重组腺病毒介导的血管内皮生长因子165在大鼠骨髓基质细胞中的表达

目的 利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒(Ad-VEGF165),并观察Ad-VEGF165转染大鼠骨髓基质细胞(bMSCs)后VEGF165的表达情况. 方法 将PCR获取的VEGF165目的 基因插入到pAATrackCMV中,构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165,经Pme I酶切线性化后,采用电穿孔法转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中,挑选同源重组菌落.提取质粒并用Pac I酶切鉴定.线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞,包装成重组腺病毒颗粒.并扩增收集重组腺病毒,测定病毒滴度.体外培养大鼠骨髓基质细胞,Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞,转染后在荧光显微镜下观察.转染的骨髓基质细胞采用RT-PCR和ELISA法检测VFGF165的表达水平. 结果 经酶切鉴定,基因测序及绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒,并扩增出109pfu/ml的高滴度重组腺病毒.Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞后,RT PCR证明转染的骨髓基质细胞内有VEGF165mRNA表达.ELISA检测发现转染组上清液中VEGF165蛋白分泌量明显高于对照组(P＜0.01). 结论 pAdEasy-VEGF165转染对骨髓基质细胞的增殖能力无明显影响,而且骨髓基质细胞能够表达并分泌VFGF165为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础.     

构建人补体膜辅助调节蛋白真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NIH 3T3细胞

目的：构建人补体膜辅助调节蛋白（membrane cofactor protein，MCP）真核表达载体并利用壳聚糖（Chitosan）转染小鼠NIH 3T3细胞。方法：应用PCR方法，从MCP-pGEM-T Easy Vector克隆相关的DNA序列，插入到具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2／HygroB中，构建pSecTag2／HygroB-MCP真核表达质粒，并进行酶切鉴定及序列测定；利用壳聚糖包裹质粒，转染小鼠NIH 3T3细胞，并对转染细胞进行抗MCP免疫组织化学染色。结果：MCP基因大小为1065bp，与Genebank中记载的人MCP cDNA序列结果基本一致；抗MCP免疫组织化学染色显示转染细胞胞浆弥漫阳性。结论：成功构建了人MCP真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NIH3T3细胞，为进一步探讨及研究转基因肝脏奠定了基础。     

人HGF基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的构建和鉴定

目的 :构建携带肝细胞生长因子 (HGF)的逆转录病毒载体 ,并建立高效、稳定生产HGF的包装细胞株。方法 :以pcDNA3.0 HGF质粒为模板进行PCR反应扩增出HGF基因全长序列 ,亚克隆至逆转录病毒载体pMSCVneo构建重组逆转录病毒质粒 ,以脂质体介导转染包装细胞PT6 7,经G4 18筛选 ,进而挑选抗性集落扩大培养后 ,用靶细胞NIH3T3测定病毒滴度 ,筛选出高效产毒细胞株。扩大培养后进行RT PCR鉴定HGFmRNA的表达。扩大培养NIH3T3细胞抗性集落 (NIH3T3/HGF) ,并用细胞培养上清进行人肝癌细胞系HepG2的扩散试验。结果 :PCR反应扩增出 2 2 0 0bp的HGF基因 ,构建了重组逆转录病毒表达载体pMSCV HGF ,测序鉴定正确。经脂质体介导转染包装细胞、G4 18筛选和NIH3T3测定病毒滴度 ,筛选出具有最高病毒滴度 (8.8× 10 7cfu /ml)的细胞集落 ,扩大培养后建立高效表达HGF的包装细胞株PT/HGF ,RT PCR证实HGF基因在PT/HGF中有转录。NIH3T3/HGF培养上清可使HepG2细胞扩散 ,形态改变。结论 :成功构建了携带HGF的逆转录病毒载体pMSCV HGF ,并建立了稳定、高效生产有活性的HGF的产毒细胞株PT/HGF。     

