80株大肠埃希菌靶位基因突变对喹诺酮类药物耐药的影响

目的：探讨大肠埃希菌靶位基因突变对喹诺酮类药物耐药的影响。方法：本研究分别用琼脂稀释法和K-B纸片扩散法药敏试验检测了80株致泌尿系感染的大肠埃希菌环丙沙星MIC的分布和对四种喹诺酮类药物的敏感性；PCR扩增大肠埃希菌的gyrA基因的QRDR区，并进行限制性内切酶酶切分析以检测药物靶位基因可能存在的突变。结果：80株致泌尿系感染的大肠埃希菌中有47株对环丙沙星耐药，耐药率达58．75％，20株对环丙沙星敏感的菌株gyrA基因QRDR区未发生改变，而13株敏感株和47株耐药株gyrA247bp处均存在突变，且这13株对环丙沙星敏感的菌株均对萘啶酸耐药。结论：①80株致泌尿感染的大肠埃希菌对环丙沙星的敏感性和对萘啶酸的敏感性存在明显差异。②gyrA基因是大肠埃希菌喹诺酮类药物的主要作用靶位，在某些菌株中，其247位核苷酸位点的改变仅使细菌对环丙沙星的敏感性下降，其它靶位基因的突变促进细菌的耐药程度增加。     

耐左氧氟沙星大肠埃希菌gyrA/gyrB/parC/parE基因突变研究

目的了解耐氟喹诺酮大肠埃希菌gyrA／gyrB／parC／parE基因突变情况。方法用Kirby—Bauer琼脂扩散法筛选耐左氧氟沙星大肠埃希菌;采用聚合酶链反应（PCR）对gyrA／gyrB／parC／parE基因进行扩增,并进行PCR扩增产物直接双向测序,分析上述基因突变情况。结果PCR扩增耐菌株gyrA／gyrB／parC／parE基因,获得目的片段,测序结果显示,氟喹诺酮耐药基因突变集中在gyrA基因83、87位ser→Leu、Asp→Asn突变;parC基因55位Ser→Leu突变,部分菌株尚存在62位Gln→Glu第二突变点;未发现gyrB、parE突变。结论靶位点gyrA和parC的改变,是本地大肠埃希菌对氟喹诺酮类耐药的主要机制。     

淋病奈瑟球菌耐氟喹诺酮类药物与gyrA和parC基因突变的相关性研究

目的研究淋病奈瑟球菌耐氟喹诺酮类药物与gyrA和parC基因突变的相关性。方法采用E试验测定30株临床分离的淋病奈瑟球菌对环丙沙星的MIC。PCR法检测30株淋病奈瑟球菌喹诺酮耐药决定区（QRDR）相关gyrA和parC基因并测序分析。结果淋病奈瑟球菌对环丙沙星的耐药率达到100％，所有耐氟喹诺酮菌均存在gyrA基因双位点突变，20株高水平耐氟喹诺酮菌（MIC≥mg／L）均存在gyrA基因双位点突变和parC单（或双）位点突变。结论gyrA和parC基因突变在淋病奈瑟菌对氟喹诺酮类药物耐药中起着重要作用，gyrA和parC基因同时突变会导致耐药性增强。     

粪肠球菌Ⅱ型拓扑异构酶基因突变与耐氟喹诺酮类药物关系的研究

目的 检测粪肠球菌对氟喹诺酮类药物的敏感性,探讨Ⅱ型拓扑异构酶基因突变与耐氟喹诺酮类药物的关系.方法 用二倍琼脂稀释法检测6种氟喹诺酮类药物对60株粪肠球菌临床分离株的体外抗菌活性,随机筛选出11株对环丙沙星不同程度耐药菌,PCR扩增gyrA,gyrB,parC,parE基因的喹诺酮耐药决定区(QRDR),产物测序后分析.结果 6种药物的相对抗粪肠球菌活性(MIC50,MIC90)从强到弱为:妥舒沙星＞加替沙星,司帕沙星＞左氧氟沙星＞氧氟沙星,环丙沙星;以妥舒沙星抗菌活性最强,氧氟沙星和环丙沙星抗菌活性最差;序列比较发现,有9株耐药株Ⅱ型拓扑异构酶基因发生突变,突变发生在gyrA基因(6株)和parC基因(9株),其中编码gyrA的Ser83→Ile,Arg和编码parC的Ser80→Ile,Arg的密码子表现出高频突变,gyrB和parE编码的氨基酸序列没有改变;未发现gyrA突变单独存在,同时具gyrA和parC突变的MIC值是仅具parC突变菌株MIC值的4倍以上.结论 氟喹诺酮类抗菌药新品种妥舒沙星、加替沙星和司帕沙星的抗粪肠球菌活性较老一代药物更强;粪肠球菌对老一代氟喹诺酮类药物存在不同程度的耐药;gyrA基因83,87位突变及parC基因80,84位突变都可引起粪肠球菌对氟喹诺酮类药物产生耐药,但以parC基因80住突变为主;低耐药株往往是parC基因单位点突变,高耐药株同时合并有gyrA基因双位点突变.     

