肝癌相关抗原基因的筛选和阳性克隆的序列分析

克隆肿瘤相关抗原基因,从分子水平上研究其结构与功能,对于深入了解肿瘤的发生机制很有帮助。本研究利用自制的肝癌特异性单克隆抗体（ｍＡｂ） Ｆ１１,筛选肝癌细胞ｃＤＮＡ表达文库,获得１个阳性克隆,并对其进行了序列测定及同源性比较分析。１材料和方法１． １材料抗肝癌ｍＡｂ Ｆ１１［１］为本室制备、纯化。肝癌细胞ｃＤＮＡ表达文库（载体为 λｇｔ１１）由本室构建。测序用试剂ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ为ＰＥ公司产品。测序仪为ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３３７ＸＬ型。１．２方法克隆的筛选按…     

人黑色素瘤抗原MAGE—3基因的克隆与表达

目的 克隆人黑色素瘤特异抗原MAGE-3基因,以制备肿瘤DNA疫苗。方法 用RT-PCR方法制备MAGE-3基因,以哺乳细胞高效表达质粒pCI-neo为载体,构建重组DNA疫苗。重组体用载体上的通用引物为测序引物,鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化293细胞,用免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3基因的表达。结果 正确构建了MAGE-3/pCI-neo重组质粒,并且在转化细胞中检测出了MAGE-3的表达。结论 成功地构建了重组MAGE-3/pCI-neo肿瘤核酸疫苗,可以进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及疗效观察。     

一个新的MAGE—1表位为肝癌细胞表面HLA—B7分子递呈

目的：肿瘤抗原的存在是机体识别肿瘤并激活免疫系统的物质基础。机体抗肿瘤免疫以细胞免疫为主,故寻找被T细胞识别的肝癌细胞抗原肽,为肝癌免疫治疗奠定基础。方法：对于肝癌细胞系HHCC（HLA-A2,A29,B7,B51）,应用细胞膜酸洗技术使抗原肽从细胞膜表面脱落,经过凝胶层析,反相高效液相色谱层板得到不同组份多肽,高效液相色谱=质谱仪联用技术获得抗原肽的一级结构。通过氨基酸锚定位点分析,预测其HLA配体类型;互联网上氨基酸同源性分析确定其同源性用技术获得抗原肽的一级结构,通过氨基酸锚定位点分析,预测其HLA配体类型,互联网上氨基酸同源性分析确定其同源性序列;人工合成抗原肽,HLA同型树突状细胞递呈合成抗原肽刺激特异性CTL反应,^51Cr杀伤实验检测CTL对肿瘤细胞系的杀伤作用。结果：经过反相高效液相色谱层析后可以获得10多个组份,其中一个组份经过液质联用鉴定和氨基酸同源性分别确定其序列为EPVTKAEML,是黑色素瘤抗原-1,MAGE-1（121-129）表位。由HLA-B7分子递呈,体外诱导实验表明其可以诱导出较强的CTL反应。结论：液质联用技术是寻找抗原肽的有效方法,MAGE-1抗原肽EPVTKAEML地于HLA-B7阳性及阳性的肝癌患者具有潜在的免疫治疗作用。     

PTEN基因对人肝癌细胞系HHCC作用的研究

目的：研究PTEN基因对人肝癌细胞系HHCC细胞恶性表型及凋亡的影响。方法：将PTEN真核表达载体pBabe-PuroPTEN及空质粒pBabe-Puro，通过脂质体介导的基因转染方法，转入该基因表达缺失的HHCC细胞系中，嘌呤霉素筛选获得稳定表达PTEN基因的转染细胞。通过平板克隆形成试验、DNA凝胶电泳、相差显微镜和电镜，观察PTEN基因对人肝癌细胞系HHCC恶性表型及凋亡的影响。结果：转染后的细胞，经原位杂交、免疫组织化学检测证实，有PTEN mRNA及其蛋白的表达；平板克隆形成试验证实，转染PTEN基因后，细胞形成克隆的能力降低；转染PTEN的细胞在相差显微镜和电镜下可出现典型的凋亡形态学改变；DNA琼脂糖凝胶电泳呈现出明显的梯状条带。结论：外源性PTEN基因导入HHCC细胞后，可降低HHCC的细胞的恶性表型，并促进凋亡发生。     

