中药聪耳胶囊拮抗耳蜗毛细胞老年性损害的实验研究

目的 观察中药聪耳胶囊对C57BL/6J小鼠老年性耳蜗毛细胞损害的保护作用.方法 选择刚出生的C57BL/6J小鼠30只,随机分为对照组10只,聪耳胶囊组20只,其中对照组小鼠为常规饲料喂养;聪耳胶囊组小鼠常规饲料至出生后2个月时开始饮用聪耳胶囊溶液以代替日常饮水.两组至7月龄时终止实验.取出小鼠耳蜗,制作成耳蜗铺片,在光学显微镜下观察并比较两组小鼠耳蜗毛细胞退行性改变状况.结果 对照组C57BL/6J小鼠出现耳蜗毛细胞损伤加重的趋势,且这种随着年龄增长而发生的耳蜗损害遵循着从底回逐渐向顶回发展的规律,同时外毛细胞的损害比同区域的内毛细胞严重.聪耳胶囊组小鼠与同龄对照组小鼠相比,耳蜗毛细胞损害则相对较轻.结论 中药聪耳胶囊可以延缓C57BL/6J小鼠随年龄增长而发生的耳蜗毛细胞损坏,可能具有对抗老年性聋的药理效应.     

caspase-3激活在庆大霉素所致耳蜗螺旋神经元延迟性死亡过程中的作用

目的观察毛细胞丢失后耳蜗神经元延迟性死亡模式以及caspase-3的活动。方法采用3mol的庆大霉素作用离体培养的耳蜗24h,损毁全部毛细胞,分别在毛细胞丢失后1、3、5、7和14d收获样本。采用Neurofilament 200KDa标记耳蜗神经元,TRITC-labeled phalloidin标记毛细胞,免疫荧光染色观察神经元和毛细胞的存活数量,采用WesternBlot的方法检测caspase-3特异降解产物α-spectrin,间接确定caspase-3活动。结果3mol庆大霉素作用于培养的耳蜗24h,耳蜗毛细胞几乎全部消失。螺旋神经元和神经纤维的数目随培养时间的延长而减少,神经元存活从第1天的87%降至第14天的5%。神经元变小且形状不规则,在神经纤维上出现实质小体。检测caspse-3激活的特异降解带-120KDa的灰度值,发现在毛细胞丢失后24h,caspase-3活性明显高于毛细胞丢失的初时(P<0.01)。结论毛细胞丢失引起螺旋神经元死亡具有时间依赖效应,神经元出现凋亡的形态学特征,并且有caspase-3的活动。     

茯苓与豚鼠卡那霉素耳中毒

为探索预防卡那霉素耳中毒的途经，以耳廓反射阀（ＰＲ），耳蜗电位（ＣＭ），听神经动作电位（ＮＩ）和耳蜗铺片为观察指标，本实验观察了茯苓对豚鼠卡那霉素耳中毒的影响。实验结果显示，对照组２ＫＨＺＰＲ阀升高２３．４±３．５ｄＢ，而灌服茯苓煎组２ＫＨＺＰＲ阈仅上升１６．２±３．１ｄＢ（Ｐ＜０．０５）。对照组８０ｄＢ短声诱发的微音器电位和听神经动作电位为３３６．２±３５．１ｕＶ和４５４．２±３５．６ｕＶ，而灌服茯苓组为４６４．２±３５．５ｕＶ和５７５．４±４６．３ｕＶ（Ｐ＜０．０５）。耳蜗铺片显示单用卡那霉素动物外毛细胞损害较严重，耳蜗底回外毛细胞缺失率为５７．５％，而服用茯苓组动物耳蜗底回外毛细胞缺失率为３９．６％（Ｐ＜０．０５）。实验结果说明茯苓可减轻卡那霉素中毒性耳损害。     

胰岛素样生长因子-1抑制庆大霉素引起的小鼠耳蜗毛细胞凋亡

目的探讨胰岛素样生长因子(IGF)-1是否通过Notch信号通路抑制庆大霉素(GM)引起的离体小鼠耳蜗毛细胞凋亡。方法体外培养新生小鼠耳蜗基底膜,在分别含有正常对照培养液(A组)、0.5 mmol/L GM(B组)、0.5 mmol/L GM+10 ng/ml IGF-1(C组)的成分中培养24 h后收集细胞及固定。应用TUNEL法观察各组耳蜗毛细胞的凋亡情况。应用Western印迹、实时定量聚合酶链反应(PCR)观察各组小鼠基底膜Notch2/hes1信号通路的表达量。结果 A组观察到少量凋亡毛细胞,B组耳蜗毛细胞凋亡数量及Notch2/hes1的表达量较A组明显上升(P<0.01),C组细胞凋亡数量及Notch2/hes1的表达量较B组明显下降(P<0.01)。结论 IGF-1通过抑制Notch2/hes1信号通路,减少GM诱导的离体耳蜗毛细胞凋亡。     