慢病毒介导的绿色荧光蛋白转基因小鼠的制备及鉴定

目的以携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒为载体制备转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台。方法将慢病毒表达载体FUGW与ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix按1∶2比例混合,用LipofectamineTM2000转染293FT细胞,包装出的病毒经浓缩后以293T细胞测定病毒滴度。采用受精卵卵周隙显微注射的方式制备转基因小鼠。出生小鼠用PCR法检测GFP基因整合情况,并在荧光体视显微镜下鉴定外源基因的表达情况。结果病毒包装过程中,转染后24h即可见GFP表达,72h时293FT细胞的转染效率达95%以上,镜下可见大量绿色荧光。包装出的慢病毒滴度为106U/ml,经浓缩后可达108U/ml。PCR检测显示,F0代小鼠GFP PCR阳性率为70.27%(26/37)。荧光体视显微镜下观察荧光小鼠所占比例,F0代为65.2%(15/23),F1代为55.0%(11/20),荧光强度在两代个体中相当。F0代、F1代中GFP均呈广泛表达。结论制备出携带GFP可传代的转基因小鼠,建立了慢病毒载体介导的转基因小鼠制备技术平台。     

pEgr.p-TNFα的构建及其在NIH3T3细胞中的辐射诱导表达

目的分离和扩增Egr-1启动子,构建pEgr p-TNFα质粒,探讨不同辐射剂量对被转染的NIH3T3细胞中TNFα表达的影响.方法用PCR方法从小鼠基因组DNA中分离并扩增出Egr-1启动子,构建pEgr.p-TNFα表达质粒,脂质体介导的转染法转染小鼠NIH3T3细胞,用ELISA方法检测不同剂量X射线照射后的TNFα表达水平.结果本实验得到的Egr-I启动子序列与报道基本一致,Egr-1启动子和TNF α cDNA正确插入表达载体;各照射组在不同剂量X射线照射后8 h,TNFα表达水平均高于假照射组(P＜0.05～0.001).结论本实验分离和扩增的Egr-1启动子具有辐射激活和诱导下游基因表达增强的功能,低剂量辐射可激发并启动下游基因表达,在基因-放射联合治疗中有重要意义.     

重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP的构建与鉴定

目的人血管内皮生长因子（的hVEGF165）为靶基因,增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因构建体的复制缺陷型腺病毒载体,为基因治疗牙周进一步再生奠定了基础。方法质粒的pDC316-的VEGF165为模板,PCR扩增基因片段进行消化,获得的hVEGF165用于连接到含有绿色荧光蛋白标记基因重组质粒的消化方法的pDC316-MCMV-EGFP质粒载体,PCR鉴定和双酶切证实成功构建重组质粒;使用ADMAX包装系统,改造的质粒共转染用质粒骨架293包装细胞系和重组病毒的扩增;扩增病毒的离子交换纯化;TCID50测定病毒粒子和效价的数目;的荧光的荧光显微镜重组腺病毒表达。结果 PCR鉴定,酶切分析和测序证实成功构建人VEGF基因的携带绿色荧光蛋白标记（的hVEGF165）重组质粒的pDC316-的hVEGF165-MCMV-EGFP和同源重组腺病毒Ad5的-的hVEGF165-EGFP的成功。扩增和纯化后,腺病毒颗粒的数量测量5.4×1011VP/mL,约2.0,为1.8×1010CCID50/mL的滴度OD260/OD280值。结论成功构建携带hVEGF165基因重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP并获得高滴度病毒颗粒,为hVEGF165基因功能研究以及细胞移植、基因治疗提供有效的工具。     

