3种分离流感病毒方法的比较分析

目的：为了比较流感病毒3种分离方法的敏感性及确定流感优势病毒株,1996年5月～9月,对江西南昌地区流感病毒进行了分离和鉴定研究。方法：采用细胞接种培养法、鸡胚羊膜腔接种培养法、鸡胚尿囊腔接种培养法。结果：细胞接种法分离的流感病毒株14株、鸡胚羊膜腔法得12株、鸡胚尿囊腔法得2株,共28株,其中甲1型18株、甲3型4株、乙型6株。结论：流感病毒分离中,细胞接种法与鸡胚羊膜腔接种法同样敏感。鸡胚分离培养中,应高度重视羊膜腔接种法。1996年南昌地区的优势而行珠是甲1型。     

深圳市2002和2003年人群血清流感抗体检测

目的 了解深圳市部分人群的流感病毒抗体水平，为预防和控制疫情提供依据。方法 2002年10月-2003年10月共两次采集人群血清308份，应用近几年国际、国内及广东省流感病毒代表株，以微量半致敏血凝抑制方法进行抗体检测。结果 人群对各型及亚型毒株的抗体阳性率均有上升，其中对A／New Caledonia／20／99（H1N1）的抗体阳性率由40．6％上升至62．1％；对B／HongKong／2001的抗体阳性率由23．8％上升至76.5％；对B／Victoria／504／2000的抗体阳性率由21.3％上升至79．7％；对A／Panama／2007／99（H3N2）的抗体阳性率分别由77．4％升至80．4％。结论 应加强流感病毒抗原变异株和人群流感病毒抗体水平的监测。     

3种分离流感病毒方法的比较分析

目的：为了比较流感病毒３种分离方法的敏感性及确定流感优势病毒株,１９９６年５月－９月,对江西南昌地区流感病毒进行了分离和鉴定研究。方法;采用细胞接种培养法,鸡胚羊膜腔接种培养法,鸡胚尿囊腔接种培养法。结果;细胞接种法分离的流感病毒侏１４株,鸡胚羊膜腔法得１２株,鸡胚尿囊腔法得２株,共２８株,其中甲,型１８株,甲３型４株,乙型６株。     

2种纯化流感病毒方法的比较研究

目的比较2种纯化浓缩鸡胚尿囊液中流感病毒方法。方法将流感病毒鸡胚尿囊液分别采用蔗糖密度梯度离心法(sucrose—density—gradient—centrifugation,SDGC)和红细胞吸附释放法(absorption and release-RBC,AR—RBC)进行纯化,收集纯化病毒测定血凝效价,比较2种纯化方法。结果SDGC法纯化病毒可在30％和45％蔗糖层面交界处的区带中检测到流感病毒,血凝效价为1：2560;用AR—RBC法纯化病毒过程中用新鲜鸡红细胞出现了溶血现象,而用甲醛处理过的鸡红细胞则无此现象,血凝效价均为1：2560。结论与SDGC法纯化病毒比较,AR-RBC法是一种经济实用、操作简便并有较高纯化效率的方法,尤以甲醛处理过的鸡红细胞纯化效果最好。     

鸡新城疫爆发的诊断

对某鸡场发病的依莎产蛋鸡群抽样后，测得其新城疫（ND）血凝抑制抗体效价高达1：（128～1028）。将病死鸡脑组织通过鸡胚接种，收获致死胚的尿囊液能凝集鸡红细胞，血细胞凝集价在1：128以上，能抑制ND阳性血清，不能抑制EDS76阳性血清；经毒力测定，其平均死亡时间为45．4h，静脉致病指数为2．42，脑内致病指数为1．85，说明该分离病毒为1株强毒力型NDV，从而确诊该鸡场爆发ND。     