刺五加注射液对阿米卡星所致豚鼠耳蜗毛细胞损伤的拮抗作用

目的观察刺五加注射液(ASS)对阿米卡星所致豚鼠耳蜗毛细胞损伤的拮抗作用。方法 40只新生豚鼠随机分为正常对照组、阿米卡星组、刺五加注射液组、刺五加注射液和阿米卡星联合用药组。在耳蜗底回采用内耳微量注射阿米卡星的方式建立豚鼠耳聋模型,连续用药5 d后采用听性脑干反应(ABR)检测各组听阈阈值并对毛细胞结构进行扫描电镜观察。结果实验前ABR测定各组听功能正常;阿米卡星组ABR阈值升高,与正常对照组和刺五加注射液组差异显著,扫描电镜显示阿米卡星组耳蜗毛细胞静纤毛出现融合、散乱、倒伏甚至缺失现象;ASS可显著改善阿米卡星所致听力损伤和毛细胞结构改变。结论 ASS可拮抗阿米卡星所致新生豚鼠耳蜗毛细胞结构损伤造成的听力损害。     

大鼠骨骼肌肌钙蛋白I与死亡及离体时间的相关性探讨

目的 研究大鼠骨骼肌肌钙蛋白I(sTnI)在体和离体两种情况下的降解规律及其相互间的异同,探讨较晚期死后经过时间的推断方法.方法 以大鼠骨骼肌组织为研究对象,利用免疫印迹(Western blot)结合图像分析技术半定量检测不同死亡(离体)时间内大鼠sTnI的含量,观察其与死亡(离体)时间的关系及相互间的异同.结果 大鼠sTnI的含量随死亡(离体)时间延长而逐渐下降,且与死亡(离体)时间的对数值均呈近似的线性关系,但在体情况下要比离体情况下降解慢.结论 sTnI有望用于推断较晚期死后经过时间; sTnI在体与离体条件下的降解情况并不完全一致.     

钙蛋白酶和钙蛋白酶抑素在老年聋大鼠耳蜗中的表达

目的 确定钙蛋白酶在老年聋大鼠耳蜗中的表达和钙蛋白酶-钙蛋白酶抑素平衡变化与老年耳聋的相关性.方法 采用免疫组织化学染色确定钙蛋白酶在老年大鼠耳蜗中的表达水平和组织定位,采用即时PCR技术分析耳蜗提取物中钙蛋白酶和钙蛋白酶抑素 mRNA水平的变化.结果 钙蛋白酶主要分布在耳蜗组织的内外毛细胞、神经元细胞和血管纹.在青年组大鼠耳蜗组织中钙蛋白酶有低水平表达,在老年大鼠耳蜗中的表达明显高于青年组.不同程度耳聋的耳蜗毛细胞、神经元和血管纹的钙蛋白酶表达趋势相似.但钙蛋白酶在血管纹中表达低于神经元和毛细胞.在老年耳聋组,耳蜗提取物中的钙蛋白酶 mRNA水平比青年组增高5.7倍（P＜0.01）,而钙蛋白酶抑素的mRNA水平减低了3倍（P＜0.01）.结论钙蛋白酶-钙蛋白酶抑素系统平衡紊乱在老年耳蜗组织退化和听力障碍发生过程中有重要作用.     

阿米卡星对豚鼠耳蜗毛细胞磷酸化JNK表达的影响

目的 探讨阿米卡星(AMK)对豚鼠耳蜗毛细胞磷酸化c-Jun氨基末端激酶(JNK)表达的影响及耳毒性机制.方法 豚鼠随机分为对照组、AMK 3 d组、AMK 7 d组和AMK 11 d组,AMK组分别连续肌肉注射AMK(400 mg/kg)3、7 d和11 d,对照组肌肉注射等量生理盐水.应用免疫组织化学(SABC)法和显微图像分析技术观察磷酸化JNK(p-JNK)在豚鼠耳蜗毛细胞中的表达,同时结合听觉脑干反应(ABR)测试观察用药前后豚鼠听力的变化.结果 对照组豚鼠耳蜗毛细胞中无p-JNK的表达,而注射AMK后,在豚鼠耳蜗中可见p-JNK表达,并且随着给药时间的延长,p-JNK的表达亦明显增强,同时ABR阈移显著增大,与对照组比较均有显著性差异(P＜0.01).结论 p-JNK可在AMK致毒豚鼠耳蜗毛细胞中表达,且其表达与听力变化高度相关,提示JNK信号通路可能参与了AMK的耳毒性损伤.     

