70株志贺菌属血清分型及耐药分析

目的分析医院细菌性痢疾的流行菌株类型及耐药特点。方法对医院肠道门诊腹泻患者的粪便标本进行细菌分离培养、鉴定和血清分型,并以K-B琼脂法进行药敏实验。结果在检出的70株志贺菌属中,弗氏志贺菌37株、宋内志贺菌33株,未分离出志贺菌属的其他型别;70例菌株对传统抗菌药物中的四环素、复方新诺明、氨苄西林、利福平、萘啶酸的耐药率均>62%,对喹诺酮类的常用药诺氟沙星耐药率较低为12.8%,而头孢类的耐药率<10%。结论医院细菌性痢疾流行株主要是弗氏志贺菌和宋内志贺菌,多重耐药率较高,达到77.1%,临床治疗可首选头孢菌素类药物,庆大霉素和诺氟沙星次之。     

深圳地区志贺菌的耐药情况及耐药机制的研究

目的:了解深圳地区宋内志贺菌的耐药状况和基因型的特征。方法:用常规方法培养、分离、鉴定细菌,经生化反应和血清学分型鉴定到种。用K-B纸片法进行药物敏感性试验。采用PCR方法进行基因扩增。结果:从深圳地区分离获得38株宋内志贺菌,耐药率最高的抗生素是氨卞西林、复方磺胺甲噁唑、头孢曲松,耐药率分别为98%、92.3%、16.5%。其耐药基因分别为CTX-M9群及TEM基因,分别占45.2%、28.8%。结论:深圳地区宋内志贺菌对氨卞西林、头孢曲松等抗生素耐药性有较高的耐药率,并检测到产ESBLs,主要耐药基因包括CTX-M9群及TEM基因。     

73株志贺菌属细菌对11种抗生素的耐药性分析

目的研究志贺菌属细菌的耐药状况及其特点。方法采用改良Kirby-Bauer纸片法对临床分离的73株志贺菌属细菌进行11种抗生素的药敏试验,并对其耐药特点进行分析。结果志贺菌属细菌对除庆大霉素以外的传统抗生素四环素、链霉素、氯霉素、磺胺甲基异恶唑、氨苄西林的耐药率较高,在68.5%～86.3%之间;对头抱类性抗生素头孢噻吩的耐药率为34.2%;对不同喹诺酮类药物的耐药率在36.9%～79.5%之间,差异有显著性(P值均小于0.05);志贺菌属细菌的多重耐药率为79.5%,存在地区及菌型分布差异(P<0.05)。结论志贺菌属细菌对多种抗生素表现耐药,但存在地区和菌型差异,特别是对庆大霉素耐药率较低,可增加其临床应用;使用喹诺酮类药物治疗菌痢时,应做多种喹诺酮类药物药敏试验。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 StxⅡ基因表达

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157∶H7StxⅡ基因表达,并评价其对细菌生长的影响及细胞毒性。方法针对EHEC O157∶H7StxⅡ基因设计引物,构建CRISPR/Cas9表达质粒pdCas9-StxⅡ并转化EHEC O157∶H7感受态细胞,采用RT-PCR及胶体金法检测StxⅡ基因表达情况,绘制菌株生长曲线,将菌株培养上清液接种Vero细胞观察细胞病变情况。结果测序分析显示pdCas9-StxⅡ表达质粒被成功构建;转化EHEC O157∶H7(00G097)感受态细胞后,StxⅡ基因mRNA、蛋白表达均受抑制,EHEC O157∶H7生长曲线未受影响(P值均0.05)。pdCas9-StxⅡ-00G097菌株培养上清液对细胞的毒性效应(CPE为30%)显著低于对照菌株00G097和pdCas9-00G097(CPE均80%)。结论成功构建的pdCas9-StxⅡ表达质粒能特异抑制EHEC O157∶H7StxⅡ基因表达、降低细胞毒性,为进一步研究志贺毒素StxⅡ在EHEC O157∶H7致病机理和基因工程减毒活菌苗奠定了基础。     

