HL—60细胞凋亡小体体外负载树突状细胞的实验研究

目的：证实树突状细胞(Dendrmc cells,DCs)可通过吞噬凋亡小体获取抗原物质,探讨其在肿瘤免疫治疗中的意义。方法：利用吸附单克隆抗体-磁珠分离系统(MACS),从人脐血中分离出CD34^ 细胞,体外以重组hGM—CSF hSCF hTNF—α hFL诱导培养DCs,光镜观察诱生细胞的形态,流式细胞术(FACS)检测其表型。电镜观察和流式细胞仪检测三氧化二砷(As2O3)诱导凋亡的HL-60细胞,将凋亡的HL-60细胞与培养早期的DCs共育4～8h,电镜观察DCs吞噬凋亡小体的现象。结果：CD34^ 细胞经诱生后生成了大量具有典型形态和表型的成熟DCs;电镜下见凋亡的HL-60细胞内凋亡小体形成,流式细胞仪检测DNA含量,见亚二倍体峰形成。凋亡细胞与DCs共育后,电镜下见DCs吞噬凋亡小体的现象。结论：DCs可通过吞噬凋亡小体摄取抗原物质。     

慢性粒细胞白血病患者骨髓中不同细胞诱生树突状细胞的体外研究

目的:体外诱导慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓单个核细胞(BMMNCs)、CD34+细胞、单核细胞为树突状细胞(DCs),并对其形态、表型及其刺激T细胞增殖作用进行比较。方法:利用GM-CSF、IL-4、TNF-α体外定向诱导生成树突状细胞,利用流式细胞仪对所诱生的细胞进行细胞形态及表型检测,用D-FISH方法检测所诱生DCs的白血病源性。并应用MTT法检测所诱生的DCs刺激T细胞增殖的能力。结果:CML患者BMMNCs、CD34+细胞、单核细胞体外均可诱导生成bcr/abl融合基因阳性的DCs,前者DCs产量明显高于后二者,但均具有刺激自体及异体T细胞增殖的能力,且三者无显著性差异。结论:来源于CML患者骨髓的BMMNCs、CD34+细胞、单核细胞均可诱生成CMLDCs,对T细胞均具有刺激增殖能力,但BMMNCs所诱生的DC主要来源于未成熟的中性粒细胞。     

低剂量照射对树突状细胞表型及功能的影响

目的研究低剂量照射对未成熟树突状细胞（DCs）大肠癌抗原吞噬能力、未成熟DC表型及体外刺激T细胞能力的影响。方法取健康人外周血,密度梯度离心获取单个核细胞。铺板贴壁法分离淋巴细胞,贴壁细胞在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和白细胞介素4（rhIL-4）的作用下体外诱导5d后收获,并分别以0.1、0.2、0.5和1.0Gy的X射线照射24h。检测照射后未成熟DCs的表型、抗原吞噬能力及负载大肠癌肿瘤抗原信息的DCs在体外刺激T细胞的能力。结果流式细胞仪检测结果显示,0.2Gy照射组成熟DCs的CD40、CD80、CD83、CD86表型及抗原吞噬能力均明显高于对照组（未照射）及其他照射组（均P〈0.05）;体外刺激T细胞的能力随照射剂量的增加而减弱。结论低剂量照射能促进DCs抗原的吞噬能力和成熟,但会减弱体外刺激T细胞的能力。     

rAAV2载体介导GFP基因转染树突状细胞

目的:在诱导人骨髓CD34 细胞分化成树突状细胞(dendritic cells,DCs)的基础上,探讨2型重组腺相关病毒(Type 2 recombinant adeno-associated virus,rAAV2)载体介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因转染DCs的条件.方法:采用免疫磁珠法分离纯化人骨髓来源的CD34 细胞.在含有IL-4和GM-CSF的培养体系中体外诱导CD34 细胞生成DCs,于第5天加入TNF-α诱导DCs成熟,在不同时间用rAAV2载体介导GFP基因转染未成熟和成熟的DCs.通过电子显微镜和流式细胞仪鉴定树突状细胞,荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP的表达.结果:人骨髓CD34 细胞经诱导分化后,在光镜及透射电镜下均可观察到DCs的形态特征,流式细胞仪检测到DCs表型;荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞培养第3天、第5天和加入TNF-α后的rAAV2-GFP转染率分别为0.45%,13.54%和0.25%.结论:本实验中所采用的培养体系可成功将人骨髓CD34 细胞诱导分化成DCs,rAAV2/GFP转染DCs效率随细胞诱导分化时间的延长而增高,且转染未成熟DCs的效率高于转染成熟DCs.     