HLA-A2相关肝癌抗原肽的初步研究

目的寻找肝癌细胞表达的肿瘤抗原肽.方法应用0.2mol/Lph3.0柠檬酸缓冲液酸洗肝癌细胞系HHCC,经Sephadex G-25过滤及反向高效液相色谱分离纯化,获得可与HLA-Ⅰ类分子结合的不同组分短肽.将其与抗原加工缺陷的HLA-A2+T2细胞反应,进行肿瘤细胞特异性表位测定,同时进行CTL杀伤鉴定.结果获得4个可与HLA-A2结合的组分,其中2个可以激发较强的CTL杀伤反应.结论肝癌细胞系HHCC中存在能够激发CTL特异性反应的肿瘤抗原肽,并证实上述寻找肿瘤抗原肽的技术路线具有可行性.     

HLA—A1相关肝癌抗原肽的初步研究

目的 寻找肝癌细胞表达的肿瘤抗原肽。方法 应用0．2mol/Lph3.0柠檬酸缓酰洗肝癌细胞系HHCC,经SephadexG-25过渡及反向高效液相色谱分离纯化,获得可与HLA－I类分子结合的不同组分短肽。将其与抗原加工缺陷的HLA－A2T2细胞反应,进行肿瘤细胞特异性表位测定,同时进行CTL杀伤鉴定。结果 获得4个可与HLA－A2结合的组分,其中2个可以激发较强的CTL杀作畈应。结论 肝癌细胞系HHCC中存在能够激发CTL特异性反应的肿瘤抗原肽,并证实上述寻找肿瘤抗原肽的技术路线具有可行性。     

卵巢上皮癌相关肿瘤抗原新基因的研究

目的探讨卵巢癌相关肿瘤抗原新基因在卵巢癌诊断和免疫治疗中的应用价值。方法利用网上生物信息学分析软件对筛选到的55个克隆的核苷酸序列进行分析,并检测其中8个新基因在卵巢癌患者和正常女性血清中的抗体。结果55个克隆的核苷酸序列代表45个卵巢癌抗原基因,其中8个是国内外首次发现的在GeneBank中尚未登记的新基因,是具有免疫原性的功能基因。其中OCY-142新基因是抑癌基因BARD1的可剪切变异体,可被CD4+和CD8+T细胞识别。8个卵巢癌肿瘤抗原新基因中7个在卵巢癌患者血清中的阳性率显著高于正常人,7个卵巢癌肿瘤抗原新基因对卵巢癌患者和正常女性进行联合检测,其敏感性和特异性达到96.9%和95.2%。CAl25异常的卵巢癌41例患者中,OCY-142单独检测的阳性率为95.12%,而CA125正常的卵巢癌57例患者中,OCY-142检测发现21例(36.9%)阳性。结论这些卵巢癌相关肿瘤抗原新基因在卵巢癌患者血清中产生的相应抗体可能成为卵巢癌的新的血清学标志物,可能是卵巢癌免疫治疗理想的新靶点。     

肝癌相关抗原HAg18-1ELISA诊断药盒对肿瘤病人血清学诊断的临床意义

本文报告用HAg18-1 ELISA诊断药盒测定肝细胞肝癌病人,胃、肠、肺、乳腺等多种恶性肿瘤病人血清及对肿瘤组织浸液的HAg18-1阳性率,其数值分别为80.0％～86.1％、44.2％～76.2％和62.0％。肝细胞肝癌的阳性率最高,在多种恶性肿瘤病人中广泛交叉存在、且血清阳性的6个病例手术探查肝脏正常。但HAg18-1在术后临床无病阶段的多种恶性肿瘤病人及非肿瘤对照者阳性率很低,分别为4.2％及7.5％。HAg18-1与肝细胞肝癌的关系,十分有助于肝细胞肝癌的诊断及治疗,其与肝细胞肝癌以外的多种恶性肿瘤关系,使其具备对这类肿瘤病人的随访监护治疗效应的价值。     