大鼠骨骼肌肌钙蛋白与死亡及离体时间的相关性探讨

目的研究大鼠骨骼肌肌钙蛋白I（sTnI）在体和离体两种情况下的降解规律及其相互间的异同，探讨较晚期死后经过时间的推断方法。方法以大鼠骨骼肌组织为研究对象，利用免疫印迹（Western blot）结合图像分析技术半定量检测不同死亡（离体）时间内大鼠sTnI的含量，观察其与死亡（离体）时间的关系及相互间的异同。结果大鼠sTnI的台量随死亡（离体）时间延长而逐渐下降，且与死亡（离体）时间的对数值均呈近似的线性关系，但在体情况下要比离体情况下降解慢。结论sTnI有望用于推断较晚期死后经过时间；sTnI在体与离体条件下的降解情况并不完全一致。     

链脲佐菌素诱导培养皮层神经细胞损伤作用的观察

目的 研究链脲佐茵素(STZ)对原代培养大鼠皮层神经元是否具有损伤作用.方法 常规原代神经细胞培养的方法,培养新生1 d～3 d的wistar大鼠皮层神经元,通过检测CCK-8,乳酸脱氢酶(LDH)释放检测和calccin-AM染色,观察加入不同浓度STZ(1 μmol/L、10μmol/L、100 μmol/L、1 000μmol/L)36 h后对细胞损伤的作用.结果 STZ处理后对原代培养大鼠皮层神经细胞产生明显的损伤作用,包括细胞活力的下降,活细胞数目的 减少,LDH释放的增加并呈现剂量依赖性.结论 STZ对离体培养的神经细胞具有类似脑室注射同样的神经损伤作用.     

氯离子通道阻断剂对大鼠离体海马神经元凋亡的影响

目的 通过观察氯离子(Cl-)通道阻断剂对一氧化氮(NO)供体3-吗啉斯德酮胺(SIN-1)诱导的大鼠离体海马神经元凋亡的效应,探讨Cl-通道在缺血性脑损伤中的作用.方法 离体培养12 d的SD大鼠海马神经元,随机分为正常对照组、SIN-1处理组、SIN-1处理后和Cl-通道阻断剂组,对各组神经元分别在相应的时间点进行Hoechst荧光染色观察凋亡细胞数和MTT实验定量检测神经元的存活率.结果 SIN-1能明显诱导神经元凋亡(P<0.05),SITS和DIDS呈剂量依赖性地抑制NO诱导的神经元损伤,提高神经元的存活率,与SIN-1组相比差异显著(P<0.05).结论 Cl-通道阻断剂对NO诱导的大鼠海马神经元凋亡有一定的保护作用.     

二甲基氨氯吡咪及氨氯吡咪对心肌肥厚大鼠离体乳头肌力学特性的影响

目的观察并比较二甲基氨氯吡咪（DMA）和氨氯吡咪（AM）对心肌肥厚大鼠离体乳头肌的变力性作用,并探讨其机制。方法采用离体乳头肌灌流方法观察DMA和AM对心肌肥厚大鼠离体乳头肌的变力性作用,并利用L-型钙通道阻滞药和Na^＋-Ca^2＋交换体（NCX）阻断剂探讨其可能机制。结果（1~20）μmol/LDMA对心肌肥厚大鼠离体乳头肌产生剂量依赖性的正性变力作用,升高发展张力（TC）,缩短收缩至最大速率的时间（T-dp/dtmax）和75%舒张时间（T75%）,与用药前相比,差异有统计学（P〈0.05或P〈0.01）。（0.05~1.00）mmol/LAM对心肌肥厚大鼠离体乳头肌产生剂量依赖性的负性变力作用,降低TC,延长T-dp/dtmax和T75%。与用药前相比,差异有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）。DMA对心肌肥厚大鼠离体乳头肌的正性变力作用不能被L-型钙通道阻滞药尼卡地平阻断。DMA对心肌肥厚大鼠离体乳头肌的正性变力作用能被Na^＋-Ca^2＋交换体（NCX）阻断剂氯化镍（NiCl2）阻断。结论DMA（1~20）μmol/L对正常大鼠离体心脏产生剂量依赖性的正性变力作用。（0.05~1.00）mmol/LAM对心肌肥厚大鼠离体乳头肌产生剂量依赖性的负性变力作用。与AM抑制NCX不同,DMA通过激动NCX对心肌肥厚大鼠离体乳头肌产生正性变力作用。     