A23187诱导HL-60细胞分化为树突状细胞的研究

目的 探讨用钙离子载体A23187通过钙动员机制使人急性粒细胞性白血病细胞系HL-60细胞迅速分化为树突状细胞(DCs)的方法,为今后临床用DCs进行抗白血病免疫治疗打下基础.方法 将生长良好的HL-60细胞加入不同浓度A23187(45～720 ng/mL)或联用重组人γ-干扰素(rhIFN-γ,1000 U/mL)培养20～96 h,倒置显微镜和扫描电镜观察其形态学特征,流式细胞术检测其免疫表型,混合淋巴细胞反应检测其刺激T淋巴细胞增殖的能力.结果 HL-60细胞加入适量A23187(180 ng/mL)或联合rhIFN-γ(1000 U/mL)诱导20 h后,即可出现细胞表面树状突起,且树突状细胞表面特异性成熟标志抗原CD83、共刺激分子CD80、CD86表达升高;培养48 h,CD83分子表达开始降低;培养72 h,可获得DC的典型形态,CD80、CD86分子表达持续升高.同种异体混合淋巴细胞反应检测经A23187或联用rhIFN-γ诱生的DCs可明显刺激同种异体T淋巴细胞增殖.结论 钙离子载体可诱导HL-60细胞分化为高表达共刺激分子及具有刺激同种异体T淋巴细胞增殖的成熟DCs,钙动员有望成为一种快速获取DCs的有效方法.     

慢性粒细胞白血病患者外周血单个核细胞诱生树突细胞的体外研究

目的 :体外诱生慢性粒细胞白血病 ( CML)患者外周血单个核细胞 ( PBMNCs)为树突细胞( DCs)。方法 :CML患者 PBMNCs在含 GM- CSF、IL- 4、TNF- α的培养液中培养 1 4d,倒置显微镜、电镜下观察细胞形态 ,流式细胞仪检测细胞的表面标志 ,免疫磁珠 ( MACS)富集所诱生的 DCs,用D- FISH、RT- PCR方法检测 DCs的白血病源性。利用 MTT法检测所诱生 DCs刺激 T细胞增殖能力。结果 :所诱生的细胞高表达 CD80 、CD86、CD1a、HLA- DR,电镜下细胞表面有丰富突起 ,细胞浆内有丰富线粒体 ,D- FISH、RT- PCR检测所诱生的 DCs具有 bcr/abl融合基因。CML DCs具有刺激 T细胞增殖能力。结论 :体外利用 CML患者 PBMNCs成功诱导生成了来源于 CML细胞的 DCs( CML DCs)。     

rAAV2载体介导G卯基因转染树突状细胞

目的：在诱导人骨髓CD34^＋细胞分化成树突状细胞（dendritic cells，DCs）的基础上，探讨2型重组腺相关病毒（Type 2 recombinant adeno-associated virus，rAAV2）载体介导绿色荧光蛋白（green fluo-rescent protein，GFP）基因转染DCs的条件。方法：采用免疫磁珠法分离纯化人骨髓来源的CD34^＋细胞。在含有IL-4和GM-CSF的培养体系中体外诱导CD34^＋细胞生成DCs，于第5天加入TNF-α诱导DCs成熟，在不同时间用rAAV2载体介导GFP基因转染未成熟和成熟的DCs。通过电子显微镜和流式细胞仪鉴定树突状细胞，荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP的表达。结果：人骨髓CD34^＋细胞经诱导分化后，在光镜及透射电镜下均可观察到DCs的形态特征，流式细胞仪检测到DCs表型；荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞培养第3天、第5天和加入TNF-α后的rAAV2-GFP转染率分别为0．45％，13．54％和0．25％。结论：本实验中所采用的培养体系可成功将人骨髓CD34^＋细胞诱导分化成DCs，rAAV2／GFP转染DCs效率随细胞诱导分化时间的延长而增高，且转染未成熟DCs的效率高于转染成熟DCs。     

