Wilson蛋白N端多克隆抗体的制备和纯化

[目的]制备并纯化Wilson蛋白(ATP7B)的N端多克隆抗体，为进一步研究其基因表达蛋白的结构和功能打下基础。[方法]RT-PCR扩增目的基因，GST基因融合载体表达融合蛋白，亲和层析进行蛋白纯化，Thrombin酶切并收集目的蛋白，免疫家兔，ELISA检测抗体滴度，离子交换层析纯化抗体血清，Western blot检测抗体特异性。[结果]ELISA方法检测抗体滴度达到了1：2500，Western blot表明该抗体有很好的特异性，非变性SDS-PAGE显示纯化后的抗体IgG纯度很高。[结论]应用该方法成功制备了Wilson病蛋白质量的多克隆抗体。     

丙型肝炎NS5A基因多克隆抗体的制备

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）NS5A蛋白原核表达载体,获得高产量的纯化目的蛋白,并制备其多克隆抗体。方法：应用聚合酶链反应技术,PCR扩增获得NS5A基因,将NS5A基因插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,转化大肠埃希菌DH5α提取质粒,验证正确后,转化大肠埃希菌BL21中,以IPTG诱导,获得NS5A融合蛋白的可诱导性表达．通过SDS—PAGE电泳、Western blot免疫印迹分析证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni^＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：NS5A融合蛋白表达成功,成功获得了融合蛋白及兔抗NS5A多克隆抗体。结论：成功表达NS5A基因融合蛋白．获得高特异性、兔抗NS5A多克隆抗体,为研究NS5A基因的生物学功能提供了重要制剂。     

BLCAP蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达BLCAP融合蛋白并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a(+)-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,诱导表达带有His标签的目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收后免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性和亲和性。结果:成功获得分子质量约为28 kU纯化的融合蛋白,免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP的多克隆抗体。ELISA测定显示抗体效价可达到1∶10 000。通过Western blot检测证明该抗体有较好的针对BLCAP蛋白的专一性。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性。制备的特异性和效价良好的抗BLCAP的多克隆抗体,能够满足针对BLCAP免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为今后深入研究BLCAP蛋白性质与功能提供了有用的实验工具。     

人胱抑素C的原核表达纯化鉴定及抗血清的制备

目的 构建人胱抑素C(cystatin C, Cys C)的原核表达载体,并用纯化的Cys C重组蛋白免疫家兔,制备Cys C抗血清. 方法 从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,将测序正确的目的基因克隆至pET32 (a)表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA、Western blot进行检测.结果 测序证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符;SDS-PAGE、Western blot结果证实获得相对分子质量为35×103的Cys C 融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni2 亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1∶8 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合. 结论 获得了Cys C重组蛋白及特异性多克隆抗体.     

梅毒螺旋体Gpd-IL-2融合基因原核表达重组体的构建、表达及免疫活性的初步研究

目的 以梅毒螺旋体(Tp)外膜蛋白基因Gpd及细胞因子佐剂IL-2为目的基因,融合构建原核表达干组体pET28a/Gpd-IL-2,表达鉴定并进行免疫活性的初步分析,为进一步开展Tp疫苗动物实验打下基础. 方法 定向克隆构建原核表达重组体pET28a/Gpd-IL-2进行诱导表达;Ni索和层析纯化重组融合蛋白后,Western blot 检测其免疫反应性;免疫新西兰兔评价重组蛋白的免疫原性. 结果 成功构建原核表达重组体pET28a/Gpd-IL-2,表达鉴定及纯化获得相对分子量约为60 kDa的融合蛋白;Western blot检测其能与梅毒阳性血清发生特异性结合,说明两融合基因之间的表达相互没受到太大影响;纯化的Gpd-IL-2重组蛋白免疫新西兰兔能诱导其产生特异性免疫应答,ELISA检测免疫血清中特异性抗体滴度在1∶6400以上. 结论 Gpd-IL-2融合基因重组蛋白具有良好的免疫活性,这为进一步开展Tp疫苗动物实验条件的优化打下一定的基础.     