肿瘤抗原肽研究新进展

肿瘤抗原肽的寻找已成为当前肿瘤研究领域的一大热点。它包括癌基因蛋白抗原肽、致癌病毒基因抗原肽、肿瘤特异性抗原肽和组织特异性分化抗原肽等。这些抗原肽在与MHC类分子结合后 ,提呈到细胞表面被相应T细胞受体识别 ,从而激活细胞毒性T淋巴细胞的活性 ,使机体产生特异性抗肿瘤免疫应答。因而它们在肿瘤免疫接种和免疫治疗等方面有着广阔的应用前景。     

p27KIP1-绿色荧光蛋白融合基因在HCC-9204细胞中的瞬时表达

目的：观察p27^KIP1—绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白在肝癌细胞系HCC—9204中的表达及定位。方法：根据p27^KIP1基因的编码顺序，应用PCR技术将p27^KIP1基因3′末端终止密码TAA突变为TGT，并通过基因重组技术将其与GFP基因融合。再采用脂质体转染法，将p27^KIP1—GFP融合培因转人HCC-9204细胞中，用荧光显微镜观察其表达情况。结果：DNA序列测定的结果显示，p27^KIP1基因与基因库中已收录的p27^KIP1的序列相比较，仅有1个核苷酸的差异。荧光显微镜显示，在转染GFP基因的HCC—9204／GFP细胞中，荧光均匀地分布于整个细胞；而在转染融合基因p27^KIP1—GFP的HCC—9204／GFP—p27细胞中，绿色荧光主要见于核内。结论：转染的HCC—9204细胞能高效表达融合基因p27^KIP1—GFP，且定位于细胞核内，与p27^KIP1基因的表达方式相同。     

pLTRNL介导HSV—1 TK基因长期稳定转染人肝癌细胞系的建立

以脂质体基因转移技术，将含ＨＳＶ－１ＴＫ基因的重组逆转录病毒载体ｐＬＴＲＮＬ转染人肝癌细胞系ｈＨＣＣ，经抗生素Ｇ４１８选择，筛选出ＨＳＶ－１ＴＫ基因转染的ｈＨＣＣ再进行克隆化和亚克隆化后扩大培养，应用ＰＣＲ，ＲＴ－ＰＣＲ及ｓｌｏｔ－ｂｌｏｔ狭槽印迹等方法。对转染细胞基因组ＤＮＡ和ＲＮＡ进行了鉴定。结果表明，ＨＳＶ－１ＴＫ基因已整合入ｈＨＣＣ细胞基因组中，且有ＴＫ基因的ｍＲＮＡ转录。ＨＳＶ－１ＴＫ基     

原发性肝细胞癌RIT1基因的突变和扩增

目的　探讨 RIT1基因突变和扩增在肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)的发生情况及其与发病的关系。　方法　采用 PCR直接测序法检测 5 0例原发性 HCC患者的肝癌组织和非癌肝组织RIT1基因在所包含的 6个外显子的全序列寻找突变位点 ;并用荧光定量 PCR法检测 RIT1基因的扩增情况。　结果　在 5 0例肝癌组织中 1例出现第 5外显子编码区 2 4 1位核苷酸 G/ C变异 ,其对应密码子改变为GAG81CAG,编码氨基酸改变为 Glu81Gln,该氨基酸变异位于 GTP结合的保守功能域内 ,该病例的非癌肝组织以及其余 4 9例的肝癌组织和非癌肝组织均未发生此种改变 ;在 5 0例肝癌组织和非癌肝组织中均出现 5′- UTR(起始密码子前 2 1位核苷酸 ) G/ C变异 ;在获得有效扩增数据的 4 3例肝细胞癌患者中 ,11例有 2～2 97倍的 RIT1基因扩增 ,扩增率为 2 5 .6 %。　结论　基因扩增是 RIT1基因在肝细胞癌的激活方式之一 ,可能与肝细胞癌的发病有关 ,而点突变方式可能意义不大。     