脐血CD34+造血干细胞来源的树突状细胞体外培养体系的优化

目的：优化脐血CD34^＋造血干细胞（HPC）来源的树突状细胞（DCs）诱导培养方法，为体外研究CD34^＋HPC诱导产生功能性树突状细胞（DCs）的影响因素奠定基础。方法：淋巴细胞分离液（Ficoll）分离获得脐血单个核细胞，免疫磁珠阳性分选CD34^＋HPC，并用流式细胞术鉴定CD34^＋HPC纯度：比较GT（GM-CSF＋TNF—α）方案和GTI（GM—CSF＋TNF—α＋IL-4）方案及GTI方案中TNF—α．和IL-4不同时段加入对诱导培养产生的DCs成熟的影响：通过激光共聚焦显微镜观察细胞形态，流式细胞仪分析细胞表型及3H—TdR检测DCs激发异体T细胞增殖能力。结果：免疫磁珠阳性分选CD34＋HPC纯度可达90％以上：将CD34＋HPC按GT方案和GTI方案进行培养，均可诱导产生DCs．但经GT方案诱导的DCsCD14表达较高，CD80、CD86、CD83、CD1a表达不如经GTI方案诱导的高；而GTI方案中，以TNF—α．0h加入、IL-448h加入诱导培养的DCs各表型表达相对较佳．并具有激发异体T细胞增殖能力。结论：CD34^＋HPC经过合适的培养体系能够诱导分化为功能性DCs，以GM—CSF与TNF-α 0h加入、IL-448h加入的GM—CSF＋TNF—α＋IL-4方案更为可取。     

树突状细胞对肿瘤特异性CTL体外激发、扩增及功能的作用研究

目的:研究凋亡肿瘤细胞负载的DCs联合细胞因子对T细胞体外激发、扩增及功能的诱导作用。方法:人B淋巴瘤细胞株Raji经顺铂(DDP)诱导凋亡，体外共育法负载DCS，DCs和T细胞体外共培养观察DC5对T细胞的效应，采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析T细胞表型：ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-10的含量；溶血实验检测细胞毒性T细胞(CTL)产生穿孔素的能力；体外肿瘤杀伤实验分析CTL的特异性肿瘤杀伤作用。结果：凋亡肿瘤细胞负载联合CD40激发的DCs能有效地激发自体T细胞的体外扩增并诱导具有较特异杀伤肿瘤细胞作用的CTL。结论：凋亡肿瘤细胞负载的DCS在CD40信号的作用下对自体T细胞具有较强的激发和扩增效应．所获得的CTL对肿瘤细胞具有较特异的杀伤作用。     

可溶性虫卵抗原对小鼠骨髓源性树突状细胞表型及Th17细胞分化的影响

目的:探讨日本血吸虫可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)致敏小鼠骨髓源性树突状细胞(dendritic cells,DCs)后对其细胞表型及Th17细胞分化的影响?方法:收集BALB/c小鼠骨髓细胞,应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)?白介素(interleukin,IL)-4定向诱导小鼠骨髓细胞向DCs分化;流式细胞仪检测SEA刺激培养后DCs表面分子的表达情况;流式细胞术检测DCs 分泌IL-6?IL-23的水平,ELISA法检测DCs分泌转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的水平;SEA刺激DCs与CD4+T细胞共培养后检测培养上清中IL-6?TGF-β?IL-23和IL-17细胞因子水平?结果:诱导培养出可供实验用的高纯度DCs;SEA刺激DCs能表达较高水平的CD80?CD86?CD40?组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅱ类分子;SEA刺激DCs产生IL-6和TGF-β明显增多;SEA刺激的共培养细胞上清中IL-17水平增高?结论:SEA能够促进DCs成熟,并诱导CD4+T细胞向Th17细胞分化?     

硼替佐米或联合三氧化二砷诱导HL-60细胞凋亡实验研究

目的 探讨硼替佐米单独或联合三氧化二砷对HL-60细胞凋亡的影响.方法 不同浓度硼替佐米、三氧化二砷处理细胞12～48 h,采用MTT比色法检测细胞增殖活性;DNA凝胶电泳、细胞形态学观察、流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 10～50 nmol/L硼替佐米可有效抑制HL-60细胞增殖,并诱导其发生凋亡.其中10nmol/L剂量处理12 h,即有细胞凋亡发生,延长作用时间或增加药物剂量,细胞凋亡率明显增加.选择15 μmol/L三氧化二砷与10nmol/L硼替佐米联合应用,可见HL-60细胞凋亡率比两种药物单独使用时显著增加.结论 硼替佐米对HL-60细胞存在时间和剂量依赖性的细胞凋亡效应,与三氧化二砷联合具有明显的协同作用.     