氟喹诺酮类药物体外多步诱导鲍曼不动杆菌产生交叉耐药性的研究

摘要：目的：探讨临床分离的鲍曼不动杆菌敏感株在诱导条件下对氟喹诺酮类药物交叉耐药情况。 方法： 采用环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)和加替沙星(GAT)分别对5株鲍曼不动杆菌进行体外多步诱导,采用琼脂平板2倍稀释法测定诱导前后CIP、LVX及GAT对鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度(MIC)。PCR扩增诱导前后菌株gyrA和parC基因并进行酶切分析,选取PCR扩增产物进行测序。 结果：5株鲍曼不动杆菌敏感菌株经体外诱导均产生了耐药现象;鲍曼不动杆菌经氟喹诺酮类药物诱导后MIC显著升高（MIC由0.025～2 μg/mL升高至8～128 μg/mL）;经1种药物诱导耐药后对另外2种药物也产生了不同程度的耐药;PCR-RFLP显示,诱导前菌株gyrA基因、parC基因均能被HinfⅠ酶切,诱导后均不能被HinfⅠ酶切;测序发现诱导后菌株的gyrA基因和parC基因均存在突变。 结论：在体外证实鲍曼不动杆菌对氟喹诺酮类药物逐步耐药的进程,并发现诱导可使菌株gyrA和parC基因产生突变。     

致尿路感染的大肠埃希菌耐喹诺酮类抗菌药的相关耐药基因及耐药机制

目的:调查分析致尿路感染的大肠埃希菌喹诺酮类抗菌药相关耐药基因的流行状况,并探讨其耐药机制.方法:收集丽水市中心医院2008年3月至2010年3月从临床分离的导致尿路感染的大肠埃希菌无重复菌株52株,K-B法检测其耐药性,利用PCR扩增法检测并分析大肠埃希菌质粒介导喹诺酮耐药相关的qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrR、qnrS、aac(6’)-Ib基因以及DNA解旋酶GyrA与拓扑异构酶Ⅳ基因的喹诺酮决定区域ParC,扩增产物测序后经GenBank比对确认.结果:未检测到qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrR及qnrS基因,aac(6')-Ib检出率为26.9％(14/52),经比对未发现aac(6')-Ib-cr阳性菌株;耐药菌gyrA基因喹诺酮耐药决定区氨基酸序列存在两个位点突变;36株耐药菌拓扑异构酶ⅣParC基因测序与敏感菌相比相似性89％～ 95％.结论:致尿路感染大肠埃希菌中未检测到qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrR、qnrS基因及aac(6')-Ib-cr阳性株,DNA解旋酶gyrA和ParC基因变异可能是导致我院尿路感染大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药耐药的主要原因.     

青岛地区大肠埃希菌临床株中blaCTX-M和PMQR基因的检测

目的 调查青岛地区大肠埃希菌临床分离株中β-内酰胺酶基因blaCTX-M和质粒介导的喹诺酮耐药（Plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR）基因的流行性.方法 采用Vitek-2compact系统进行菌株鉴定和药物敏感性测定.聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）法检测菌株中存在的blaCTX M基因和各种PMQR基因,并对PCR扩增产物进行DNA序列测定,确定基因类型.结果 83％的大肠埃希菌对头孢菌素类和氟喹诺酮类药物耐药.84％的大肠埃希菌带有blaCTXM基因,38％、23％、3％、6％和5％的大肠埃希菌分别带有aac（6’）-Ib-cr、oqxAB、qn rB、qnrS及qepA基因.60株菌同时含有PMQR和blacTXM基因,其中10株菌同时含有两种PMQR基因及blacTx-M基因,3株菌同时含有三种PMQR基因及blacTxM基因.结论 blacTxM基因和PMQR基因在青岛地区大肠埃希菌临床分离株中的流行性较高,且常共存于同一株细菌中,这将促进该地区临床细菌多重耐药性产生,加重细菌性感染治疗的难度.     