2002年广东省H3N2亚型流感病毒流行的分子基础

目的 了解广东省2002年H3N2亚型流感病毒流行及抗原性变异情况。方法 用狗肾传代细胞(MDCK)和鸡胚进行流感病毒分离，用交叉血凝抑制实验对毒株进行抗原性分析；提取病毒RNA，用一步法RT-PCR扩增血凝素基因(H3A)，产物纯化后，并将其克隆到pMD18—T Vector，进行序列测定和分析。结果 2002年1-10月共获得流感病毒246株，其中H3N2亚型210株，占85．4％，H1N1亚型2株，占0．8％，B型34株，占13．8％；2002年流感流行的高峰是6月；抗原性分析显示，2002年广东省H3N2亚型流感病毒A／粤/236/2002和2001年流行株A／粤／448／2001以及目前国内代表株A／闽／151／2001的抗原比分别是5．6和4．0；其HAl区氨基酸序列和国际代表株A／悉尼／5／97同源性为94．2％，有19个氨基酸差异，其中发生在抗原决定族A、B、E上的有6个，受体结合部有3个。结论 2002年广东省流感病毒以H3N2亚型为主，其流行的分子基础是基因变异导致抗原性发生漂移。     

H3N2流感病毒变异株抗原性的分子学研究

目的研究分离的H3N2流感病毒变异株的分子学抗原特性。方法将国内分离确认的几株甲3亚型流感病毒进行双向交叉血凝抑制实验，比较抗原性差异；同时进行HA1基因特性分析。结果从抗原性及HA1基因特性分析看出A／深圳／1／99与A／福建／151／2000和A／广东／448／2001差异较小，而与以前流行株A／京防／47／92差异较大。结论A／深圳／1／99发生抗原变异，但变异不大，未产生大规模流行。     

鸡胚尿囊膜模型血管生成定量指标的研究

目的：确定鸡胚尿囊膜模型血管生成指标。方法：30只发育良好的10日龄鸡胚分为3组(每组10只)：rbFGF，kringle 5和NS组。分别吸取rbFGF，kringle 5，NS液10μL于甲基纤维素膜上，加于鸡胚CAM上。用计算机图像分析系统对鸡胚CAM血管生成的血管数目(VN)、血管平均管径(VD)、血管面积(VA)、血管面积／鸡胚CAM面积之比值(VA／CAM)四项指标进行定量。结果：Kringle 5组的VN，VA，VA／CAM值显著低于生理盐水(NS)对照组(P＜0．05)．rbFGF组的VN，VA，VA／CAM值显著高于NS对照组(P＜0．05)，各组间VD无著差异(P＞0．05)。血管定量指标VN和VA，VA／CAM值之间的相关系数分别为：0．967，0．973(P＜0．01)；回归系数分别为0．947，0．935(P＜0．01)．结论：与常规定量指标VA相比，VA／CAM值更为客观有效。     

副粘病毒Tianjin株RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立检测副粘病毒Tianjin株的RT-PCR方法,为临床标本的检测提供参考依据。方法根据副粘病毒Tianjin株F蛋白的基因序列,设计出一对特异性引物,以Tianjin株总RNA逆转录的cDNA为模板进行PCR扩增,然后对该方法的敏感性、特异性进行检测。并将该方法应用于临床84例下呼吸道感染患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)标本的检测。结果通过此方法成功扩增出约500bp的预期条带。将Tianjin株鸡胚尿囊液(血凝效价为1:1280)稀释到320倍时仍可出现阳性条带,对新城疫病毒、甲型流感病毒鼠肺适应株、人副流感病毒Ⅰ型、柯萨奇病毒B3m株、单纯疱疹病毒Ⅰ型及鸡胚尿囊液的PCR检测结果均呈阴性。84例下呼吸道感染患儿BALF标本中,其中2例阳性,阳性率为2.38%,与本实验室建立的双抗体夹心ELISA法检测结果相接近。结论建立的副粘病毒Tianjin株RT-PCR检测方法是一种快速、灵敏、特异的方法,为患病儿童中Tianjin株感染情况的调查奠定了重要的基础。     