STI571、三氧化二砷和Velcade对bcr/abl+-CD34+细胞增殖、凋亡的影响

目的 研究STI571、三氧化二砷(As2O3)和Velcade在单独及联合应用时对bcr/abl -CD34 细胞增殖、凋亡的影响.方法 提取慢性粒细胞白血病患者骨髓的bcr/abl -CD34 细胞,用STI571、As2O3、Velcade单独及联合处理96 h,通过CCK-8分析及流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡的变化,并用Hoechst33342染色及荧光显微镜技术观察凋亡细胞形态学改变.同时检测上述方案对正常骨髓CD34 细胞的抑制作用.结果 STI571、As2O3及Velcade对bcr/abl -CD34 细胞的作用呈剂量依赖性,其中在低浓度时以抑制增殖作用为主,促凋亡作用不明显.当0.25～2 μmol/L STI571分别与2.5 μmol/LAs2O3及15nmol/L Velcade联合后,抑制率和凋亡率均显著提高,呈相加或协同作用,且对正常CD34 细胞的抑制作用无进一步增强.结论 As2O3及Velcade与STI571联合能够增强对BCR/ABL -CD34 细胞的作用,具有一定临床意义.     

硼替佐米或联合三氧化二砷治疗HL-60白血病细胞移植瘤裸鼠的实验研究

目的 探讨硼替佐米(Bor)单独和联合三氧化二砷(As2O3)对HL-60白血病细胞移植瘤裸鼠的抗瘤作用、作用机制及药物毒性.方法 建立皮下移植瘤裸鼠模型,随机分为4组,即生理盐水(NS)组、Bor单药组、As2O3单药组、Bor联合As2O3组,比较各组的抑瘤作用和裸鼠一般状态的变化,并对移植瘤进行细胞凋亡和免疫组化检测.结果 Bor单独或联合As2O3均能抑制移植瘤生长和延长裸鼠生存时间,并诱导肿瘤细胞凋亡和抑制其增殖,其中以联合用药组效果最好,且未引起重要脏器损害.结论 Bor联合As2O3对HL-60白血病细胞移植瘤裸鼠具有显著的抗瘤作用,此作用可能与诱导肿瘤细胞凋亡和抑制其增殖有关,且无明显毒副作用.     

Potentiation of arsenic trioxide-induced apoptosis by retinoic acid in retinoic acid sensitive and resistant HL-60 myeloid leukemia cells

Objective To study the effect of arsenic trioxide (As(2)O(3)) on non-APL acute myeloid leukemia (AML) cells and the interreactive effect between retinoic acid (RA) and As(2)O(3).Methods RA-sensitive (S) and RA-resistant (R) HL-60 non-APL AML cells were used as an in vitro model. Cell number and trypan blue were used to observe cell growth and survival. Apoptosis was determined by morphological changes, using a DNA laddering assay, terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) fragment end labeling assay and a flow cytometry assay. Results As(2)O(3) induced apoptosis in both HL-60S and HL-60R cells, As(2)O(3)-induced apoptosis was both time- and concentration-dependent in a therapeutically-achievable As(2)O(3) range (0.25-4.0 μmol/L). Both all-trans retinoic acid (ATRA) and 9-cis retinoic acid (9cRA) potentiated As(2)O(3)-induced apoptosis, as measured by quantitative TdT fragment end labeling and flow cytometry assays in both HL-60S and HL-60R cells (P<0 .05, for all RA+As(2)O(3) combinations vs As(2)O(3) alone in both sublines). Conclusions As(2)O(3) may inhibit the growth of non-APL AML cells by promoting programmed cell death. RA can potentiate As(2)O(3)-induced apoptosis even in RA-resistant HL-60 cells in which the classical ATRA response pathway is repressed owing to a homozygous inactivating mutation in the retinoic acid receptor α. As[2]O[3] can have clinical activity in non-APL cases of AML and the enhanced activity might result from the combined As(2)O(3)-RA therapy.     

三氧化二砷在体外抑制结肠癌细胞的研究

目的 在体外观察三氧化二砷(As2O3)对结肠癌细胞系HT-29的抑制作用,并探讨其作用机制,为其是否能作为结肠肿瘤的化疗药物提供理论基础.方法 将不同浓度As2O3作用于HT-29细胞不同时间后,用MTT检测细胞抑制率,光镜及透射电镜观察细胞形态学和超微结构的变化,通过流式细胞仪及共聚焦显微镜分析凋亡及自噬.结果 4.0μmol/L As2O3作用72h可明显抑制HT-29细胞增殖及诱发其凋亡,且抑制率与药物作用时间及浓度成正比.在凋亡早期细胞形态学变化在光镜下可见细胞缩小变圆,在电镜上可见细胞质浓缩、核固缩及自噬溶酶体.4.0μmol/L As2O3作用72h后HT-29细胞凋亡率为25%.结论 As2O3能明显抑制结肠癌细胞系HT-29的增殖,其作用机制与引起凋亡及自噬密切相关.     

三氧化二砷或ATRA对原代APL细胞或HL-60细胞作用研究

目的：探讨三氧化二砷（吡霜）或ATRA对原代APL细胞或HL－60细胞影响,同时分析三氧化二砷与ATRA之间的交叉耐药性。方法:MTT测定HL－60细胞或APL细胞的增殖性。流式细胞仪检测两类细胞的凋亡性,NBT法用于测定HL－60细胞或原代APL细胞的分化性。结果：三氧化二砷与ATRA均能明显抑制APL细胞或HL－60细胞的体外增殖,它们作用机制分别为诱导明显的凋亡或分化。体外三氧化二砷对ATRA耐药HL－60细胞具有明显的抑制增殖作用,并诱导其凋亡发生。结论：三氧化二砷与ATRA无交叉耐药性。研究结果表明,ATRA诱导的高白细胞征并非归因于分化大于凋亡。     

中药“拮新康”对白血病细胞凋亡的影响

为探讨中药“拮新康”对白血病细胞凋亡的影响。采用形态学及ＤＮＡ凝胶电泳方法观察其对白血病细胞株ＨＬ－６０及Ｋ５６２细胞凋亡的影响,结果示：①电镜观察可见凋亡细胞和凋亡小体,ＤＮＡ凝胶电泳可见典型的梯形带改变;②一定浓度范围内的拮新康经适当作用时间后可诱导白血病ＨＬ－６０,Ｋ５６２细胞凋亡,但诱导Ｋ５６２细胞凋亡所需时间较ＨＬ－６０长且剂量较大。提示拮新康可诱导白血病细胞凋亡,与剂量和时间有一定的关     

As2O3对组织因子、纤溶酶原激活物抑制剂-1和-2表达的影响

目的探讨三氧化二砷(As2O3)在诱导NB4、HL-60和THP-1 白血病细胞凋亡过程中对细胞内组织因子(TF)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1和-2 表达的影响.方法使用不同浓度的As2O3处理NB4、HL-60和THP-1 细胞,以生长曲线观察As2O3对细胞体外增殖的影响,并以琼脂糖电泳及流式细胞术观察细胞凋亡情况;用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测经As2O3处理后细胞内TF、PA I-1 和-2抗原含量的变化.结果① 1 μmol/L和8 μmol/L的As2O3分别作用NB4和HL-60细胞24 h后,细胞均出现典型的凋亡;而THP-1细胞在8 μmol/L As2O 3作用24 h后未出现细胞凋亡.② 1 μmol/L As2O3下调NB4细胞内TF抗原含量,与对照组相比差异显著(P<0.01),且TF抗原水平的降低呈As2O3剂量依赖性;而2 μmol/L As2O3诱导NB4细胞凋亡过程中,细胞内PAI-1抗原含量增加(P<0.0 5).③ 8 μmol/L As2O3诱导HL-60细胞凋亡过程中,细胞内TF抗原含量增加(P <0.01),但细胞内PAI-2抗原含量降低(P<0.05).④ THP-1细胞在8 μmol/L As 2 O 3处理24 h后,细胞内TF和PAI-2抗原含量均增加(P<0.05和P<0.01). 结论 As2O3对NB4、HL-60和THP-1细胞内的TF、PAI-1和PAI-2的表达有不同的影响.     

三氧化二砷对人冠状动脉平滑肌细胞作用的体外观察

目的 探讨三氧化二砷对人冠状动脉平滑肌细胞(HCSMC)的促凋亡作用及其对损伤动脉再狭窄防治的意义.方法 将人冠状动脉平滑肌细胞传代培养,将细胞分为正常对照组、三氧化二砷(浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0及5.0 μmol/L)组,通过透射电镜、DNA电泳、原位细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL)、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞活性观察三氧化二砷促细胞凋亡作用,Western印迹检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达变化.结果 随三氧化二砷浓度的增加能够抑制HCSMC的增殖并且该作用与时间及三氧化二砷浓度呈正相关,观察第7天、浓度为5.0μmol/L时细胞生存数为[(4.41±0.10)×105/ml,正常对照组(30.11±0.93)×105/ml差异有统计学意义,P<0.05],透射电镜下可见凋亡小体、DNA电泳可见典型凋亡后梯形条带、TUNEL可见凋亡细胞由(16.0±3.1)%增至(38.7±2.7)%(P<0.05),三氧化二砷上调凋亡促进基因Bax的表达而下调凋亡抑制基因Bcl-2表达.正常对照组均不见典型上述变化.结论 三氧化二砷可促进HCSMC的凋亡,抑制其过度增殖.