HCV胞膜蛋白E2基因的融合表达、纯化及多克隆抗体制备

目的 原核表达HCV胞膜蛋白E2,获得抗E2多克隆抗体.方法 利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出831 bp（384～661aa）的E2基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET32a（＋）,IPTG诱导HCV E2蛋白表达,SDS-PAGE和Western Blot法检测蛋白表达,Ni-NTA偶联的琼脂糖吸附柱纯化融合蛋白,薄层扫描及Bradford 法检测纯化蛋白的纯度＞90%;用表达的E2蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA 法检测抗体效价,Western Blot法检测抗体特异性.结果 用原核诱导表达出HCV胞膜蛋白E2免疫新西兰兔后获得多克隆抗体的效价在1∶1 280以上,能特异性识别E2蛋白.结论 成功构建HCV E2基因的原核表达载体,利用原核表达HCV胞膜蛋白E2制备的多克隆抗体能特异性识别E2蛋白.为进一步开展HCV E2蛋白功能和HCV受体的研究奠定了基础.     

肝螺杆菌甲基基团趋化信号转导蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备肝螺杆菌甲基基团趋化信号转导蛋白多克隆抗体。方法将我室保种的重组质粒pET22b+/MCP转化大肠杆菌感受态BL21(DE3),IPTG诱导表达His-rhMCP融合蛋白,将表达的融合蛋白纯化后,免疫家兔制备抗体,间接ELISA法测定抗体效价,以制备的菌体外膜蛋白(肝螺杆菌、胆型螺杆菌及幽门螺杆菌)采用Western blot鉴定抗体的特异性。结果大肠杆菌成功表达His-rhMCP融合蛋白,ELISA法检测抗体的效价达到1∶32000,Western blot检测结果显示抗体可与肝螺杆菌菌体外膜蛋白及His-rhMCP特异结合。结论制备了高效价、高特异性的rhMCP抗体,为进一步研究肝螺杆菌的流行病学奠定了基础。     

人巨细胞病毒US31蛋白特异性抗体的制备及鉴定

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）US31蛋白及其多克隆抗体的制备及鉴定方法。方法：HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至pET21a（+）原核表达载体,构建pET21a（+）/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经Ni-NTA亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的IgG抗体,效价为1:49 600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论：成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875、Rv3804c细胞表位融合蛋白的表达及其免疫原性评价

  目的  评价结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c的细胞表位融合蛋白的免疫原性,为研制新型多阶段结核疫苗提供可靠的靶抗原。  方法  将Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c基因中的细胞表位串联构成融合抗原基因(命名为msv),克隆到原核表达载体pEASY-Blunt E1中,诱导表达后采用亲和层析纯化表达产物,经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用纯化的融合抗原蛋白免疫小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度;分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,采用淋巴细胞增殖法检测其免疫原性。  结果  成功构建了能表达融合抗原基因msv的原核表达质粒;SDS-PAGE和Western blot结果表明,表达产物亲和层析纯化后,获得相对分子质量为41.3×103的目的蛋白;ELISA检测免疫小鼠血清抗体滴度,结果表明特异性抗体效价约为1:81 920;淋巴细胞增殖实验结果表明,抗原致敏的淋巴细胞经融合蛋白msv刺激后明显增殖。  结论  成功表达并纯化出融合蛋白msv,该融合蛋白可诱导小鼠特异性抗体表达和刺激细胞免疫应答,可作为结核疫苗的抗原组分。     

抗P37多克隆抗体的制备 纯化与鉴定

目的：用P37融合蛋白免疫动物制备抗血清,为猪鼻支原体感染作用的分子机制提供依据。方法：诱导表达GST-P37蛋白并以其免疫兔制备免疫血清,ELISA法检测抗血清的效价;Western blot-ting检测抗血清特异性。结果：免疫家兔并纯化抗血清得到特异的抗P37抗体,该抗体能检测到P37蛋白的表达。结论：成功制备了抗P37的多克隆抗体,对进一步研究P37的功能提供了一个有用的工具。     