小鼠ATP酶β亚单位真核表达载体的构建和细胞内定位研究

目的构建小鼠ATP酶β亚单位(ATPaseβ)真核表达载体,并观察其在哺乳动物细胞中的表达定位情况。方法取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到ATPaseβ编码序列,将其连接到pMD18-T载体上,然后以pMD18-ATPaseβ为模板扩增得到ATPaseβ编码序列,再将其克隆到真核表达载体pcDNA3/HA上。采用脂质体转染法转染NIH 3T3细胞及293细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果 PCR、双酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3/HA-ATPaseβ构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要定位于细胞质,细胞膜上也有表达,而在293细胞中只表达于细胞质。结论成功构建了带有HA标签的小鼠ATPaseβ真核表达载体,该载体能够在哺乳动物NIH 3T3及293细胞中有效表达并正确定位,为进一步研究ATPaseβ的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

大鼠B细胞淋巴瘤-2基因的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的 克隆大鼠B细胞淋巴瘤-2(bcl-2)基因全长cDNA,构建及鉴定大鼠bcl-2基因慢病毒表达载体.方法 采用RT-PCR法从大鼠脾脏组织中扩增全长bcl-2 cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,测序正确后,将基因连接到慢病毒载体pGC-FU(含EGFP 基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-bcl-2,将pGC-FU-bcl-2质粒和包装质粒(pHelper1.0、pHclp-er2.0)共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞后,细胞即可分泌携带bcl-2基凶的重组慢病毒.将重组慢病毒感染293T细胞,通过Western blot-ring鉴定目的 蛋白bcl-2的表达.结果 经DNA序列分析测定证实大鼠bcl-2基因序列与GenBank中一致;pGC-FU-bcl-2中携有正确的bcl-2基因,并能转染人胚肾上皮细胞;pGC-FU-bcl-2及包装质粒共转染包装细胞293T细胞能产生重组病毒pGC-FU-bcl-2;目的 基因bcl-2能被重组慢病毒高效地转导人人胚肾上皮细胞中,并达到稳定表达,荧光显微镜下能直接观察到荧光蛋白,Westernblotting能榆测到bcl-2蛋白在靶细胞中的表达.结论 成功克隆了大鼠bcl-2基因并构建了重组慢病毒载体,包装出高浓度慢病毒,转染人胚肾上皮细胞后能够稳定表达bcl-2基因,为进一步研究该基因的功能及细胞凋亡相关疾病的治疗奠定了基础.     

转甲状腺素蛋白真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建转甲状腺素蛋白(TTR)的真核表达载体,观察其在NIH 3T3细胞中的表达及定位.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到TTR编码序列,将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,构建质粒pcDNA3-TTR-HA.重组质粒通过PCR、酶切测序等证明构建正确后经脂质体转染NIH 3T3细胞,固定并染色后通过荧光显微镜观察该融合蛋白的表达及定位.结果 重组质粒经鉴定证明构建正确.转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要分布在细胞质中.结论 成功构建带HA标签的TTR真核表达载体,该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为深入研究TTR在细胞内的相关生物学功能奠定了基础.     

带FLAG标签小鼠HuR真核表达载体的构建及其生物学功能的鉴定

目的 构建人抗原R (HuR)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达并初步分析其生物学功能.方法 提取NIH3T3细胞总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到小鼠HuR编码序列,酶切后克隆至pcDNA3.1-FLAG载体;重组载体经PCR、酶切、测序鉴定正确后瞬时转染NIH3T3细胞,采用W...     

