缺血延迟预适应对心肌缺血再灌注所致细胞凋亡的保护

目的:分析心肌缺血延迟预适应能否抑制心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡的发生及其发生的可能原因。方法:①实验于2003-08/2004-12在中山大学中西医研究所完成。选用出生两三个月的SD大鼠32只熏雌雄不拘。②随机将大鼠分为4组:正常对照组(不做任何处理),假手术组(只穿线,不结扎),缺血再灌注组(采用经典大鼠冠状动脉结扎,缺血1h,再灌注1h),延迟缺血预处理组(采用经典大鼠冠状动脉结扎,缺血5min再灌注5min,重复3个缺血预处理,24h后,缺血1h,再灌注1h。③采用流式细胞仪测定心肌细胞凋亡率,反转录聚合酶链法检测Bcl-xlmRNA/Bcl-xsmRNA的表达情况,进行Bcl-xl的蛋白免疫印迹分析并利用免疫组织化学染色法检测大鼠心肌核因子κB亚单位P65蛋白的表达。结果:大鼠32只均进入结果分析。①大鼠心肌细胞凋亡率:心肌缺血再灌注组明显升高(P<0.01),延迟缺血预处理组明显低于缺血再灌注组(P<0.01)。②大鼠心肌Bcl-xlmRNA与Bcl-xsmRNA表达的比值:缺血再灌注组明显低于正常对照组(P<0.01),延迟缺血预处理组明显高于缺血再灌注组(P<0.01)。③大鼠心肌Bcl-xl蛋白表达:缺血再灌注组明显减少(P<0.01),延迟缺血预处理组明显高于缺血再灌注组(P<0.01)。④大鼠心肌核因子κBP65蛋白表达:延迟缺血预处理组核因子κBP65发生核转位且明显高于与缺血再灌注组(P<0.01)。结论:心肌缺血延迟预适应可以减少心肌缺血再灌注造成的细胞凋亡,此种作用发生可能与核因子κB活化后促进Bcl-xl的表达,保护线粒体功能有关。     

乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注后细胞凋亡的影响

目的：观察乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注后导致的细胞凋亡的影响。方法：实验于2005—09／2006—05在华中科技大学协和医院麻醉学实验室完成。纳入SD大鼠81只，先以“随机数字表法”分为糖尿病组（链尿佐菌素55mg／kg腹腔注射诱导，45只大鼠诱导成功36只，成模率80％）和正常对照组（36只）。以穿线结扎左冠脉制备心肌缺血再灌注模型，两组大鼠再分别随机分为假手术组、缺血再灌注组和乙酰半胱氨酸治疗组，每组12只。乙酰半胱氨酸给药组：100mg／kg（用蒸馏水配成50g/L的溶液）灌胃，2次／d，连续1周，手术前1h再腹腔注射乙酰半胱氨酸150mg／kg；其他各组给予等量的蒸馏水。反转录-聚合酶链反应和免疫蛋白印迹分析法检测心肌半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA和蛋白的表达。原位末端标记法检测心肌凋亡细胞并计算凋亡指数。同时检测丙二醛含量和肌酸激酶同工酶活性。结果：去除诱导糖尿病模型失败的9只大鼠，最终有72只大鼠进入结果分析。①糖尿病与正常假手术组之间相比，丙二醛、肌酸激酶同工酶、凋亡指数、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA和蛋白的表达水平差异无显著性意义（P〉0．05）。（砻缺血再灌注后，糖尿病和正常乙酰半胱氨酸治疗组丙二醛、肌酸激酶同工酶、凋亡指数、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA和蛋白的表达水平均低于各自对应的缺血再灌注组（P〈0．01），高于各自假手术组（P〈0．01）。（固上述参数糖尿病缺血再灌注组高于正常缺血再灌注组（P〈0．01），糖尿病乙酰半胱氨酸干预组高于正常乙酰半胱氨酸干预组（P〈0．01）。结论：乙酰半胱氨酸可抑制缺血再灌注后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA和蛋白的表达，减少缺血再灌注引起的糖尿病和非糖尿病大鼠心肌细胞凋亡，对缺血再灌注心肌有保护作用，但糖尿病组的疗效低于正常组。     

