miR-98前体转染卵巢癌细胞的效率检测及增殖抑制检测

目的 pre-hsa-miR-98转染卵巢癌SKOV3、HO8910和A2780细胞,观察转染率并研究转染后对卵巢癌细胞的增殖抑制作用,为卵巢癌新治疗方法研究提供实验依据。方法利用构建的pre-hsa-miR-98质粒HmiR和连接随机序列的质粒CmiR转染人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910和A2780细胞,荧光显微镜观察和流式细胞仪计数计算转染率,MTT法检测转染对卵巢癌细胞的增殖抑制作用。结果 HmiR转染后24 h,荧光显微镜下观察,SKOV3、HO8910、A2780细胞的转染率分别为61.50%、68.59%、63.40%;流式细胞术计数,转染HmiR后SKOV3、HO8910、A2780细胞的转染率分别为57.93%、66.73%、58.59%。转染HmiR后,MTT法检测SKOV3、HO8910、A2780细胞的增殖抑制率随转染时间延长而增加,72 h达到49.54%、53.25%、46.09%。结论三种卵巢癌细胞的转染率均接近或超过60%,HmiR转染后可抑制卵巢癌细胞增殖,其抑制作用随转染时间延长而增强。     

pre-hsa-miR-98对卵巢癌细胞增殖活性抑制的影响

目的卵巢癌的死亡率占各类妇科恶性肿瘤的首位,对女性患者的生命造成严重威胁。miR-98可抑制多种癌细胞增殖,但未见关于其应用于卵巢癌治疗的报道。文中为探讨卵巢癌治疗的新方法,用pre-hsa-miR-98转染卵巢癌SKOV3、HO8910和A2780细胞,观察转染率并研究转染后对卵巢癌细胞的增殖抑制作用。方法利用构建的pre-hsa-miR-98质粒HmiR和连接随机序列的质粒CmiR转染人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910和A2780细胞,荧光显微镜与流式细胞仪计数计算转染率,MTT法检测细胞增殖抑制率与细胞计数绘制生长曲线研究转染对卵巢癌细胞的增殖抑制作用。结果转染HmiR后,荧光显微镜观察和流式细胞术计数结果显示SKOV3、HO8910、A2780细胞的转染率均在60%左右。转染HmiR后,MTT法检测SKOV3、HO8910、A2780细胞的增殖抑制率随转染时间延长而增加,72 h分别达到49.54%、53.25%、46.09%。生长曲线显示在72 h及96 h抑制率达到高峰,随后随时间延长抑制率不再显著升高。结论 3种卵巢癌细胞的转染率达到实验要求,HmiR转染后可抑制卵巢癌细胞增殖,其抑制作用随转...     

Experimental investigation on the transfection rates of pre-let-7 d in human ovarian cancer cells

目的 研究Pre-let-7 d质粒在不同时间,以不同浓度转染人卵巢癌细胞的转染率.方法 将构建的Pre-let-7 d质粒HmiR和连接随机序列的质粒CmiR转染人卵巢癌SKOV3、HO8910细胞,用荧光显微镜与流式细胞仪计数两种方法计算转染率.结果 转染HmiR、CmiR后,荧光显微镜观察和流式细胞术计数结果显示SKOV3、HO8910细胞的转染率,以3 μg质粒/孔转染SKOV3、HO8910人卵巢癌细胞比2 μg、4 μg质粒/孔的转染率高,24 h、48 h、72 h三个不同时间点用相同质量的质粒转染,转染率无显著差异.结论 转染HmiR、CmiR后,荧光显微镜观察和流式细胞术计数结果显示以3 μg质粒/孔转染SKOV3 HO8910 人卵巢癌细胞的转染率均在60%左右,符合实验要求.     

