMDH10BTMCells中进行同源重组获得腺病毒载体质粒Adeno-Esr1,PacI酶切线性化后脂质体法转染HEK293细胞进行包装、扩增,测定感染性滴度,获得重组腺病毒Ad-Esr1.将病毒感染HEK293细胞,Western Blot检测Esr1蛋白表达.结果：测序证实提取的Esr1 CDS区基因序列完全正确;测序及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功;感染性滴度为6.4×1013（pfu/L）,Western Blot检测Ad-Esr1感染的HEK293细胞能表达Esr1蛋白,而未感染的HEK293细胞蛋白不表达.结论：成功构建了C57BL/6小鼠Esr1基因重组腺病毒载体,为进一步研究Esr1在神经系统中生物学功能及对神经系统疾病的基因治疗奠定了基础.     

KLF9在上皮性卵巢癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨Kr俟ppel样转录因子9（KLF9）在上皮性卵巢癌中的表达及其临床意义。方法选取63例有完整临床病理资料及随访>5年的石蜡包埋上皮性卵巢癌组织和正常卵巢上皮组织。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测KLF9 mRNA在两组卵巢组织中的表达,应用免疫组织化学法分析KLF9 在两组卵巢中的表达,分析KLF9 表达水平与临床病理参数及患者预后的关系。结果63例卵巢癌组织中,KLF9 mRN为正常上皮组织的（0.44±0.693）倍（p <0.05）。上皮性卵巢癌组织中,KLF9高表达15 例（23.8%）,低表达48 例（76.2%）;在正常卵巢组织中,KLF9 高表达18 例（60%）,低表达12 例（40%）,差异有统计学意义（p <0.05）。癌组织中KLF9低表达与上皮性卵巢癌患者的临床分期、淋巴结转、腹腔积液相关（p <0.05）。KLF9 mRNA高表达组中位生存时间46.8个月（95%CI：26,83）,高于低表达组的32.6个月[（95%CI：12,74）,p =0.002]。肿瘤组织中KLF9阳性细胞高表达组的中位生存时间为50.2 个月（95%CI：32,84）,高于KLF9低表达组的31.1 个月[（95%CI：12,79）,p =0.001]。多因素COX 生存分析表明,KLF9 mRNA 和KLF9 阳性细胞低表达是影响上皮性卵巢癌预后不良的独立指标[HR=2.64（95%CI：1.14,3.56）,p =0.017]和[HR=3.01（95%CI：2.19,4.51）, p=0.010]。结论KLF9 在上皮性卵巢癌组织中表达下调,与上皮性卵巢癌患者预后不良相关。     

蛋氨酸酶基因重组腺病毒载体构建

目的构建蛋氨酸酶基因重组腺病毒载体.方法运用Cre-LoxP重组酶系统,通过DNA重组技术,将L-蛋氨酸-γ裂解酶基因(L-Methioneγ-Lyase Gene)与供体载体pDNR-CMV重组,获得含有Metase重组基因的供体载体pDNR-Metase-CMV.将pDNR-Metase-CMV片段与真核腺病毒载体PLP-Ade-X-CMV进行重组,获得pLP-Ade-Metase-CMV重组分子.结果获得了重组腺病毒载体pLP-Ade-Metase-CMV,并证实该重组腺病毒载体中有Metase Gene.结论采用LoxP/Cre体外重组法成功地构建了含蛋氨酸酶基因的真核表达重组腺病毒载体.     

HBX基因重组腺病毒载体的构建

目的:构建携HBX基因的腺病毒载体,为进一步研究HBX基因的功能,为阐明HBV感染导致肝癌的机制研究建立基础.方法:采用PCR技术从HBV全基因组DNA中扩增HBX基因;将HBX基因亚克隆至质粒pHAHA,构建质粒pHAHA-HBX,酶切pHAHA-HBX质粒,将HAHA-HBX片段克隆到腺病毒载体pAd-Track-CMV中,得到pAdTrack-CMV-HBX,同时与pAdEasy-1共转染293细胞,确定转染效率.检测培养上清病毒中HBX的存在.结果:将PCR扩增HBX片段成功克隆到腺病毒载体中,并经序列分析证实;建立了产病毒细胞株,证实重组病毒中含有HBX基因.结论:成功构建了携HBx基因的腺病毒载体.     

人突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的: 构建人突变型低氧诱导因子1(HIF-1)α腺病毒表达载体,研究人突变型HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用. 方法: 采用分子克隆技术,由pcDNA3.1( )-HIF1α(突变型)质粒获得突变型HIF1α cDNA,克隆到穿梭质粒pShuttle2,以PI-Sce I和I-Ceu I双酶切重组穿梭质粒,获得含有突变型HIF1α cDNA的表达盒,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接,重组成pAdeno-HIF1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-HIF1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定. 结果: 经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×1012 pfu/L. 结论: 成功构建重组腺病毒Adeno-HIF1α(突变型),为冠心病的突变型HIF1α基因治疗研究奠定基础.     

EB病毒融合基因重组腺病毒表达载体的构建

目的构建EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法逆转录-聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cD-NA,采用剪接式重叠延伸(spliced overlap exetension,SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack-CMV质粒上,在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,构建融合基因Z2A真核表达载体pAd-Z2A。经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-Z2A。结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切,电泳后可观察到长31kb和4.5kb两条DNA条带,测序鉴定结果表明序列正确;从感染重组腺病毒vAd-Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体,为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。     

小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建

[目的] 构建小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,为 T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的 T-bet生物表达系统.[方法] 采用内切酶从质粒 T-bet/GFP-RV中切获约 1.7 kb的小鼠 T-betcDNA片段,与穿梭质粒 pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含 T-betcDNA的表达盒与 Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体 pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等 DNA顺序改变,并转染 HEK293细胞,出现 CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒 DNA行 PCR鉴定.[结果] PCR及酶切证实: T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒 pShuttle中,带 T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组 E1A缺失区,并在 HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒 pAdeno-T-bet.[结论]本实验成功构建了小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,并在 HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒.