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1.
目的探讨重组结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B蛋白用于结核病的诊断价值。方法以Ag85A和Ag85B为抗原,PPD为对照,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果 325例肺结核病组,Ag85A、Ag85B和PPD检测的灵敏度分别为58.2%、62.2%和71.7%。健康献血组、非结核性呼吸疾病组和卡介苗接种阳转组血清同时用Ag85A、Ag85B和PPD检测,Ag85A特异性分别为94.3%、93.0%、73.7%。Ag85B特异性分别为96.4%、96.5%、85.3%。PPD特异性为93.6%、86.0%、67.9%。统计分析显示,Ag85B蛋白和PPD检测非结核性呼吸疾病组,其特异性有显著性差异(P〈0.05)。检测卡介苗接种阳转组阳性率和血清抗体滴度有显著性差异(P〈0.05)。Ag85A和Ag85B同时检测325例肺结核病组血清可显著提高检测的阳性率。结论 Ag85B蛋白抗原有较好的灵敏度和较高特异性,是ELISA的可靠抗原,与Ag85A联用可提高灵敏度,对结核病血清学诊断有较高参考价值。 相似文献
2.
结核杆菌分泌蛋白Ag85A基因的克隆、表达及其诊断价值 总被引:5,自引:0,他引:5
目的:获得重组抗原85A(rAg85A),研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法:应用基因工程技术克隆、表达、纯化Ag85A蛋白,通过Western印迹分析其抗原性。分别以结核分支杆菌纯蛋白衍生物(PPD)或纯化的rAg85A蛋白为抗原,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)及结核病一步检测血清中抗结核抗体。结果:重组质粒pET30a-Ag85A测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的2%左右,Western印迹分析它与抗结核分支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化的rAg85A样品纯度约85%左右,每100ml培养菌可获得2mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值 2s为正常界限值,一步法的特异性和敏感性分别为87.9%和65.6%;PPD分别为93.9%和62.5%;rAg85A分别为93.9%和15.6%。结论:pET30a-Ag85A大肠杆菌工程菌能以包涵 体形式表达rAg85A蛋白,该蛋白具有较高的抗原特异性,但检测抗结核抗体的灵敏度低。 相似文献
3.
目的 通过结核分支杆菌Ag85B蛋白编码基因在大肠杆菌中稳定表达,以获得大量纯化的Ag85B蛋白。方法 采用DNA重组技术构建结核分支杆菌Ag85B基因的表达载体,双酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定重组子,阳性重组子转化大肠杆菌,并诱导表达外源蛋白。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中的表达,对染色的凝胶扫描,以测定目的蛋白表达水平。结果 菌体蛋白经SDSPAGE,含阳性重组质粒的菌体蛋白中出现一条新蛋白带,表达量占菌体总蛋白的33%~38%。Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中表达方式主要是包涵体形式。结论 构建的大肠杆菌重组体能高效表达结核分支杆菌Ag85B蛋白抗原。 相似文献
4.
目的:将结核分枝杆菌Ag85A抗原基因克隆并在大肠杆菌中表达.方法:用PCR方法从结核分枝杆菌基因组中扩增Ag85A抗原基因,然后将其插入到原核表达载体pGEX5T中,构建成pGEX5T-Ag85A重组质粒.经IPTG诱导使该基因在E.coli k802菌中表达,亲和层析法纯化蛋白,Western印迹法验证表达蛋白的抗原性.结果:扩增出了约0.9 kb的单一条带,并成功地构建了pGEX5T-Ag85A重组子;经IPTG诱导后,Ag85A蛋白在k802菌中获得了表达,表达的蛋白条带大小约58 000,与预期结果相符;纯化后获得了较单一的蛋白条带.蛋白纯化前后均可被结核病患者血清特异地识别.结论:成功地克隆了Ag85A抗原基因,并将其在大肠杆菌中进行了表达、纯化,为将其应用于结核病诊断和防治的研究奠定了基础. 相似文献
5.
结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性 总被引:7,自引:4,他引:3
目的 研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85 B的免疫学特性 .方法 用原核表达的 Ag85 B蛋白免疫 BAL B/c小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测 IFN- γ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果 Ag85 B免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答 ,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞的增殖较显著 . MTT方法检测 Ag85 B免疫小鼠的 IFN-γ量为 96 0pg· L- 1 ,而生理盐水对照组的量低于 80 pg· L- 1 .结论 Ag85 B有可能作为新型结核疫苗的组分 相似文献
6.
目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85A编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Ag85A编码基因,用限制性内切酶消化后,插入真核表达载体pVAXl中,转化大肠杆菌DH5α,进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板,用Ag85A引物PER扩增出1041bp特异性片段,以重组子DNA为模板用Ag85A引物PCR扩增为阳性,重组子经限制性内切酶消化后可见目的片段,所测定序列与报道的Ag85A序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株,该DNA疫苗的免疫效果有待进一步研究。 相似文献
7.
目的 基因重组构建以单增李斯特菌、绵羊李斯特菌为载体的新型结核疫苗候选株,并进行蛋白表达验证,为结核疫苗研究和结核防控提供新思路和新方法。方法 以体外基因连接、质粒转化等技术,将本实验室已有的分别编码结核抗原Ag85C、ESAT-6蛋白的两种基因盒,插入携带单增李斯特菌、绵羊李斯特菌同源序列的打靶质粒中。将打靶质粒电转化单增李斯特菌、绵羊李斯特菌,在42 ℃和30 ℃连续传代,利用同源重组杂交原理和基因打靶技术,将打靶质粒携带的两种编码结核抗原的抗原基因盒,分别整合至致病基因(actA和plcB)被敲除的单增李斯特菌、绵羊李斯特菌减毒株及未经减毒的绵羊李斯特菌基因组中。重组菌经蓝白斑、抗生素抗性及PCR筛选,再经Western blot检测其菌体蛋白及分泌蛋白的表达情况。结果 构建了携带抗原基因盒的重组菌株5株,其重组基因序列PCR验证结果均符合预期,且测序验证成功;重组菌不携带红霉素抗性基因,表型特征符合预期;其中,重组菌Li-Rv0129c、Li-ΔactAplcB-Rv0129c按预期表达了结核杆菌Ag85C抗原蛋白,Li-ΔactAplcB-Rv3875按预期表达了结核杆菌ESAT-6抗原蛋白,Lm重组菌未表达相应结核抗原蛋白。结论 成功构建并筛选得到3株以绵羊李斯特菌为载体的、携带结核杆菌Rv0129c(编码Ag85C)抗原基因盒或Rv3875(编码ESAT-6)抗原基因盒,且表达相应抗原蛋白的新型结核疫苗候选株。 相似文献
8.
王博;丁晓;颜贝;高玉婧;蒲静;裴秀英 《宁夏医科大学学报》2013,(7):738-742,747
目的构建结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合表达载体,并进行抗原的生物信息学分析,为候选疫苗筛选奠定基础。方法从结核分枝杆菌H37Rv菌株中分别扩增出Ag85B基因,TB10.4基因,Ag85B-TB10.4;将Ag85B克隆入pET-28a(+)表达载体中,将TB10.4和Ag85B-TB10.4分别克隆入pET-SUMO表达载体中。上述重组质粒转化入大肠埃希杆菌BL21菌中(DE3),经IPTG诱导表达,并对其进行生物信息学分析。结果 (1)成功将结核分枝杆菌Ag85B和TB10.4,Ag85B-TB10.4基因分别克隆入pET28a(+)和pET-SUMO表达载体中,经IPTG诱导蛋白表达后,对经超声裂解的菌液上清进行SDSPAGE电泳,表明获得了与预期蛋白大小一致的表达产物,重组融合蛋白pET-SUMO-Ag85B-TB10.4蛋白分子质量约为54kDa。(2)生物信息学分析显示Ag85B-TB10.4融合蛋白具有多个潜在抗原位点。结论成功构建了重组质粒pET-28a-Ag85B,pET-SUMO-TB10.4和pET-SUMO-Ag85B-TB10.4,并获得了Ag85B,TB10.4和Ag85B-TB10.4的可溶性原核表达产物;生物信息学分析在Ag85B与TB10.4蛋白加入一段蛋白linker后蛋白的亲水性增强,抗原决定簇面积增大,为后续的功能实验研究奠定了基础。 相似文献
9.
分枝杆菌Ag85B多克隆抗体的研制 总被引:1,自引:1,他引:1
目的在原核系统中表达并纯化GST-Ag85B融合蛋白,制备兔抗Ag85B多克隆抗体.方法首先构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒pGEX-Ag85B,将此质粒转入大肠杆菌,诱导表达融合蛋白并加以纯化;然后将纯化的蛋白免疫家兔,提取家兔的抗血清,纯化制备多克隆抗体并进行鉴定.结果成功构建了原核表达质粒pGEX-Ag85B,转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并成功纯化,用纯化的GST-Ag85B融合蛋白成功制备了兔抗Ag85多克隆抗体.结论制备的多克隆抗体为进一步的研究奠定了基础. 相似文献
10.
目的:构建结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌的融合表达载体,制备MBP/Ag85B融合蛋白并将其纯化。方法:常规方法构建重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B,内切酶EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定;重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B转化大肠杆菌,经0.3mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D thiogalactoside,IPTG)诱导表达产生融合蛋白(MBP/Ag85B),Western blot鉴定表达产物。pMAL纯化树脂(Amylose resin)对MBP/Ag85B融合蛋白纯化。结果:重组质粒pMAL-p2-Ag85B经EcoRⅠ/HindⅢ酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳证实Ag85B正向插入pMAL-p2载体,重组菌经IPTG诱导后,有约70kD蛋白表达,与预期的融合蛋白分子量相符,蛋白表达量约占细菌总蛋白量的40%;Western blot显示,MBP/Ag85B融合蛋白与人抗结核IgG抗体呈特异性反应;经Amylose resin纯化后,MBP/Ag85B融合蛋白的纯度可达95%以上。结论:成功构建结核分支杆菌Ag85B重组融合蛋白表达质粒并制备及纯化其融合蛋白,为进一步研究Ag85B生物学功能及其抗原表位分析奠定了物质基础。 相似文献