美托洛尔对哇巴因致心律失常作用的影响

目的观察离体及在体情况下美托洛尔对大鼠哇巴因致心律失常作用的影响。方法采用正常SD大鼠,在离体灌流及在体实验两种哇巴因中毒模型中应用美托洛尔干预,观察不同剂量美托洛尔对哇巴因致心律失常的影响。结果在离体心脏灌流实验中,美托洛尔干预组与哇巴因模型组室性期前收缩次数、室速发生率、室颤发生率异无统计学意义;在体动物实验中,应用美托洛尔后可延长哇巴因致室性心律失常出现的时间,但哇巴因致传导阻滞的时间提前,心室颤动发生率减少,动物存活时间延长。结论美托洛尔在离体条件下可能不发挥抗哇巴因心脏毒性作用,在体条件下可产生对抗哇巴因致室性心律失常的作用,但加重了哇巴因导致的传导阻滞。     

胰岛素样生长因子-1受体在小鼠毛细胞发育过程中的表达

目的 观察在小鼠耳蜗毛细胞中胰岛素样生长因子(IGF)-1受体(IGF1R)分布和表达情况,探讨其生物学特点.方法 制作耳蜗组织铺片,采用荧光免疫组织化学染色方法,激光共聚焦显微镜观察小鼠发育期间(出生后P0-P20)的IGF-1R在耳蜗毛细胞的分布和定位.应用Western印迹及实时PCR法检测新生小鼠毛细胞在出生后不同时期IGF-1R蛋白及mRNA的表达水平.结果 耳蜗组织铺片荧光免疫组织化学染色方法显示:IGF-1R在小鼠耳蜗发育过程中在毛细胞均有表达,部位在细胞膜上.随着年龄的增加表达减少.Western印迹及实时PCR显示小鼠耳蜗毛细胞的细胞膜蛋白及mRNA表达水平随着出生年龄增加而逐渐减少.P0组和P4组,P12组,P20组细胞膜蛋白及mRNA的表达水平相比具有明显差异(P＜0.05),而P12和P20两组间比较无明显差异(P＞0.05).结论 在小鼠耳蜗发育成熟过程中在耳蜗毛细胞IGF-1R均有表达,表达量随着出生年龄增加而减少.推测在内耳细胞发育增殖过程中起重要信号转导作用.     

慢性氟中毒对大鼠耳蜗毛细胞形态改变和听力损失的影响

正氟中毒是一种慢性全身性疾病。近年研究发现~([1]),慢性氟中毒可对患者的听觉造成不同程度的损伤,其具体机制尚不明确。本文通过对慢性氟中毒大鼠耳蜗毛细胞形态学观察,对大鼠听觉脑干诱发反应变化测定,以期为探讨慢性氟中毒大鼠听力损失的作用机制奠定基础。1材料与方法1.1动物分组及模型建立选择出生后28 d体重为60-100 g雄性健康、无耳疾、听力正常的SD大鼠(购自武汉大学动物实验中心),随机分为对照组、低氟     

低剂量T-2毒素对大鼠体外培养软骨细胞DNA损伤的SCGE观察

目的观察低剂量T-2毒素对大鼠体外培养软骨细胞DNA损伤情况,进一步探索大骨节病等真菌毒素中毒疾病的发病机制,预防亚临床损害和促进人类健康。方法单层原代培养的软骨细胞加入不同浓度T-2毒素(0、1、10、100μg/L)培养24 h,用单细胞凝胶电泳(SCGE)观察软骨细胞DNA损伤情况。结果随着T-2毒素剂量的升高,大鼠体外培养软骨细胞的拖尾率增加,且10μg/L组及100μg/L组与对照组相比差异均有显著意义。同时可见,随着T-2毒素剂量的升高,软骨细胞的尾DNA含量、尾长、尾动量均增加,与对照组相比,三项指标差异均具有显著意义。结论低剂量T-2毒素对体外培养的大鼠关节软骨细胞DNA可产生明确损伤,剂量越大,损伤越严重。     