清温冲剂抗病毒作用的实验研究

体外实验表明，倍比稀释１：３２０清温冲剂对合胞病毒（ＲＳＶ），单纯疱疹病毒Ⅰ，Ⅱ型（ＨＳＶⅠ，ＨＳＶⅡ）有显著抑制作用。对腺病毒Ⅱ型无影响。清温冲剂５．４ｇ／ｋｇｉｇ能显著降低小鼠肺炎病毒所致小鼠的死亡率；２．４ｇ／ｋｇ与１．４ｇ／ｌｇ组则无效；５．４ｇ／ｋｇ与２．８ｇ／ｋｇ组对鸡胚内流感病毒有抑制作用。     

hVEGF siRNA抑制A549细胞在裸鼠移植瘤的早期生长及血管新生

目的:探讨血管内皮细胞生长因子(human vascular endothelial growth factor,hVEGF)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对A549细胞裸鼠移植肿瘤生长以及对鸡胚尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)上诱导新生血管的影响.方法:分别构建3个表达不同特异性hVEGF siRNA序列的质粒载体,与表达无关序列siRNA质粒载体分别转染A549细胞,用ELISA与realtime RT-PCR选出抑制hVEGF效果最佳的hVEGF siRNA质粒.G418筛选出稳定表达抑制效果最佳的hVEGF siRNA和表达无关序列siRNA的A549细胞,与未转染的A549细胞分别注射于裸鼠皮下,观察3组细胞在裸鼠皮下成瘤及肿瘤生长的速度.鸡胚尿囊实验:孵育至第9天的白皮受精种蛋随机分为4组,分别在鸡胚尿囊膜表面加未培养过A549细胞的DMEM培养液(阴性对照组),未转染的A549细胞培养上清液(阳性对照组),转染hVEGF siRNA的A549细胞培养上清液(hVEGF siRNA组),转染无关序列siRNA的A549细胞培养上清液(无关序列siRNA组),继续孵育48 h,取固定后的鸡胚绒毛尿囊膜于显微镜下计数血管分支点和血管分支长度.结果:hVEGF siRNA使A549细胞表达mRNA水平最大下降70%,分泌hVEGF水平最大下降48%.在裸鼠移植瘤模型中,hVEGF siRNA组比无关序列siRNA组肿瘤平均体积减少58%,肿瘤生长到50 mm3的平均时间延迟5.4 d,移植肿瘤组织匀浆hVEGF含量降低54%;而肿瘤的倍增时间与肿瘤生长速率差异不显著.在鸡胚尿囊膜实验中,阴性对照组加样液的hVEGF含量为0,hVEGF siRNA组加样液的hVEGF含量约占无关序列siRNA组和阳性对照组的40%～44%;血管分支点计数,hVEGF siRNA组,无关序列siRNA组与阳性对照组比阴性对照组增加45%～55%;血管分支总长度hVEGF siRNA组比阴性对照组增加约53%,无关序列siRNA组和阳性对照组比阴性对照组分别增加约97%及99%.CAM血管图上与阴性对照组比较VEGF siRNA组可见增多的血管分支,阳性对照组和无关序列siRNA组上还可以见血管分支增粗、增长.结论:构建并证实质粒介导的hVEGF siRNA能抑制A549细胞分泌VEGF,从而抑制A549细胞诱导鸡胚尿囊膜的血管新生.在裸鼠移植瘤模型中,hVEGF siRNA能抑制肿瘤早期生长,对肿瘤后期的生长速率无显著抑制.     

血管内皮生长因子受体结合肽介导颗粒酶靶向性抗肿瘤血管生成

目的：观察血管内皮生长因子受体（VEGFR）结合肽－颗粒酶B（GraB）融合蛋白抗血管生成的作用。方法：抽提人外周血淋巴细胞总RNA，进行RT－PCR克隆GraBcDNA；抽提LoVo细胞总RNA，进行RT－PCR克隆VEGFR结合肽cDNA，用限制性酶切和DNA测序进行鉴定，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析表达产物，表达产物经亲和层析纯化后，以人血管内皮细胞（ECV304）和鸡胚尿囊膜血管测定其生物学活性。结果：表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中，具有良好的抗原性和特异性，且具有抑内管内皮细胞增殖及破坏鸡胚尿囊膜血管形成的活性，结论：VEGFR结合肽－GraB融合蛋白具有抑制血管生成的功能，在肿瘤生物靶向治疗中有一定潜在价值。     