环磷腺苷葡胺对大鼠心肌缺血再灌注损伤后细胞凋亡和NF—kB表达的影响

目的观察环磷腺苷葡胺对大鼠心肌缺血再灌注损伤后细胞凋亡及NF—kB表达的影响。方法30只SD大鼠随机等分为3组：对照组为假手术组仅进行开胸手术；缺血再灌注组心肌缺血30min，再灌注100min；环磷腺苷葡胺注射组在心肌缺血前静脉输注环磷腺苷葡胺2mg／kg。心肌细胞凋亡和NF-KB表达分别采用TUNEL法和免疫组织化学方法检测。结果环磷腺苷葡胺注射组大鼠心肌细胞凋亡指数及心肌组织中NF—kB表达明显低于缺血再灌注组（P〈0．01），但高于对照组（P〈0．01）。结论应用环磷腺苷葡胺注射液可明显降低缺血再灌注损伤大鼠的心肌细胞凋亡和NF-kB表达。     

顿抑心肌中腺嘌呤核苷酸转运体基因的动态表达

目的：通过观察大鼠心肌缺血再灌注模型中腺嘌呤核苷酸转运体（adenine nucleotide translocator，ANT）的动态表达情况，初步探讨顿抑心肌中ANT各单体的表达变化对心肌能量代谢的影响及其与心肌细胞凋亡的联系。 方法：实验于2003—11／2004-04在解放军南京军区南京总医院心脏内科实验室和动物实验中心完成。将60只雄性SD大鼠随机分为对照组（n=8）和手术组（n=52）。将手术组大鼠冠状动脉左前降支结扎闭塞20min，然后剪断结扎线再灌注。按缺血后再灌注4h、1,3，7d4个时相分4组进行观察（n=13）。用反转录-聚合酶链反应计算机凝胶成像分析系统测定心肌中ANT1，ANT2 mRNA相对含量。对照组大鼠不干预。 结果：60只大鼠进入结果分析。（DANT1 mRNA含量在缺血后再灌注4h达高峰（P〈0．05）。在再灌注1d开始降低，再灌注3d时明显下降（P〈0．05），逐渐恢复到对照水平（P〉0．05），再灌注7d的结果与再灌注3d相似。②ANT2mRNA含量在再灌注4h时无明显增加，在再灌注1d开始升高并达峰值（P〈0.01），从再灌注3d开始明显下降（P〈0．01），并恢复到对照水平（P〉0．05）。再灌注7d结果与再灌注3d相似。 结论：①顿抑心肌中ANT的含量增加，顿抑心肌中能量短缺的现象可在缺血后再灌注3d内得以纠正。②心肌缺血可以导致细胞凋亡，心肌细胞凋亡主要发生在缺血再灌注早期（24h内），而且在体内存在时间短暂（缺血后再灌注3d内恢复）。     

解偶联蛋白-2在大鼠缺血预适应心肌中的表达

目的：探讨解偶联蛋白-2（UCP2）在心肌缺血预适应（IPC）心肌保护中的作用。方法：采取结扎左冠状动脉的方法复制大鼠心肌缺血再灌注模型。IPC组行3次缺血5min，再灌注10min的预处理。缺血再灌注（IR）组与IPC组行30min缺血及120min再灌注；对照组不结扎左冠状动脉。电镜观察心肌超微结构。据Rainio评分标准进行心肌超微结构损伤程度的半定量分析，随机选取20个低倍视野，计算平均心肌细胞凋亡数。采用RT—PCR和Western印迹法检测心肌中UCP2的表达。结果：IPC组Rainio评分和心肌细胞凋亡率均低于IR组（氏0．05），IPC组的UCP2 mRNA和蛋白表达水平均较IR组明显增加（P〈0．01）。结论：IPC可减轻心肌超微结构损伤程度和减少细胞凋亡。IPC可诱导UCP2表达，提示UCP2可能参与了IPC的心肌保护作用。     