新型核素报告基因系统hERL/核素标记雌二醇的实验研究

目的 在体外细胞摄取实验及在体显像基础上,评价新型核素报告基因系统人ER配体结合域( hERL)/核素标记雌二醇(E2)应用的可行性,为其用于基因治疗的监测提供依据.方法 以内部核糖体进入位点序列(IRES)方式构建携带hERL和治疗VEGF165的重组质粒pDC316-hERL-IRES-VEGF165(简写为EIV),将其用腺病毒包装构建重组腺病毒复合体(Ad-EIV).采用悬浮贴壁法从SD大鼠股骨和胫骨原代提取骨髓MSCs并培养.将Ad-EIV和脂质体2000包裹重组质粒(LipoEIV)分别转染MSCs,利用RT-PCR和Western blot,对hERL和VEGF165 mRNA和蛋白质水平的表达分别进行检测.测定Ad-EIV组、Lipo-EIV组和未转染组MSCs对125I-E2在不同时间(1、3、6、9、12和24h)的摄取率.将转染Ad-EIV的MSCs注射至大鼠左前肢、未转染MSCs注射至右前肢后1d,注射16α-18 F-17β-E2(18F-FES)进行micro PET/CT活体显像.2组间均数比较采用t检验,相关性研究采用Pearson相关分析.结果 Ad-EIV转染MSCs后RT-PCR检测示hERL和VEGF165 mRNA的表达随着感染滴度的增加而增加,且呈正相关(r2分别为0.953和0.966,P均＜0.05);感染复数(MOI)=25、50、75和100时,其mRNA表达高于Lipo-EIV组.Western blot检测蛋白质水平的表达也得到同样的结果.Ad-EIV组和Lipo-E1V组MSCs对125I-E2的摄取率均随时间延长逐渐增高,24h最高,分别达到( 10.94 ±0.30)％和(8.93±0.18)％;各个时间点2种载体转染组均明显高于未转染对照组(3.54％～5.52％;t值分别为15.489～26.560、10.523～24.204,P均＜0.05),而Ad-EIV组摄取率高于Lipo-EIV组(t=4.132～16.168,P均＜0.05).Micro PET/CT大鼠活体显像显示注射Ad-EIV转染的MSCs之左前肢放射性浓聚明显高于对侧.结论 报告基因hERL可以通过腺病毒转染、脂质体包裹等多种形式转染细胞并成功表达,应用核素标记E2可以对其进行探测和显像.应用腺病毒转染报告基因的方式转染率更高.     

细胞移植术治疗兔下肢缺血模型的影像学评价

目的:利用血管内皮生长因子(VEGF_(165))基因转染体外诱导的血管内皮祖细胞(EPCs)治疗慢性下肢缺血兔模型,探讨CTA、DSA及多普勒超声检查对缺血下肢侧支循环形成评价的敏感性,并比较各种检查方法的差异性。方法:①制作高脂血兔,梯度离心法分离兔骨髓单个核细胞(MNCs),用内皮细胞专业培养基(EGM-2)诱导培养EPCs,脂质体介导转染携带增强型绿色荧光蛋白EGFP标记的VEGF_(165)质粒转染EPCs,流式细胞仪检测整体转染率。②制作兔单侧下肢缺血模型,随机分为A、B、C组,分别移植注射未转染EPCs(EPCs组)、VEGF_(165)转染的EPCs(EPC/VEGF组)、EGM-2培养基(EGM-2组),多种方法检测移植效果。结果:①自兔骨髓诱导出的梭形贴壁细胞为EPCs。②流式细胞仪检测其总体转染率约22.5%。③DSA、CTA、多普勒超声及免疫组化显示移植基因修饰后的EPCs组比未转染EPCs组能更好地促进缺血肢体新生血管形成,改善缺血肢体血运。DSA较CTA对新生血管显示更清晰,各处理组内对2种检查结果进行比较,结果均具有统计学意义(P0.05)。结论:CTA、DSA及多普勒超声均能客观评价缺血下肢侧支循环建立情况,DSA对新生血管的显示上优于CTA,但DSA为有创检查,技术要求高,CTA为无创性检查,对缺血下肢评价时宜首选CTA检查,超声多普勒用于对治疗效果的长期随访。     