Expression of MAGE tumor-associated antigen in thyroid carcinomas

The 12 members of the MAGE gene family encode tumor-specific antigens that are recognized by autologous cytotoxic T lymphocytes. The MAGE genes are expressed not only in melanoma but in other malignant tumors as well. There is, however, little information on their expression in thyroid carcinomas. We studied the expression of the MAGE-3 antigen in human thyroid carcinomas to explore the possibility of specific immunotherapy using MAGE peptides. Tumor tissue samples of thyroid carcinomas were obtained from 60 patients. Standard pathohistologic analysis followed by immunohistochemistry analysis of MAGE-3 expression was performed in all patients. The overall expression rate of MAGE-3 antigen in thyroid carcinomas was 65%. According to histological types of thyroid carcinomas, expression rate of MAGE-3 antigen was as follows: 0% in anaplastic, 20% in medullary, 29% in follicular, and 80% in papillary thyroid carcinomas (p<0.01). On the other hand, significantly higher expression of MAGE-3 antigen was observed in classical subtypes of papillary thyroid carcinomas and in small papillary tumors sized to 1 cm in diameter. These findings demonstrated that MAGE-3 antigen expression seems to be particularly high in the small, typical papillary carcinomas, thus suggesting that MAGE-3 gene abnormality is an early step in thyroid cancer progression.     

Expression of oncogenes and tumor suppressor genes in human hepatocellular carcinoma and hepatoblastoma cell lines.

The expression of nine oncogenes (c-myc, N-myc, N-ras, H-ras, k-ras, abl, fos, src, and raf) and two tumor suppressor genes (p53 and RB) were studied by northern blot hybridization in six human hepatocellular carcinoma or hepatoblastoma cell lines (PLC/PRF/5, Hep3B, Hep G2, 2.2.15, HLE, and HLF) and in a human embryonic lung fibroblast cell line (WI-38) to look for differences that might be associated with the presence (PLC/PRF/5, Hep3B, and 2.2.15) or absence (Hep G2, HLE, and HLF) of integrated hepatitis B virus (HBV) DNA. The levels of expression of the oncogenes and tumor suppressor genes were unrelated to the presence or absence of integrated HBV-DNA. Furthermore, the intensity of expression of these oncogenes was no greater in the 2.2.15 cell line (consisting of Hep G2 cells transfected with hepatitis B virus) than in untransfected Hep G2 cells.     

鼻咽癌细胞株SUNE1中EB病毒LMP1全基因克隆及部分序列的测定

目的　研究广东地区鼻咽癌（ＮＰＣ） 细胞株ＳＵＮＥ１ 中ＥＢ病毒ＬＭＰ１ 基因的结构特征。方法　利用聚合酶链反应从ＳＵＮＥ１ 细胞基因组中扩增ＬＭＰ１ 全长ＤＮＡ,并克隆到ｐｃＤＮＡ３ 载体中,采用Ｓａｎｇｅｒ 双脱氧末端终止法测定ＳＵＮＥ１ＬＭＰ１ ３ 个外显子及２ 个内含子覆盖的序列,并与病毒原型Ｂ９５８ＬＭＰ１ 进行比较分析。结果　克隆到ｐｃＤＮＡ３ 中的ＳＵＮＥ１ＬＭＰ１ 全基因长度为２－６ ｋｂ,测序长度为１３１２ ｂｐ,与Ｂ９５８ＬＭＰ１ 比较,核苷酸与氨基酸的同源性分别为９８－５ ％ 和９６ ％ ,核苷酸及氨基酸变异主要在第３ 外显子,但无Ｃ端３４３～３５２ 密码子３０ 个碱基的缺失,第１ 外显子上有ＸｈｏⅠ酶切位点的丢失。结论　广东地区ＮＰＣ细胞株ＳＵＮＥ１ 中,病毒ＬＭＰ１ 基因与原型株之间尽管致瘤性存在差异,但仍具有较高的同源性。提示ＮＰＣ细胞中ＬＭＰ１ 的致瘤特征可能并非由于ＬＭＰ１ 基因某些特定核苷酸突变所致     