Pre-let-7d转染卵巢癌细胞转染率的研究

目的研究Pre-let-7 d质粒在不同时间,以不同浓度转染人卵巢癌细胞的转染率。方法将构建的Pre-let-7 d质粒HmiR和连接随机序列的质粒CmiR转染人卵巢癌SKOV3、HO8910细胞,用荧光显微镜与流式细胞仪计数两种方法计算转染率。结果转染HmiR、CmiR后,荧光显微镜观察和流式细胞术计数结果显示SKOV3、HO8910细胞的转染率,以3μg质粒/孔转染SKOV3、HO8910人卵巢癌细胞比2μg、4μg质粒/孔的转染率高,24 h、48 h、72 h三个不同时间点用相同质量的质粒转染,转染率无显著差异。结论转染HmiR、CmiR后,荧光显微镜观察和流式细胞术计数结果显示以3μg质粒/孔转染SK-OV3 HO8910人卵巢癌细胞的转染率均在60%左右,符合实验要求。     

白凤菜总黄酮对多发性骨髓瘤U266细胞增殖和凋亡影响

目的 观察白凤菜总黄酮(TFG)对多发性骨髓瘤U266细胞的增殖和凋亡的影响。方法 MTT实验检测U266细胞增殖;倒置显微镜及荧光显微镜分别观察U266细胞经TFG处理24 h后细胞形态及凋亡的变化;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期的变化。结果 TFG明显抑制U266细胞的增殖,P<0.05,且呈浓度和时间依赖性;100 μg /mLTFG作用组的U266细胞凋亡明显增加;TFG使U266细胞周期阻滞于S期。结论 TFG可抑制U266细胞增殖,可能同细胞周期的捕获和细胞凋亡的诱导相关。     

RNAi技术沉默K562细胞中c-myc基因的初步研究

目的 运用RNAi技术,设计针对c-myc的小干扰RNA(siRNA),研究其干扰效果。方法 针对c-mycmRNA的第1357靶位点设计siRNAs,经Lipofectamine^TM2000脂质体法转染K562细胞,进行RT-PCR、细胞计数和MTT法及流式细胞仪检测,观察其干扰效果。结果 转染组与阴性对照组和空白对照组相比,c-mycmRNA表达明显减弱,细胞计数和MTTD(λ)值均有显著降低,并有明显的凋亡率。结论 运用RNAi技术,可以有效地干扰c-myc的表达,并进一步诱导细胞凋亡。     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34+细胞

目的 研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34⁺细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法 用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞,免疫磁性分离仪纯化CD34⁺细胞,重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞,并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果 荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32.8%,CD34⁺细胞的基因转导效率最高为25%,在所观察的时间内,转染率呈先升高后降低趋势。结论 重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34⁺细胞,绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因,为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

可溶性人TRAIL诱导胃癌细胞BGC-823凋亡的研究

目的 通过构建pBud-EGFP-TRAIL质粒体外观察可溶性人TRAIL蛋白(sTRAIL)对胃癌细胞BGC-823的作用.方法 以EFGP基因为报告基因,sTRAIL为目的基因,构建pBud-EGFP-TRAIL双表达质粒,鉴定酶切和测序重组体.经脂质体转染法转染体外培养的胃癌细胞BGC-823,用荧光显微镜观察EGFP的表达,RT-PCR及Western blot进一步检测sTRAIL mRNA及其蛋白的表达,MTT法检测转染后对胃癌细胞的生长抑制率,TUNEL法观察细胞的凋亡情况,流式细胞仪分析转染后胃癌细胞的凋亡率.结果 测序结果证实pBud-EGFP-TRAIL载体构建成功,质粒经脂质体转染后,通过表达sTRAIL蛋白对胃癌细胞发挥作用.MTT法显示转染该质粒的细胞的生长抑制率明显高于对照组,TUNEL法显示细胞核固缩,核染色质聚集或断裂,形成凋亡小体.流式细胞仪结果表明转染该质粒的细胞的的凋亡率明显高于对照组.结论 在体外初步证实TRAIL能诱导胃癌细胞BGC-823凋亡.     