^99Tc^m-亚锡葡庚糖酸钠结合GGC序列监测基因治疗的实验研究

目的 构建以金属结合肽（双甘氨酰半胱氨酸,即GGC序列）为核素报告基因、人VEGF165为治疗基因的重组腺病毒载体,以99Tcm-GH为报告探针,探讨该报告系统监测治疗基因表达的可行性.方法 pcDNA3-VEGF165质粒线性化后,将金属结合肽GGC序列连于VEGF165基因C端,通过内部核糖体切入位点（IRES）连接增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,构建重组腺病毒载体Ad5-VEGF165GGCmotif-IRES-EGFP（Ad5-VIE）,同时构建腺病毒包装EGFP（Ad5-EGFP）为对照.以不同感染复数（MOI=0,10,25,50,100）Ad5-VIE感染大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）后,用99Tcm-GH为报告探针,研究感染细胞摄取动力学（30,60,90和120 min）情况,以检测GGC序列在MSC中的表达,并与实时定量PCR、Western-blot蛋白印迹、免疫组织化学等方法鉴定的VEGF165表达进行对比分析.通过荧光显微镜及实时定量PCR检测EGFP在细胞中的表达.采用SPSS 13.0软件进行统计学处理,组间比较运用独立样本成组t检验、q检验和直线（Pearson）相关分析.结果 以Ad5-VIE感染MSC后,不同MOI摄取实验结果示细胞对99Tcm-GH的摄取率随病毒MOI的增加而逐渐增加（r2=0.86,P＜0.05）,并且在MOI=100时达到（7.94±0.75）%;不同时间摄取实验示随99Tcm-GH孵育时间延长,细胞摄取率逐步增高,至120 min时达到（7.72±0.22）%.Ad5-VIE感染组与Ad5-EGFP感染组摄取率在各个不同时间点差异均有统计学意义（t=15.10～54.92,P均＜0.05）.在mRNA水平上,VEGF165及EGFP表达均随病毒MOI增加而增加（r2=0.99,P＜0.05）.不同MOI下细胞对99Tcm-GH的摄取与VEGF165蛋白表达呈较好的相关性（r2=0.90,P＜0.05）.免疫组织化学检查结果表明人VEGF165目的 基因在MSC中成功表达.荧光显微镜下可以观测到被感染细胞中的EGFP蛋白.结论 成功构建的重组腺病毒系统Ad5-VIE感染MSC对99Tcm-GH的摄取与VEGF165表达呈正相关.以GGC多肽为报告基因可以监测治疗基因VEGF165的表达,为核素报告基因显像提供了理论依据.     

血管内皮生长因子基因转染自体骨髓血管内皮祖细胞治疗下肢缺血的实验研究

目的:利用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF165)基因转染体外诱导的血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),并移植到下肢缺血的高脂血日本大耳兔体内,观测其促进血管新生、改善肢体缺血的效果。方法:①制作高脂血兔,梯度离心法分离兔骨髓单个核细胞(MNCs),用内皮细胞专业培养基(EGM-2)诱导培养EPCs,并用双荧光染色法及免疫组化等方法进行鉴定。②脂质体介导携带EGFP标记的VEGF165质粒转染EPCs,用激光共聚焦显微镜检测VEGF蛋白的表达,用流式细胞仪检测转染率。③制作兔单侧下肢缺血模型,并将其随机分为A、B、C 3组,分别移植EPCs、VEGF165基因转染后的EPCs及EGM-2培养基,多种方法检测移植效果。结果:①诱导出的梭形细胞,经FITC-UEA-I和DiI-acLDL荧光双染证实为正在分化的EPCs,同时经免疫组化法证实其Flk-1和Ⅷ因子的表达。②激光共聚焦显微镜下见绿色荧光蛋白表达,证实VEGF165转染成功,经流式细胞仪检测得到转染率约22.5%。③DSA及免疫组化检查显示VEGF165基因转染后的EPCs移植后改善肢体缺血的效果优于其他2组。结论:VEGF基因转染EPCs后能改进EPCs质量,移植后促血管新生能力增强,其效果优于未转染组。     