细胞凋亡的线粒体信号通路在大鼠缺血延迟预适应抗心肌细胞凋亡机制中的作用

目的：以细胞凋亡的线粒体途径为切入点,探讨心肌缺血延迟预适应抑制心缺血再灌注（MI/R）后细胞凋亡的可能机制.方法：SD大鼠分为正常对照组、假手术组、缺血再灌注组、延迟缺血预处理组.缺血再灌注组采用经典大鼠冠脉结扎,缺血1h,再灌1h.延迟缺血预处理组采用缺血5min,再灌5min,反复循环3次,24h后缺血1h,再灌1h.流式细胞仪测定心肌细胞凋亡率,进行细胞色素C（CytC）和凋亡诱导因子（AIF）的Western blotting分析及Caspase-3活性测定,并利用免疫组织化学染色法检测大鼠心肌HSP70的表达.结果：与缺血再灌注组相比较,心肌缺血预处理24h后可以减少MI/R后心肌细胞凋亡率,抑制CytC和AIF自线粒体向胞浆的释放及caspase-3的活化,上调HSP70蛋白表达.结论：心肌缺血延迟预适应可以减少MI/R造成的细胞凋亡,机制与其诱导HSP70的生成,抑制细胞凋亡的线粒体信号转导途径有关.     

IL-1β在缺血预处理对大鼠肾脏冷缺血再灌注损伤中第二窗保护作用的实验研究

目的：探讨IL-1β在缺血预处理对大鼠肾脏冷缺血再灌注损伤模型中第二窗保护的作用。方法：36只SD大鼠制备成肾脏冷缺血再灌注损伤模型，随机分为假手术组（A组）、冷缺血再灌注组（B组）、缺血预处理组（C组）。免疫组化观察IL-1β表达，测定肾功能变化，TUNEL法检测肾组织细胞凋亡情况。结果：B组、C组血浆尿素氮、肌酐测定值均〉A组（P〈0．01），而C组〈B组（P〈0．01）；B组、C组IL-1β表达及原位细胞凋亡指数均〉A组（P％0．01），而C组〈B组（P〈0．01）；肾组织损伤的病理分级显著减轻（P〈0．01）。结论：缺血预处理对肾脏冷缺血再灌注损伤第二窗具有保护作用，其机制可能与IL-1β表达减少有关。     

依达拉奉对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡的影响

目的：观察依达拉奉对心肌缺血／再灌注后心肌细胞凋亡的影响。方法：选择30只健康SD大鼠，采用结扎冠状动脉左前降支后再通的方法复制心肌缺血再灌注的动物模型，随机分为假手术组（n=10）、缺血／再灌注（I／R）组（n=10）和药物（依达拉秦）组（n=10）。检测各组3h后心肌组织的超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量。并用免疫组化法测定局部凋亡相关因子Bcl-2、Fas的表达，比较各组间差异。结果：与假手术组比较，I／R组中反映氧化损伤程度的MDA明显升高（P〈0．01），抗氧化酶SOD则明显减少（P〈0．01），Fas含量升高（P〈0、01），Bcl-2含量明显减少（P〈0、01）；药物组较I／R组MDA含量明显减少（P〈0．01），SOD活性显著增加（P〈0．01），Fas含量明显降低（P〈0，05），Bcl-2含量明显增加（P〈0．01）。结论：依达拉奉具有抗心肌缺血再灌注损伤作用，其机制可能是通过调节Bcl-2和Fas介导的细胞凋亡而实现     

人参和氯沙坦对缺血再灌注心肌细胞Bcl-2表达的影响

背景：心肌细胞凋亡与缺血再灌注损伤直接相关，Bcl-2表达与细胞凋亡密切相关。临床和实验证实人参和氯沙坦均能改善心肌缺血，对缺血再灌注损伤有明显保护作用，但两者对缺血再灌注心肌细胞损伤有何异同？目的：探讨人参和氯沙坦对大鼠缺血再灌注心肌细胞内Bcl-2mRNA和蛋白质表达的影响。设计：随机对照实验。单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科，华中科技大学同济医学院神经生物学系。材料：实验于2002-11／2003—04在华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科实验室完成。采用健康成年Wistar大鼠40只，体质量200-250g，雌雄不限，随机分为假手术对照组，缺血再灌注组，人参治疗组和氯沙坦治疗组，每组10只。方法：缺血再灌注组，人参治疗组和氯沙坦治疗组均造模，假手术对照组不造模。氯沙坦治疗组术前2h，术后立即和术后24h分别给予氯沙坦20mg／kg（1mL），灌胃各1次；人参治疗组术前2h，术后立即和术后24h分别给予红参煎剂（1g／mL,1mL／次）灌胃各1次。假手术对照组和缺血再灌注组分别于相同时间给予相同容积的生理盐水灌胃。用原位杂交和免疫组化分别检测人参和氯沙坦治疗后的大鼠缺血再灌注心肌细胞内Bcl-2mRNA和蛋白质含量，并与对照组比较。主要观素指标：人参和氯沙坦治疗后的大鼠缺血再灌注心肌细胞内Bcl-2mRNA和蛋白质的表达水平，并与对照组比较。结果：实验大鼠40只均进人结果分析。①氯沙坦组与对照组心肌细胞内Bcl-2mRNA，蛋白含量无明显差别（P〉0．05）。②人参治疗组Bcl-2mRNA含量和Bcl-2蛋白表达高于缺血再灌注组（P〈0．05或0．01）。结论：人参治疗组Bcl-2mRNA及Bcl-2蛋白表达均较氯沙坦治疗组高，提示人参防治心肌缺血再灌注损伤抑制心肌细胞凋亡与氯沙坦不同。     