新烷化剂替莫唑胺酯对胶质瘤细胞生长的影响

目的 : 以替莫唑胺（TMZ）为阳性对照,研究新烷化剂替莫唑胺酯（TMZ-HE）在体外抑制脑胶质瘤LN-18细胞生长并诱导其凋亡的作用。方法: MTT比色法比较相同浓度梯度的TMZ和TMZ-HE作用后对LN-18细胞增殖的影响;二维克隆法观察TMZ、TMZ-HE长期作用的效果;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Hoechst33342/PI荧光染色观察细胞核形态改变及细胞坏死情况;Western Blot检测TMZ和TMZ-HE对LN-18细胞内耐药蛋白MGMT的影响。结果:TMZ-HE较TMZ明显抑制LN-18细胞的生长和增殖,呈浓度及时间依赖性反应; TMZ-HE的长期作用效果同样优于TMZ;TMZ-HE诱导LN-18细胞发生凋亡率高于TMZ;TMZ-HE能够更早消耗耐药蛋白MGMT。结论:TMZ-HE较TMZ更早更多地消耗耐药蛋白,增加TMZ-HE对胶质瘤LN-18细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用。     

干扰TAZ基因对舌鳞癌细胞CAL27增殖凋亡的影响及其机制

目的 探讨干扰TAZ基因后对舌鳞癌细胞CAL27增殖和凋亡的影响以及可能的分子调控机制。 方法 实验分为干扰组和对照组,将稳定干扰TAZ基因的慢病毒载体转染至舌鳞癌细胞CAL27中作为干扰组,并以非特异性序列转染CAL27细胞作为对照组。利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blotting检测干扰效率,CCK-8细胞活力实验及EdU染色法检测转染后细胞增殖能力的改变,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况,Western blotting检测与周期及凋亡相关蛋白的表达情况。 结果 干扰TAZ基因后,RT-PCR和Western blotting检测结果显示,TAZ mRNA和蛋白表达水平明显降低;CCK-8细胞增殖活力检测及EdU染色法显示细胞增殖能力降低;细胞早期凋亡和晚期凋亡比例均增多; G0/G1期细胞比例增多,而G2/M期细胞减少。同时,干扰TAZ基因后,周期相关蛋白CYCLIN D1、CDK4和CDK6等表达水平降低;而凋亡相关蛋白Bax、cleaved Caspase9表达水平均升高,Bcl-2表达水平降低。 结论 干扰TAZ基因可以通过调控细胞周期和凋亡相关蛋白的表达,来影响舌鳞癌细胞的增殖和凋亡。     

PTEN基因转染对卵巢癌SKOV3细胞生长抑制和诱导凋亡的研究

目的研究外源性PTEN基因转染对人卵巢癌SKOV3细胞生长增殖抑制和凋亡诱导作用,探索卵巢癌的新治疗方法。方法将携带PTEN基因的真核表达载体pBP-PTEN和不含该基因的空载体pBP转染卵巢癌SKOV3细胞,实验分组为pBP-PTEN、pBP和SKOV3组,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察对SKOV3细胞的生长抑制作用,Annexin V/PI双标记流式细胞术检测转染后对SKOV3细胞的凋亡诱导作用,Annexin V/PI双染荧光显微镜观察细胞凋亡形态。结果MTT检测,0.1、0.2和0.3μg/孔PTEN质粒DNA转染SKOV3细胞48 h,生长抑制率分别为13.31%、27.67%、42.25%,不同时间点(24、48和72 h)检测,细胞生长抑制率存在剂量-时间依赖关系。光镜观察,转染24 h后即可见明显的形态学改变。流式细胞术检测,4μg/孔PTEN质粒DNA转染SKOV3细胞24和48 h后,细胞凋亡率分别达38.08%和65.60%(P<0.01)。Annexin V/PI双染荧光显微镜观察,细胞凋亡率存在时间-剂量以来关系。结论PTEN基因转染抑制人卵巢癌细胞增殖并显著诱导细胞凋亡。     