转染B7-H3基因对前列腺癌细胞摄取^18F—FDG和^18F—FLT的影响

目的研究转染B7同系物3（B7-H3）基因对前列腺癌细胞摄取^18F—FDG和^18F-FLT的影响,并探讨抗B7-H3单克隆抗体（简称单抗）对前列腺癌细胞的作用。方法用细胞计数试剂盒（CCK）-8检测鼠源性前列腺癌RM1细胞和转染B7-H3基因RM1的同种细胞（RM1-B7-H3）培养后0．5、1、2、3、4和5d的吸光度（A）值,并用流式细胞仪测定2种细胞的生长周期。在不同糖浓度（0、5．5和11．0mmol／L）、不同细胞数（每孔5×10^4～5×10^6）、不同摄取时间（20～120min）的条件下,测定2种细胞的^18F—FDG摄取率;并在细胞数为1×10^6、反应时间为100min的条件下行^18F-FLT细胞摄取实验。最后测定给予抗B7-H3单抗4H7后RM1-B7-H3细胞的^18F—FDG细胞摄取率。数据比较行单因素方差分析和两样本t检验。结果RM1-B7-H3细胞培养1、2和3d时的A值分别为1．59±0．23、2．26±0．15和2．01±0．60,较RM1细胞（1．22±0．14、1．10±0．09和1．04±0．15）高（t=3．923、19．228和4．467,均P〈0．01）;其他时间点2组间差异无统计学意义（t=-0．094、0．858、2．000,均P〉0．05）。RM1-B7-H3细胞的G1、S、G2／M期比例分别为（32．96±2．56）％、（39．11±2．57）％和（27．94±0．21）％,S期比例较RM1细胞（32．76±1．90）％高（t=3．442,P〈0．05）。2种细胞^18F—FDG摄取率均随培养基糖浓度的增加而降低,随细胞数和摄取时间的增加而升高。在1．0×10^6细胞、摄取100min时,RM1-B7-H3和RM1细胞的^18F—FDG摄取率分别为（55．07±3．99）％和（44．16±3．60）％,^18F—FLT摄取率分别为（5．25±0．81）％和（3．33±0．64）％,差异均有统计学意义（t=4．977和4．567,均P〈0．01）。给予4H7单抗后RM1-B7。H3细胞的^18F—FDG细胞摄取率为（45．36±2．92）％,较未加单抗组^18F—FDG细胞摄取率低（F=10．001,P〈0．01）。结论转染B7-H3基因能增强前列腺癌细胞的代谢和增殖活性,并提高细胞对^18F—FDG和^18F-FLT的摄取;给予抗B7-H3单抗4H7后,RM1-B7-H3细胞的^18F—FDG细胞摄取率降低。     

1，25-（OH）2D3对糖尿病大鼠ZO-1表达的影响

目的观察糖尿病（DM）大鼠肾小球ZO-1蛋白的表达，1，25-（OH）2D3对ZO-1蛋白表达及分布的影响。方法Wistar大鼠随机分为3组：对照组、糖尿病组（DM组）、1，25-（OH）2D3组。链脲菌素（STZ）腹腔注射建立糖尿病动物模型，1，25-（OH）2D3组在糖尿病建立时即开始渗透性微量泵按3ng／100g·d皮下给予1，25-（OH）2D3，给药10周处死小鼠，检测血糖、半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CysC）、尿红细胞、24h尿蛋白定量（24hUPE）；光镜观察肾小球细胞数，细胞外基质（ECM）聚积；Western印迹检测ZO-1蛋白的表达；免疫金荧光染色电镜观察肾小球ZO-1分布的改变。结论DM组大鼠CysC、尿红细胞、24hUPE均高于1，25-（OH）2D3组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。1，25-（OH）2D3组大鼠较DM组肾小球细胞数减少，细胞外基质聚积减轻（P〈0．05或P〈0．01）。Western印迹示1，25-（OH）2D3组和对照组肾小球ZO-1表达无显著差异，均明显高于DM组（P〈0．01）。免疫金荧光染色显示DM组肾小球ZO-1表达缺失及易位分布明显，1，25-（OH）2D3组ZO-1的表达缺失及易位分布较轻。结论1，25-（OH）2D3可减少尿蛋白的排泄，抑制肾小球细胞数及细胞外基质的增殖，增加足细胞特异蛋白ZO—1的表达，减少其易位，对肾脏有保护作用。     