福氏志贺菌4c亚型深圳分离株的病原特性及毒力基因分析

目的对深圳市首次分离的福氏志贺菌4c亚型菌株进行病原学分析,了解该类新菌型特征。方法采用生化反应、血清学分型、刚果红侵袭试验、药敏分析等方法对从患者、厨工肛拭及物体表面等样本中分离的17株福氏志贺菌分离株进行病原学分析,并对ipaH、ial、sen、set4个毒力基因进行PCR检测。结果所得到的17株福氏志贺菌4c亚型分离茵均分解葡萄糖产酸不产气,甘露醇阳性,血清学鉴定均为福氏志贺菌IV型、7群菌株,刚果红侵袭试验均阳性,均对氨卞西林、四环素、红霉素、甲氧苄啶、阿莫西林耐药,而对阿米卡星、环丙沙星、庆大霉素、头孢噻肟、头孢噻吩和诺氟沙星敏感,所有菌株均携带ipaH和set基因,而仅有23．53％（4／17）的菌株携带ial和sen基因。结论该福氏志贺菌4c亚型深圳分离株的生化、血清学鉴定结果与报道福氏志贺菌4c亚型基本相符,该菌具备一定毒力,ipaH和set毒力基因携带情况与相关报道相符,ial和sen基因携带情况低于现有报道。     

2011-2019年33株人源非O157产志贺毒素大肠埃希菌耐药表型及耐药相关基因分析

目的了解人源非O157产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)抗生素耐药表型及耐药基因携带状况。方法33株非O157 STEC菌株来自2011-2019年7个省份,包括青海、黑龙江(各1例),广西、山东(各2例),广东(4例),河南(11例),上海(12例),均分离自感染性腹泻患者粪便标本。采用改良微量肉汤法对非O157 STEC进行19种抗生素最小抑菌浓度(MIC)检测;通过全基因组测序进行O∶H血清分型、多位点序列分型(MLST)及耐药相关基因预测。结果33株非O157 STEC分为19种O∶H血清型、17种MLST序列型;10株菌对1种或以上抗生素耐药,5株为多重耐药菌株,对四环素耐药率最高(30.3%,10株),并检出阿奇霉素耐药菌株(12.1%,4株),但所有菌株均对碳青霉烯类药物敏感;共检出22种耐药基因,全部菌株均携带blaEC基因,并检出超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因型blaCTX-M-15(3.0%,1株),首次检出fosA7基因。结论中国7省份33株人源非O157 STEC中存在多重耐药和阿奇霉素耐药菌株,且携带多种耐药基因型,但均对碳青霉烯类药物敏感。     

1978~1991年北京丰台区痢疾菌菌型分布与变迁的调查分析

北京丰台区1978~1991年共检出志贺氏菌386株,均经生化、血清学鉴定,对其中108株作了药敏试验。菌型分布于4个群、20个血清型(亚型),其中福氏志贺氏菌始终占优势(72.80%),以F₂a、F₃a为主,宋内氏志贺氏菌为第二位(17.10%),B:D比值为4.3。此外,对菌型变迁的因素进行了初步探讨,为志贺氏菌病的防治提供了参考依据。     

Single nucleotide polymorphism (SNP)-based differentiation of Shigella isolates by pyrosequencing

Analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) is an important genetic tool that provides molecular markers for rapid differentiation of closely related strains. We have applied SNP discovery and analysis for distinguishing each of the four Shigella serogroups (Boydii, Dysenteriae, Flexneri, and Sonnei) and for discriminating individual strains within the same serogroup by using 24 SNPs selected from nine genes. Five SNPs were identified from sequence analysis of two housekeeping genes (gapA and thrB) used previously in our lab to differentiate Shigella isolates into distinct lineages. The remaining 19 SNPs were identified by in silico analyses of eight Shigella genomes and are within the genes lpxC, sanA, yaaH, ybaP, ygaZ, yhbO, and ynhA. A total of 118 Shigella strains comprising 20 Boydii, 29 Dysenteriae, 42 Flexneri, and 27 Sonnei isolates were analyzed using the SNP typing scheme reported here. The combination of the 24 SNPs resulted in the identification of 26 SNP genotypes among the four Shigella serogroups and also provided some discriminatory resolution among individual strains within the same serogroup. The SNPs presented here should prove useful in identifying Shigella using PCR amplification and rapid sequence typing strategies.     