二烯丙基二硫化物对人子宫内膜癌HEC-1-B细胞增殖抑制和凋亡诱导作用

目的研究二烯丙基二硫化物(DADS)对人子宫内膜癌HEC-1-B细胞增殖和凋亡的影响。方法 MTT法检测DADS对HEC-1-B细胞的增殖抑制作用,采用AnnexinV/PI双标记流式细胞术检测DADS对HEC-1-B细胞的凋亡诱导作用;Hoechst-33528染色,观察细胞凋亡形态。结果用100、200、400μmol/L DADS处理HEC-1-B细胞24、48 h,在100μmol/L剂量即可抑制细胞的增殖,随着剂量和时间的增加,DADS对细胞的抑制作用明显增强。DADS对HEC-1-B细胞的增殖抑制存在时间-剂量依赖关系。用200μmol/LDADS处理48 h后,流式细胞术检测细胞凋亡率达40.91%。Hoechst-33528染色可见细胞出现明显的凋亡形态学改变。结论 DADS对HEC-1-B细胞具有增殖抑制并诱导凋亡的作用,提示DADS对子宫内膜癌的治疗可能具有重要价值。     

5-ALA治疗和hTERT mRNA的反义寡核苷酸联合应用对人卵巢癌细胞的杀伤作用及其机制

目的：观察5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）光动力治疗（PDT）和人端粒酶催化亚单位 (hTERT) mRNA的反义寡核苷酸（ASODN)联合应用对人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制及促凋亡作用,探讨两种方法联合应用协同促进对人卵巢癌3AO细胞的杀伤作用机制。方法：采用MTT法筛选不同浓度5-ALA 和激光能量照射对人卵巢癌3AO细胞增殖抑制作用的最佳组合参数; RT-PCR法检测hTERT ASODN和SODN转染后hTERT mRNA表达水平的变化。将人卵巢癌3AO细胞分为空白
对照组、hTERT ASODN转染组、hTERT SODN转染组、5-ALA PDT组、hTERT ASODN转染+5-ALA PDT组和hTERT SODN转染+5-ALA PDT组,应用MTT法检测各组人卵巢癌3AO细胞增殖抑制率;应用膜联蛋白V-硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)/碘化丙啶(PI)双染色结合流式细胞术检测
各组人卵巢癌3AO细胞凋亡率。结果：5-ALA PDT对人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制作用随着光敏剂浓度的增加和激光能量的增大而增加(P<0.05);不同浓度hTERT ASODN转染人卵巢癌3AO细胞24 h后,hTERT mRNA表达水平呈浓度依赖性下调(P<0.05),而hTERT-SODN对人卵巢癌3AO细胞hTERT mRNA表达无显著影响(P>0.05)。hTERT ASODN转染+5-ALA PDT (5-ALA浓度为0.5 mmol•L-1,激光能量密度为2.50 J•cm-2)组人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制率高于5-ALA PDT组和hTERT ASODN组(P<0.05)。hTERT ASODN转染+5-ALA PDT组人卵巢癌3AO细胞的凋亡率为29.28％,显著高于hTERT ASODN 转染组（12.79％）和5-ALA PDT组（21.19％)(P<0.05）。结论：hTERT ASODN转染与5-ALA PDT联合治疗可协同增强对人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制作用,其机制可能与联合作用促进细胞凋亡有关联。     