2004年宁波大学流感爆发病毒株的血凝素基因分析

目的了解宁波地区流行性感冒(流感)病毒株的变异情况。方法采集2004年5月宁波大学流感爆发期间病人的含漱液进行病毒分离、鉴定，并对其中1株病毒的血凝素重链区进行了核苷酸和氨基酸序列分析。结果在9份样品中共分离到流感病毒3株，经血清学试验鉴定为甲3型。与2002年宁波市流感病毒流行株的核苷酸同源性为98．2％-98．3％，氨基酸同源性为96．7％-97．3％；与2003年流行株的核苷酸同源性为98．7％，氨基酸同源性为97．6％；与参考株A／Sydney／05／1997的核苷酸同源性为95．9％，氨基酸同源性为92．7％；与参考株A／Wuhan／359／1995的核苷酸同源性为94．6％，氨基酸同源性为91．2％。结论2004年宁波大学流感爆发的病毒为甲3型。其HA1区序列更接近2003年流行毒株，与A／Sydney／05／1997毒株的同源性要高于A／Wuhan／359／1995。该爆发流行的毒株可能是在宁波以前流行毒株的基础上进化而来的。     

鸡卵核中72000蛋白的纯化及其对混合性结缔组织病的诊断价值

目的：纯化鸡卵核中72000蛋白，并探讨该抗原对混合性结缔组织病(MCTD)的诊断价值。方法：以常规SDS—PAGE和电洗脱技术相结合，分离纯化鸡卵核中72000蛋白，并用于Dot—BLISA诊断MCTD。结果：用该技术分离纯化了鸡卵核中72000蛋白，获得约2000μg具有明显免疫反应性的高纯度抗原。用于检测MCTD病人血清78份，阳性63份，阳性反应率为80．77％；正常人血清100份未发现假阳性；对皮肌炎和多发性肌炎(DM／PM)72份，硬皮病(PSS)48份和系统性红斑狼疮(SLE)126份血清亦无交叉反应出现。结论：以纯化的鸡卵核中72000蛋白为抗原，建立的Dot—ELISA方法，用于诊断MCTD具有良好的特异性和敏感性。     

鸡胚肿瘤血管生成模型的建立

血管生成是肿瘤生长与转移的重要条件，阻断血管生成是抑制肿瘤生长，防止转移的有效方法。建立血管生成模型，对于研究肿瘤的复发与转移及肿瘤血管生成抑制因子提供了条件。本文将鸡胚尿囊膜肿瘤血管生成模型建立方法介绍如下：材料与方法一、鸡胚：孵化箱孵育5－7天经检卵灯检发育正常种蛋（黑龙江省农业现代化研究所提供）二、瘤株；Lewis肺癌；B16黑色素瘤均由上海市肿瘤研究所引进，继续传3代以上。选择生长期组织。剪成1－2mm3小块备用。三、接种方法：（一）5－7天鸡胚在5％CO2、38．5℃湿化空气孵育箱内孵育2天于检卵灯下检视，在…     

深圳市2007年H3N2亚型流感病毒基因特性分析

目的了解深圳市2007年H3N2亚型流感病毒流行情况及血凝素基因特性。方法用狗肾传代细胞（MDCK）和鸡胚进行流感病毒分离。收获病毒后提取病毒RNA，进行逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后送大连宝生物公司纯化及测序。测序结果用Simmonic软件和Mega3．1软件进行序列分析。结果H3N2亚型流感毒株为深圳市2007年流感流行的优势株，与2006年的深圳株比较未发生明显变异，但与2007年的疫苗株相比，有多个位点的氨基酸发生了替换，造成了其间的抗原性发生了一定的变化。结论深圳市2007年H3N2亚型流行株，并未形成一个新的变种。推测是由于与疫苗株之间的抗原性的变异导致了2007年深圳市H3N2亚型流感的流行。     