环丙沙星耐药大肠埃希菌30株的遗传特征

目的 :研究大肠埃希菌对氟喹诺酮类高水平耐药的机制。方法 :用Etest法筛选出 30株环丙沙星高水平耐药 (MIC>32 μg/ml)的临床大肠埃希菌株 ;用梯度平皿法测定诺氟沙星、四环素、氯霉素和氨苄西林的MIC ;己烷和环己烷用来研究菌株对有机溶剂的耐受性 ;聚合酶链反应扩增 gyrA、parC、gyrB 3种基因的喹诺酮类耐药决定区域 (QRDR)并测序。利用Westernblot和Northernblot检测通用调节子 (marA、soxS)和主动外排蛋白AcrA的表达。结果 :30株菌中 ,2 9株多重耐药 ,19株耐受环己烷。所有菌株的 gyrA有双突变 ,即第 83位的丝氨酸变为亮氨酸 ,87位的天冬氨酸替换为天冬酰胺或酪氨酸 ;6株还有第 3个突变 ,即 93位的丙氨酸变为苏氨酸或丝氨酸。在 parC基因上 ,2 4株菌有单突变 ,或是 80位的丝氨酸变为异亮氨酸 (n =2 1) ,或是 84位的谷氨酸变为赖氨酸 (n =3) ;其他 6株菌除了 80位的突变外 ,合并有另一突变 (3株 84位谷氨酸变为甘氨酸 ,3株 10 8位的丙氨酸变为缬氨酸 )。gyrB基因未发现氨基酸的改变。在所有的菌株中未发现marA和soxS表达增加。 19株高产AcrA ,这些菌同时耐受环己烷 ;当诺氟沙星MIC >32 μg/ml时 ,更多的菌高产AcrA(分别为 17/2 4和 2 /6 )。结论 :靶位点 gyrA和 parC的改变 ,是这组细菌对本院氟喹诺     

大肠埃希菌对氟喹诺酮类的质粒介导耐药机制研究

目的了解近年来发现的质粒介导耐药机制在临床分离大肠埃希菌中对氟喹诺酮类耐药所起的作用。方法用MIC琼脂稀释法筛选耐左氧氟沙星大肠埃希菌;采用聚合酶链反应对qnrA、qnrS、qnrB、aac(6′)-Ib基因进行扩增,并进行PCR扩增产物直接双向测序。用接合实验了解是否存在水平传播的氟喹诺酮耐药性传播机制。结果 90株耐氟喹诺酮类大肠埃希菌中7株检出aac(6′)-Ib-cr基因,未检出qnrA、qnrS、qnrB基因。78株符合供体菌标准的大肠埃希菌中有2株接合成功,接合率2.6%。结论该地区存在质粒介导的氟喹诺酮类耐药性的水平传播。     

oqxAB基因在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的流行及传播

目的了解大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中oqxAB基因的流行情况和传播。方法收集72株大肠埃希菌和4u株肺炎克雷伯菌。用PCR扩增oqxAB基因,接合试验验证oqxAB是否存在于质粒上。琼脂稀释法测定环丙沙星对含oqxAB基因接合子MIC和防耐药突变浓度（MPC）。结果72株大肠埃希菌oqxA、oqxB和oqxAB基因阳性分别为15株（15／72）、4株（4／72）和7株（7／72）,49株肺炎克雷伯菌分别为4株（4／49）、1株（1／49）和34株（34／49）。大肠埃希菌环丙沙旱敏感和耐药株中oqxAB基因阳性分别为2株（2／16）和5株（5／56）,肺炎克雷伯菌分别为8株（s／14）和26株（26／35）。含与不含oqxAB基因大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对喹诺酮类抗菌药物敏感率差异无统计学意义。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌PCR扩增产物序列与GenBank中oqxAB基因登录号AB601773．1和FJ975561．1符合率均为99％。大肠埃希菌质粒接合试验中有4株接合成功,环丙沙星对接合子MIC为0．25～0．5mg／I。,较受体菌提高31～62倍。环丙沙星对接合子MPC为8～16mg／L,较受体菌353高32倍。肺炎克雷伯菌质粒接合没有成功。环丙沙星对肺炎克雷伯菌MIC≤（0.0625mg／L,无沦是否含oqxAB基因,MPC为0．25～0．5mg／L;但MIC为0．25～0．5mg／L时,无沦是否含oqxAid基因,MPC为2～16mg／L。结论oqxcAB基因存在于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中,该基因在大肠埃希菌通过质粒传播,oqxAB基因在环丙沙星耐药和敏感株中检出率差异无统计学意义,表明其介导细菌对环丙沙星是低水平耐药。含oqxAB基因的接合子在喹诺酮类压力选择下能产生高水平耐药。肺炎克雷伯菌在环丙沙星压力下产生高水平耐药与oqxAB基因无关,而与其MIC有关。