粉防己碱对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

目的：建立大鼠心肌缺血／再灌注损伤模型，观察粉防己碱对缺血再灌注损伤过程中心肌细胞凋亡的干预，初步探讨其保护缺血再灌注损伤心肌的作用机制。 方法：实验于2005-03／2006-04在华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科及心血管病研究所完成。①选择健康雄性SD大鼠48只，随机数字表法分为假手术组、缺血／再灌注损伤组、粉防己碱组，各16只。粉防己碱由华中科技大学同济医学院药理学系提供，纯度〉98％。②造模前20min，粉防己碱组腹腔注射粉防己碱3mg／kg（约1．2mL）。缺血／再灌注损伤组、假手术组均腹腔注入生理盐水1．2mL。③缺血／再灌注损伤组、粉防己碱组大鼠建立缺血／再灌注损伤模型。当结扎点远端心前壁变紫、心电图显示ST段抬高为冠状动脉结扎成功，松扎后抬高的ST段回落1／2以上为再灌注成功的标志。实施30min缺血，再灌注24h。假手术组不造模，在肺动脉圆锥与左心耳间穿线，不结扎，30min关胸，24h后处死。④再灌注结束后检测血清中乳酸脱氢酶活性、心肌组织丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和心肌梗死范围，并应用DNA琼脂糖凝胶电泳及原位末端标记法检测各组凋亡细胞及凋亡指数。 结果：48只大鼠全部进入结果分析。粉防己碱对大鼠缺血／再灌注损伤的心肌保护作用；①生化指标测定值：心肌细胞受损后，与缺血／再灌注损伤组比较，粉防己碱组乳酸脱氢酶活性、丙二醛含量均显著降低（t=4．337-10．810，P〈0．01），超氧化物歧化酶活性显著增高（t=4．352，P〈0．01）。②梗死范围：粉防己碱组可明显减少心肌梗死范围，与缺血／再灌注损伤组比较差异有显著性意义[（23．28&;#177;4．38）％，（43．76&;#177;6．30）％，t=7．552，P〈0．01]。粉防己碱对大鼠心肌缺血／再灌注损伤细胞凋亡的影响：①琼脂糖凝胶电泳：假手术组心肌细胞DNA电泳呈一条大分子DNA片段，为正常DNA带型；缺血／再灌注损伤组DNA电泳呈“梯形结构”，可见形似云梯状的DNA片段。为凋亡的典型表现；粉防己碱组的DNA琼脂糖凝胶电泳显示DNA梯形条带明显减弱。②原位末端标记：假手术组偶见凋亡心肌细胞；缺血／再灌注损伤组可见大量胞核呈深浅不一棕褐色的凋亡心肌细胞；粉防己碱组凋亡心肌细胞较缺血／再灌注损伤组明显减少，但较假手术组有所增加。③凋亡指数：与假手术组比较。缺血／再灌注损伤组、粉防己碱组凋亡指数均显著增高[（0．65&;#177;0．39）％，（19．36&;#177;5．28）％．（8．62&;#177;2．45）％，t=9．096～10．006，P〈0．01]；但粉防己碱组凋亡指数明显低于缺血／再灌注损伤组（t=5．224，P〈0．01）。 结论：粉防己碱预处理可明显减轻心肌再灌注损伤、抑制细胞凋亡及抗氧自由基，为保护濒死心肌提供了机会窗口。