志贺菌中成簇规律间隔短回文重复序列的分子分布特征

目的 探索志贺菌中成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)的分布。方法 共选择志贺菌分离株52株, 其中河南41株, 江西6株, 北京5株。利用PCR扩增志贺菌的4个CRISPR位点(S1、S2、S3、S4), 产物送测序, 分析CRISPR的重复序列和间隔序列。结果 志贺菌的4个CRISPR位点阳性率分别为33. 69%(S1)、50.00%(S2)、82.69%(S3)和73.08%(S4);S1和S3包括2种亚型, S2有3种亚型, S4包括4种亚型。2004年前分离的河南分离株中检出S1位点, 2004年后分离的菌株中均未检出该位点;S2、S3和S4在两组的分布没有差异。结论 志贺菌各CRISPR位点含有不同亚型, 河南分离株S1的分布与细菌分离时间有关, 而S2、S3 及S4和分离时间无关。     

基于CRISPR/Cas的大肠埃希菌分子标志物的监测研究

目的 探讨基于CRISPR/Cas的大肠埃希菌分子标志物的监测研究。方法 通过BLAST收集GenBank数据库中135株全基因组测序大肠埃希菌、203株鸟枪法测序大肠埃希菌的CRISPR/Cas和PCR扩增、测序获得本实验室保存361株大肠埃希菌（包括38株大肠埃希菌O157：H7）的CRISPR序列,应用CRISPR Finder在线软件分析CRISPR特征、DNAMAN软件进行间隔序列的比对,使用Clustal Ⅹ进行cas多序列比对和Mega 5.1软件构建系统进化树。结果 本研究以全新的视角对大肠埃希菌的CRISPR/Cas位置进行描述;结果显示,135株全基因组测序、203株鸟枪法测序和361株本实验室测序的大肠埃希菌中分别有77.04%、100.00%和75.62%的大肠埃希菌具有CRISPR1,分别有74.81%、100.00%和92.24%的大肠埃希菌具有CRISPR2,分别有11.85%、0和1.39%的大肠埃希菌具有CRISPR3和CRISPR4;GenBank数据库下载的全基因组测序的1株和本实验室测序的2株大肠埃希菌存在4个CRISPR位点;缺少cas的CRISPR1下游有插入序列存在。在699株大肠埃希菌中,8株O55：H7、180株O157：H7、8株O157：HNM、40株O104：H4、4株O145：H28有独特的CRISPR;间隔序列的缺失可发生在CRISPR中间;依据I-E和I-F的cas构建系统发育树,均可分为两类。结论 大肠埃希菌的CRISPR/Cas可能作为鉴定强毒株大肠埃希菌或者新型菌株的分子标志物。间隔序列的缺失或获得可能与噬菌体有关。     

CRISPR1上游侧翼序列用于大肠埃希菌和志贺菌鉴定的效果评价

目的 探讨基于成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）1上游侧翼序列对大肠埃希菌和志贺菌鉴定和评价效果。方法 通过BLAST重复序列识别并获得全基因组测序大肠埃希菌和志贺菌的CRISPRs和CRISPR相关基因（CRISPR-associated,cas）,并分析其种系;选取CRISPRs上、下游各500 bp侧翼序列,使用Clustal X进行序列比对;采用PCR方法扩增CRISPR1上游侧翼序列,以确定其对大肠埃希菌和志贺菌鉴定和评价效果。结果 73.4%（149/203）的大肠埃希菌存在I-E型CRISPR/Cas系统,包含了A、B1、D种系;8.4%（17/203）的大肠埃希菌存在I-F型CRISPR/Cas、17.2%（35/203）的大肠埃希菌不存在CRISPR/Cas,这2种大肠埃希菌均属于B2种系;9株志贺菌均存在I-E型CRISPR/Cas。在大肠埃希菌（B2种系外）、志贺菌CRISPR1上游和大肠埃希菌（B2种系）各存在61 bp侧翼序列,序列一致性为99%,且有种属特异性,PCR扩增此区域鉴定大肠埃希菌和志贺菌的灵敏度和特异度均>91%。结论 基于CRISPR1上游序列可用来鉴定大肠埃希菌和志贺菌,且具有很好的效果。     