重组抗原CP4-EPSPS的表达及免疫学活性研究

目的：表达并纯化重组CP4-EPSP合成酶（CP4-EPSPS），研究重组CP4-EPSPS的免疫学活性；为进一步制备单克隆抗体和开发检测CP4-EPSPS的快速诊断试剂奠定基础。方法：诱导表达含转基因大豆CP4-EPSPS的重组载体pET-EPSPS。经Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析纯化，以ELISA、胶体金试条、Western杂交鉴定其免疫活性。结果：重组CP4-EPSPS以包涵体表达为主，上清表达量极低，但胶体金试纸条检测发现上清中CP4-EPSPS抗原活性强；复性包涵体的抗原性与上清的抗原性明显不同。采用扩大培养量、缩小超声破碎重悬体积的方法，从上清中纯化CP4-EPSPS获得成功，ELISA检测此重组抗原免疫小鼠血清抗体滴度可达到1：625，000；Western杂交证实重组抗原免疫血清与CP4-EPSPS标准品有较好的免疫反应性。结论：包涵体的简单复性方法难以恢复其关键的抗原决定簇的免疫原性；运用胶体金试纸条检测重组CP4-EPSPS活性，灵敏度高，简单快捷，对CP4-EPSPS特异检测相关的关键性抗原决定簇的甄别有重要作用，可指导重组抗原的纯化和在免疫学研究、特别是在单克隆抗体开发中的应用。     

HCV核心和截短的包膜蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性

目的:构建含HCV全长核心基因和截短的包膜蛋白E2基因的重组杆状病毒表达载体,研究其表达和抗原性.方法:以含HCV全长cDNA克隆的pGEM-HCJ4质粒为模板,PCR扩增全长的HCV核心抗原基因和截短的E2基因片段,插入转座载体pFastBacHTa构建重组转座质粒pFB-CE2t,转化DH10Bac大肠杆菌,获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-CE2t,以之转染昆虫Sf 9细胞进行外源基因的表达,并对其抗原性进行ELISA检测.结果:SDS-PAGE和Western blot分析表明Bacmid-CE2t在Sf 9细胞表达了HCV C-E2蛋白,并能利用细胞内蛋白酶将其裂解为单独的C蛋白和截短的E2蛋白.纯化后的蛋白能分别与HCV C蛋白、E2蛋白单抗以及慢性丙型肝炎患者血清反应.结论:HCV核心蛋白和截短的E2蛋白在昆虫细胞中成功表达并具有抗原性.     

丙型肝炎病毒外膜E_2／NS_1区基因在大肠杆菌中的表达

将丙型肝炎病毒外膜Ｅ_２／ＮＳ_１基因亚克隆至融合型表达载体，在大肠杆菌中进行表达，表达的重组蛋白经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ鉴定具有丙型肝炎病毒外膜蛋白的抗原性，能与丙型肝炎病毒感染血清发生特异性结合反应，为研究外膜蛋白抗体的意义创造了条件。     

丙型肝炎病毒E2蛋白的高效表达及其临床应用

目的：在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）Ｅ２ 包膜蛋白,并对其进行初步纯化。用纯化的包膜蛋白检测ＨＣＶＲＮＡ 阳性血清中Ｅ２ 抗体,研究其检测Ｅ２ 抗体的敏感性和特异性。方法：将ＨＣＶＥ２ 蛋白基因克隆到原核表达载体中,并转化大肠杆菌。用ＩＰＴＧ 诱导细菌表达Ｅ２ 蛋白,经离子交换层析纯化蛋白。用纯化的包膜蛋白包被微孔板,经ＥＬＩＳＡ方法检测ＨＣＶＲＮＡ阳性血清中的Ｅ２ 抗体。结果：在大肠杆菌表达了相对分子质量为４５ ０００ 的可溶性Ｅ２ 蛋白,占细菌总蛋白量的２１％ ,纯化后,蛋白纯度为８５％ 。用其检测ＨＣＶ 患者血清１７１ 例,Ｅ２ 抗体的检出率为６３％ 。在Ｅ２ 抗体阳性的血清中,部分为抗ＨＣＶ 阴性。结论：Ｅ２ 蛋白的表达及初步纯化的成功,可能用于临床检测。各基因型ＨＣＶＥ２ 包膜蛋白的抗体之间有交叉反应,在目前的抗ＨＣＶ 诊断试剂中加入可溶性、非融合Ｅ２ 包膜蛋白,可以改善抗ＨＣＶ 诊断试剂的特异性和敏感性。     