受体相互作用蛋白140敲低对小鼠小胶质瘤细胞增殖的影响

目的 探讨受体相互作用蛋白(RIP)140基因敲低对小鼠小胶质瘤细胞(BV-2)增殖的影响.方法 用脂质体转染方法将RIP140-短发夹RNA(shRNA)质粒导入BV-2细胞,用嘌呤霉素筛选稳定表达RIP140-shRNA的细胞系,用实时定量PCR和Western印迹法检测RIP140敲低的效果,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测RIP140敲低对细胞增殖的影响.结果 成功构建稳定表达RIP140-shRNA的BV-2-71674和BV-2-71080;与BV-2细胞相比,BV-2-71674和BV-2-71080细胞中RIP140的表达无论mRNA水平还是蛋白质水平均明显低,下调率(mRNA)分别为73%和75%(均P<0.01);MTT法检测显示,BV-2细胞在24、48、72、96 h 4个时间点增殖率分别为3.03±0.01、7.36±0.08、14.15±0.25、23.35±0.09,BV-2-71674细胞则分别为2.15±0.03、6.43±0.08、11.77±0.31、18.47±0.04,BV-2-71080细胞分别为1.77±0.03、4.74±0.25、10.03±0.02、17.66±0.21;BV-2-71674和BV-2-71080细胞增殖率均明显低于BV-2细胞,差异均有统计学意义(均P<0.01).结论 RIP140敲低可以抑制BV-2细胞的增殖.     

量子点标记与绿色荧光素标记对survivin反义寡核苷酸生物功能影响的比较

目的 观察量子点和绿色荧光素分别标记的survivin反义寡核苷酸(ASODN)转染人乳腺癌细胞株MCF-7后,在标记存在时间、survivin的表达及细胞增殖、凋亡方面有无差异.方法 将量子点和绿色荧光素分别标记的survivin ASODN通过脂质体转染MCF-7,MTT法检测细胞生长抑制率,RT-PCR检测survivin mRNA,Western blot检测survivin蛋白表达,流式细胞仪分析细胞凋亡率变化,荧光倒置显微镜观察细胞内荧光物质分布.结果 量子点与绿色荧光素分别标记的survivin ASODN作用MCF-7后,survivin mRNA和survivin蛋白表达均下降,但两者间无显著差异(P＞0.05).两者细胞生长抑制率、凋亡率间无显著差异(P＞0.05).转染后4 d绿色荧光素标记组细胞内荧光消失,而量子点标记组荧光1周仍存在.结论 量子点标记survivin ASODN与绿色荧光素标记比较,对survivin的表达及细胞增殖、凋亡方面无差异,而标记更稳定,存在时间更长.     

HBV在人肾小球系膜细胞内的表达及对其凋亡的影响

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)在人肾小球系膜细胞内的表达及对细胞凋亡的影响。方法采用脂质体转染法将C基因型重组全长乙型肝炎病毒(PHY106-CHBV)转染至人肾小球系膜细胞。收集24、48和72 h细胞培养上清液,进行HBsAg与HBeAg的定量检测;应用倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态学变化;MTT法检测细胞增殖率;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果实验组细胞培养上清液中可检测到HBsAg和HBeAg的高表达;观察细胞形态学变化发现,转染PHY106-CHBV后可诱导人肾小球系膜细胞凋亡;MTT结果显示细胞增殖受抑;流式细胞仪检测显示细胞凋亡率增加。结论 HBV可在人肾小球系膜细胞内表达,且能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

miR-92a反义寡核苷酸对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-92a反义寡核苷酸(ASO)对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。方法将胃癌细胞SGC-7901和MKN-45分为反义寡核苷酸处理组和无义寡核苷酸对照组,分别转染miR-92a ASO和无义寡核苷酸,同时设未转染空白对照组;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测处理前以及处理48 h后胃癌细胞中miR-92a的表达变化;MTT法检测细胞增殖情况;AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞术和Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡情况。结果 Anti-miR-92a作用48 h后,miR-92a在两种胃癌细胞中的表达均显著下降(P<0.05);细胞增殖受到明显抑制(P<0.05);细胞凋亡率明显增加(P<0.05),荧光染色显示其细胞核呈凋亡细胞的特征样改变。结论以miR-92a为靶标的ASO可以有效抑制胃癌细胞增殖,促进其凋亡。