Association of Notch1 with vasculogenic mimicry in human hepatocellular carcinoma cell lines

Background and aims: According to recent findings, some tumor cells function as endothelial progenitor cells to initiate tumor vasculogenesis, known as “vasculogenic mimicry” (VM). Notch1, the key regulator of vasculogenesis and embryonic differentiation, has shown a correlation with a poor prognosis in hepatocellular carcinoma (HCC). We attempted to elucidate the relationship between Notch1 and the vascularization of HCC. Materials and methods: HCC cell lines were assayed for tube formation and low-density lipoprotein (LDL) absorption. The translation level of targets of interest was verified using western blot. Notch1 was silenced in HepG2, BEL-7402 and HCCLM6 using lentivirus shRNA. A hypoxic culture was conducted in an anaerobic culture chamber to induce VM in HepG2. Samples from 53 patients with HCC, i.e., 5 with metastasis and 48 without were tested for Notch1⁺ cells and CD34 negative plus Periodic Acid-Schiff (PAS) positive structures, respectively. Results: BEL-7402 and HCCLM6 were capable of tube formation and LDL absorption in vitro, while HepG2 was negative for both. Notch1 down-regulation suppressed endothelial marker expression and greatly impaired tube formation. After hypoxic culture, the tube formation capacity of HepG2 was significantly enhanced, along with an increase in Notch1 expression. Notch1 was strongly and profusely expressed in all 5 cases of distant metastasis, while 19 of the 48 cases without metastasis were sparsely positive (P < 0.05). Notch1 positivity was mainly seen in the cytoplasm and nuclei. VM structures were only found in 2 cases from the metastasis group (P < 0.05). Conclusions: HCC is capable of VM. Notch1 might serve as a potential target for VM development in HCC.     

MAGE—1基因在人食管癌中的表达及基因克隆

目的 研究MAGE-1基因在人食管癌中的表达,分析MAGE-1抗原能否作为食管癌的治疗性候选疫苗。方法 采用RT-PCR方法检测了MAGE-1基因在30例食管癌组织和相应癌旁正常组织中的表达;并从食管癌组织中扩增了MAGE-1cDNA全长序列,经酶切后与pET-30a( )质粒载体连接,经初步酶切鉴定后,进行DNA序列分析。获得克隆基因的核苷酸序列。结果 MAGE-1基因在食管癌组织中的表达率为43%（13/30）,在30例相应癌旁正常组织中未见表达;成功地克隆了MAGE-1cDNA全长序列。结论 由于MAGE-1基因在食管癌中高频率表达以及MACE-1抗原具有HLA-I类分子限制性CTL识别表位,因此,MAGE-1抗原可以作为食管癌免疫治疗的候选疫苗。     

肝癌组织中N—ras基因突变和p53蛋白表达

目的：研究Ｎ－ｒａｓ和ｐ５３基因与肝癌发生，发展的关系。方法：应用多聚酶链反应－单链构象多态性分析法（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）和免疫组化法，检测２９例肝癌中的Ｎ－ｒａｓ基因突变和ｐ５３蛋白的表达。结果，１３例肝癌ｐ５３蛋白阳性（４４．８％），表明广西地区肝癌中曾普遍存在ｐ５３基因的突变，肝癌及癌旁组织中Ｎ－ｒａｓ基因在第２～３７密码子间的突变率分别为７９．３１％和８０．７７％，２２例有２个以上突变位点（