Cpn0585蛋白的免疫活性及血清学诊断初步评价

目的克隆肺炎嗜衣原体包涵体膜蛋白Cpn0585基因,初步探讨其在血清学诊断中的应用价值。方法构建pGEX-6p-2／Cpn0585重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白,免疫BALB／c小鼠,间接酶联免疫附试验（ELISA）检测小鼠血清抗体滴度,以重组蛋白作为ELBA包被抗原检测血清中CpnIgG抗体和检测36份Cpn-／Ct＋IsG阳性参考血清。结果高效表达和纯化出一相对分子质量约为95kDa的重组蛋白,蛋白质印迹法证明其能与人抗CpnIgG抗体发生反应;在被免疫的BALB／c小鼠体内,特异性IgG抗体的滴度为1：12800;检测104例临床血清标本中的IgG抗体,与以色列SavyonDiagnostics公司SeroCPTMIgGELISA诊断试剂盒的检测结果进行比较,符合率为98．3％。结论表达的Cpn0585重组蛋白具有良好的免疫活性,在Cpn的血清学诊断中具有较高的应用价值。     

肝癌标志物高尔基体蛋白73基因在杆菌中的表达

目的 克隆、表达和鉴定肝癌标志物高尔基体蛋白73 (GP73)基因序列(1028～1327 bp).方法 应用Biosun生物学软件分析GP73全序列,预测其抗原表位,将GP73蛋白基因克隆到表达载体PGEX-4T-2上,构建重组表达质粒PGEX-4T-2/GP73,转化大肠杆菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃...     

细粒棘球蚴热休克蛋白70重组抗原的免疫学特性研究

目的鉴定纯化的重组细粒棘球蚴热休克蛋白70(EgHSP70)的免疫学特性。方法对已构建的阳性表达菌EgHSP70/pGEX-6P-1进行大量诱导表达后纯化,用EgHSP70和HSP70/GST作抗原制剂分别免疫小鼠,制备抗血清,通过ELISA法和Western blot法对重组EgHSP70的免疫学特性进行鉴定。结果ELISA法检测结果表明,原头蚴、囊液等天然抗原均可被免疫小鼠血清识别,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);Western blot显示免疫小鼠血清能够有效识别重组蛋白,同时重组EgHSP70也可被免疫兔血清识别。结论纯化后的重组蛋白EgHSP70具有较好的免疫原性和抗原性,可望作为包虫病疫苗候选分子,值得进一步深入研究。     

结核分枝杆菌Mtb81蛋白的克隆、表达及抗原性分析

目的对结核分枝杆菌Mtb81抗原基因进行克隆、表达及纯化,并评价其抗原性。方法应用聚合酶链反应技术扩增结核分枝杆菌H37Rv Mtb81 DNA序列;将目的基因构建大肠杆菌高效表达株;亲和层析柱纯化重组蛋白;经SDS-PAGE电泳鉴定;通用ELISA法进行重组蛋白的抗原性检测分析。结果获得了结核分枝杆菌抗原Mtb81基因,在大肠杆菌BL21中高效表达,Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中,该纯化的重组抗原敏感性、特异性和准确性分别为:35.8%、98.3%和56.7%,具有良好的抗原性和较高的特异性。结论结核分枝杆菌Mtb81重组蛋白抗原具备良好的抗原性与特异性,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

人精胺/精眯N 1-乙酰基转移酶单克隆抗体的制备及鉴定

 目的制备鼠抗人精胺/精眯N1鄄乙酰基转移酶（SSAT）单克隆抗体,分析该抗体的效价、抗原特异性及其在Western blot和免疫组织化学等分析技术中的可用性。方法在BL21（DE3）中原核表达带6伊His 标签的SSAT 重组蛋白,并用Ni鄄NTA 树脂亲和层析纯化。用SSAT 重组蛋白免疫Balb/C 小鼠,通过杂交瘤技术制备抗SSAT 单克隆抗体,所得抗体的特异性及效价用ELISA、Western blot及免疫组织化学技术检测。结果成功建立了稳定分泌鼠抗人SSAT的单克隆抗体杂交瘤细胞株,该单克隆抗体可用于ELISA、Western blot、免疫组织化学、免疫荧光等分析技术。结论成功制备SSAT 单克隆抗体,为SSAT 相关的分子和病理研究奠定了基础。