甲型流感病毒FM1非结构蛋白(NS1)在大肠杆菌表达及其ELISA检测方法建立

目的:构建流感病毒FM1非结构蛋白NS1全长基因表达载体在大肠杆菌(E.coli)中表达,并将表达蛋白用于病毒感染和疫苗免疫小鼠的血清检测.方法:提取流感病毒鸡胚尿囊液RNA,RT-PCR扩增NS1全长基因,克隆到pET28a,转化E.coliBL21感受态细胞,经酶切鉴定及序列分析,筛选出阳性重组质粒pET28-NS1.异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,表达蛋白在变性条件下经镍柱亲和层析纯化,并用Western blot法检测其抗原活性.以纯化的NS1蛋白为抗原建立了检测NS1抗体的ELISA(NS1-ELISA)方法分别对7、15和30天灭活疫苗免疫和病毒感染小鼠血清进行检测.统计分析各组吸光度(A)差异,并以灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等指标对NS1-ELISA进行方法学评价.结果:重组质粒经PCR及酶切鉴定为阳性,核酸序列分析正确.SDS-PAGE和Western blot结果显示表达重组蛋白分子质量约为26 ku.NS1-ELISA法在第15～30天,感染组血清吸光度明显高于疫苗免疫组.结论:成功获得了NSl重组基因表达蛋白,建立的NS1-ELISA法可用于病毒感染和疫苗免疫血清的鉴别检测.     

2002～2003年中国南、北方地区流感监测分析

目的：分析2002年至2003年国内南、北方地区流感的流行特点和主要流行亚型。方法：流感病毒的分离采用鸡胚和细胞分离方法，亚型的鉴定采用间接血球凝集抑制试验。结果：2002年4月至2003年3月，南方12个省、市和自治区监测网点共采集咽拭子标本10111份，分离流感病毒512株，平均分离率为5．1％；北方11个省、市和自治区监测网点共采集咽拭子标本3450份，分离流感病毒397株，平均分离率为11．5％；南、北地区流感病毒均以甲3型和乙型Victoria谱系为流行的优势株；乙型流感病毒存在一定的地区差异．天津、广东、福建等地以Victoria谱系为主，而Yamagada谱系则以内蒙、上海多见；南方地区流感的流行特征为6～8月和10～1月的2个高峰期，而北方地区流感的流行期仅出现在ll～2月．结论：不同地区流感监测结果的分析对于了解流感的流行特点，对疫苗株的选择以及流感的预防控制具有重要意义。     

人内皮抑素部分序列——Es-2的生物活性研究

目的：检测人工合成多肽Es-2抑制血管生成活性及其对肿瘤生长的影响。方法：采用MTT法和鸡胚给药实验，观察Es-2对肿瘤细胞和鸡胚尿囊绒膜（CAM）上血管生成的抑制情况。建立C57BL／6黑色素瘤（B16F10）小鼠模型，以不同剂量皮下注射给药，测量各组小鼠皮下移植肿瘤体积变化和抑瘤率。结果：Es-2对肿瘤细胞无抑制现象；在CAM实验中，新生血管生长受到明显的抑制。C57BL／6小鼠给药10d后治疗组与对照组相比，Es-220mg／kg组对小鼠黑色素瘤生长有一定抑制作用，其效果相当于10mg／kg内皮抑素的治疗效果（P〈0．05）。结论：Es-2具有开发成抗肿瘤药物的前景。     

抗肿瘤抗生素C1027抑制血管生成及其抗肿瘤转移作用

寻找新的血管生成抑制剂，探讨其抗肿瘤转移作用及机理。方法利用鸡胚尿囊膜模型，观察抗肿瘤抗生素Ｃ１０２７对血管生成的抑制作用。经静脉途径给予Ｃ１０２７和丝裂霉素治疗，比较二者对小鼠Ｌｅｗｉｓ癌自发性肺转移的影响；同时进行受体结合分析，观察碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）受体是否为Ｃ１０２７作用的靶点。结果Ｃ１０２７有很强的抑制血管生成作用，在低剂量（０．０１μｇ／鸡胚）即可抑制鸡胚尿囊膜的血管生成，并且可以阻断ｂＦＧＦ与受体蛋白结合，其半数有效抑制浓度（ＩＣ５０）为２．３×１０－６μｇ／ｍｌ。采用等毒性剂量进行比较：Ｃ１０２７（０．１ｍｇ／ｋｇ）和丝裂霉素（１．２５ｍｇ／ｋｇ）对小鼠Ｌｅｗｉｓ癌的肺转移抑制率分别为９８％和７８％，对皮下肿瘤的抑制率分别为８６％和５０％，前者明显高于后者。结论Ｃ１０２７是一种很强的血管生成抑制剂，可能以ｂＦＧＦ的受体为作用靶点，抑制血管生成，并阻断小鼠Ｌｅｗｉｓ癌的自发性肺转移。