阿托伐他汀对心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用

目的探讨阿托伐他汀保护心肌细胞缺氧／复氧损伤的机制,为临床防治缺血再灌注损伤寻找新思路。方法分离SD乳鼠（出生1～3d）心肌细胞进行原代培养,建立H/R模型,取培养第3d的心肌细胞随机分成3组：正常对照组（CON组）、H,R组、H／R＋ATV组。应用MTS法检测心肌细胞的存活率;化学发光免疫分析法检测心肌细胞特异性损伤指标肌钙蛋白I（cTnI）的含量;采用SYBRGREEN荧光定量PCR检测各组HIF—1a、VEGFmRNA表达水平。结果与CON组比较,H／R组心肌细胞存活率明显降低（P〈0．05）,血清肌钙蛋白I明显升高（P〈O．05）,HIF—1a和VEGFmRNA表达水平显著升高（P〈0．05）;用阿托伐他汀预处理后心肌细胞存活率明显升高（P〈0．05）,血清肌钙蛋白I明显降低（P〈0．05）,HIF-1d和VEGFmRNA表达水平进一步升高（P〈0．05）。结论阿托伐他汀可能通过上调HIF-1a及VEGF的表达水平进而保护缺氧／复氧损伤的心肌细胞。     

MMP3、TIMP-1及VEGF在神经胶质瘤组织中的表达及意义

目的探讨MMP3、TIMP-1、VEGF在正常脑组织与神经胶质瘤组织中的表达及其与肿瘤恶性程度及侵袭性的关系。方法对107例神经胶质瘤标本及9例正常脑组织标本,采用免疫组织化学EnVision二步加强法检测MMP3、TIMP—1、VEGF的表达。结果MMP3、TIMP-1、VEGF在正常脑组织中的表达（0、88．9％、0）和胶质瘤中的表达（63．6％、43．9％、67-3％）差异有统计学意义（P〈0．05）,MMP3、TIMP-1、VEGF在低级别胶质瘤中的表达（44．4％、53．7％、48．1％）和高级别胶质瘤中的表达（83．0％、34．0％、86．8％）差异有统计学意义（P〈0．05）。结论MMP3、VEGF与神经胶质瘤的恶性程度成正相关,两者可能有协同作用,TIMP-1在高级别的神经胶质瘤中表达降低,可能与其抑制MMP3的能力降低有关。     

被动吸烟所致小鼠肺癌中Angiopoietin-3基因过表达及其意义的初步探讨

目的 初步寻找新的与肺癌相关的基因,为全面揭开肺癌发病机制、进一步诊断和治疗肺癌提供依据.方法 （1）通过基因表达芯片筛选被动吸烟致小鼠肺癌中异常表达的基因;（2）荧光实时定量PCR验证部分基因芯片结果;（3）应用western blotting分析方法检测小鼠肺组织中Angiopoietin-3（Ang-3）基因的蛋白表达量变化.结果 实时荧光定量PCR结果显示Ang-3基因的mRNA相对表达量在肺癌组（30.6544±15.2245）明显高于在正常对照组（1.0469±0.3441,P〈0.05）.Western blotting结果进一步表明吸烟导致Ang-3基因蛋白高表达（1.2724±0.1493）,尤其是在肺癌组织中（1.5901±0.1189）明显高于正常肺组织中（0.9054±0.0523）,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 Ang-3基因在被动吸烟所致小鼠肺癌的发生、发展中发挥一定的作用.