神经生长因子对脑缺血再灌注后大鼠内耳毛细胞凋亡的抑制作用研究

目的观察脑缺血再灌注大鼠内耳细胞损伤与内源性耳蜗干细胞的激活状态以及神经生长因子(NGF)对内耳毛细胞凋亡的抑制作用及其发生机制。方法采用四动脉闭塞法制作大鼠全脑缺血再灌注损伤模型,将72只SD大鼠随机分为3组:A组:假手术组,B组:生理盐水组和C组:NGF组,每组再分24 h和72 h 2个时间段。在C组,我们用人NGF对脑缺血再灌注大鼠进行干预,用免疫荧光染色法检测耳蜗细胞巢蛋白(nestin)、酪氨酸激酶A(trkA)和NGF的表达,用原位末端标记法(TUNEL法)检测耳蜗毛细胞凋亡。用均数±标准差(x珋±s)表示计量资料,用单因素方差分析和LSD-t检验进行统计学分析。结果 (1)与假手术组相比,生理盐水组内耳nestin阳性细胞数在再灌注24 h后增加,再灌注72 h后,耳蜗细胞nestin表达明显增强(t=6.030、12.516,均P0.05),但trkA和NGF表达减低(t=-6.667、-2.415,均P0.05),再灌注72 h后的耳蜗毛细胞凋亡率升高(t=40.836,P0.05)。(2)与生理盐水组相比,NGF组在再灌注24 h和72 h后,耳蜗细胞nestin表达明显减低(t=-4.732、-11.272,均P0.05),再灌注72 h后的trkA和NGF表达均显著增强(t=15.663、17.932,均P0.05),再灌注72 h后毛细胞凋亡率明显下降(t=-35.284,P0.05)。(3)与假手术组相比,NGF组在再灌注24 h和72 h后,nestin表达水平与假手术组接近(P0.05),但在再灌注72 h后的trkA和NGF表达均显著增强(t=8.996、15.517,均P0.05)。结论脑缺血再灌注可引起大鼠耳蜗毛细胞凋亡,促进成熟大鼠内耳细胞nestin阳性表达,诱导内源性耳蜗干细胞的激活;给予NGF可下调nestin表达,明显抑制耳蜗毛细胞的凋亡,其机制可能与上调trkA和NGF的表达有关。     

葡萄籽提取物低聚原花青素对老年大鼠听力的影响

目的观察葡萄籽提取物低聚原花青素(OPC)对老年大鼠听力自然衰退的影响。方法分别给予18月龄Wistar大鼠生理盐水灌胃,OPC灌胃,持续6个月后,观察内耳毛细胞缺失情况,检测听觉脑干反应(auditory brainstem response,ABR)阈值、血清及耳蜗SOD活力。结果与自然衰老组比较,OPC组ABR阈值降低(P<0.01);蜗底外毛细胞缺失减少(P<0.01);SOD活力增强(P<0.01)。结论OPC对大鼠老年性聋的发生具有延缓作用。     

扎考必利对大鼠离体心脏心功能及心律的影响

目的 观察扎考比利对大鼠离体心脏心功能和心律的影响.方法应用Langendorff离体心脏灌流装置,以不同浓度(1 μmol/L、3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L)灌流大鼠心脏,观察药物对离体心脏心功能指标及Ⅱ导心电图的变化.结果 扎考比利对大鼠离体心脏心功能及心律无明显影响.结论与西沙必利相比,扎考比利对心脏收缩功能及舒张功能均无明显作用,是一种相对安全的药物.     

St.Thomas No.2液添加左卡尼汀减轻老年大鼠离体心脏再灌注损伤

目的研究St.Thomas No.2液中添加左卡尼汀(LCN)对老年大鼠离体心脏再灌注损伤的影响。方法使用Langendorff灌注装置建立老年大鼠离体心脏再灌注损伤模型,将SD老年大鼠24只随机分成3组,对照组采用St.Thomas No.2液作为心脏停搏液,LCN1组、LCN2组采用含6、12 g/L左卡尼汀的St.Thomas No.2液为心脏停搏液。离体心脏保存30min再恢复灌注,观察心功能恢复情况,比较冠脉流出液心肌酶浓度以及心肌组织匀浆三磷酸腺苷(ATP)和丙二醛(MDA)含量。结果离体心脏灌注30 min时各组心功能恢复率差别无统计学意义,灌注60 min时LCN1组左心室收缩峰压(LVSPP)恢复率较对照组高(P<0.05),其他指标差异无统计学意义(P>0.05),LCN2组心功能恢复率较LCN1组和对照组高(P<0.05)。冠脉流出液心肌酶浓度和心肌丙二醛含量以对照组最高,LCN2最低(P<0.05);LCN1组、LCN2组心肌组织ATP含量较对照组明显增高(P<0.05)。结论 St.Thomas No.2液中添加左卡尼汀可以减轻老年大鼠离体心脏的缺血再灌注损伤,该保护效果与使用剂量与再灌注时间有关。