基于全基因组测序的我国耐多药结核分枝杆菌耐药突变特征分析

目的 利用全基因组测序数据分析中国耐多药结核分枝杆菌的耐药相关基因突变谱及主要突变类型与菌株基因型的相关性。方法 查询并下载NCBI数据库中截至2019年8月公开发表的中国结核分枝杆菌全基因组测序数据,利用全基因组数据预测菌株分子药敏结果,统计不同药物耐药相关基因的突变类型,并分析耐药突变类型与菌株基因型的相关性。结果 根据分子药敏结果从2 019株菌株中鉴定出1 024株耐多药菌株,对常用抗结核药物的耐药相关基因主要突变类型分别为katG S315T（73.2%,异烟肼）、rpoB S450L（63.1%,利福平）、rpsL K43R（70.0%,链霉素）、embB M306V（37.4%,乙胺丁醇）、pncA启动子区T（-11）C（7.9%,吡嗪酰胺）、gyrA A90V（32.3%,氟喹诺酮类）、rrs A1401G（67.7%,二线注射类）、fabG1启动子区C（-15）T（87.0%,乙硫异烟胺）、folC I43T（30.4%,对氨基水杨酸）。其中,katG S315T、rpsL K43R、embB M306V、gyrA D94G在L2系菌株中的频率显著高于L4系菌株,folC I43T仅在L2系菌株中发现;katG S315T在古典北京型菌株中比例较高,而rpsL K43R在现代北京基因型菌株中的比例更高,其差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论 本研究提供了基于全基因组测序的我国耐多药结核分枝杆菌对多种常用抗结核药的耐药相关基因主要突变类型,为研发敏感、特异的快速分子检测方法提供了依据;同时也发现多种耐药相关基因主要突变类型与菌株基因型有关。     

Responses of environmental Amycolatopsis strains to copper stress

Copper is a redox-active metal, which acts as a catalyst in the formation of Reactive Oxygen Species (ROS) encouraging oxidative stress. Protection against oxidants is intrinsic to every living cell; however, in stress conditions, cells are forced to increase and expand their antioxidative network. In this work, the novel copper-resistant strain Amycolatopsis tucumanensis and the copper-sensitive Amycolatopsis eurytherma were grown under copper increasing concentrations in order to elucidate the dissimilar effects of the metal on the strains viability, mainly on morphology and antioxidant capacity. Although biosorbed copper encouraged ROS production in a dose-dependent manner in both strains, the increase in ROS production from the basal level to the stress conditions in A. tucumanensis is lesser than in the copper-sensitive strain; likewise, in presence of copper A. eurytherma suffered inexorable morphological alteration while A. tucumanensis was not affected. The levels of antioxidant enzymes and metallothioneins (MT) were all greater in A. tucumanensis than in A. eurytherma; in addition MT levels as well as superoxide dismutase and thioredoxin reductase activities in A. tucumanensis, were higher as higher the concentration of copper in the culture medium. This work has given evidence that an efficient antioxidant defense system might aid microorganisms to survive in copper-stress conditions; besides it constitutes the first report of oxidative stress study in the genus Amycolatopsis and contributes to enlarge the knowledge on the copper-resistance mechanisms of A. tucumanensis.     

Changes in aromatic characteristics of Loureiro and Alvarinho wines during maturation

Changes in volatiles during maturation in bottles of monovarietal Vinhos Verdes wines from Loureiro and Alvarinho grape varieties, were followed by chemical and sensory analyses. Young wines and wines matured for 8 and 20 months were studied. The volatiles were determined by gas chromatography–mass spectrometry (GC-MS) after extraction on XAD-2 resin. Straight chain fatty acid ethyl esters and acetates of fusel alcohols decreased quicker for Loureiro wine, while the increase in ethyl esters of branched fatty acids was similar for both varieties. Linalool, Ho-trienol, α-terpineol and β-damascenone could be used to differentiate between each variety. However, linalool decreased to negligible values after 20 months of maturation. β-Damascenone decreased but remained high enough to be useful for differentiating each variety. Sensory analysis indicated a decrease of tropical fruit and tree fruit characters with conservation time for Alvarinho wine, and the opposite for Loureiro; moreover, citrus fruit character decreased in both varieties.     

广东省和广西壮族自治区部分地区2014-2016年宋内志贺菌病原学特征分析

目的 了解2014-2016年广东省和广西壮族自治区部分地区宋内志贺菌暴发分离株及散发分离株的病原学特征。方法 对2014-2016年广东省和广西壮族自治区柳州市分离的14株宋内志贺菌暴发菌株和6株散发菌株进行抗生素敏感性试验和PFGE分析,并选择其中6株代表菌株进行全基因组测序,与NCBI上获取的51株国内外宋内志贺菌的基因组进行遗传进化分析。结果 抗生素敏感性检测结果显示,试验菌株对氨苄西林、四环素、庆大霉素、复方新诺明和萘啶酸有较高的耐药性,对阿奇霉素、氯霉素和亚胺培南完全敏感。PFGE分子分型显示,不同地区不同来源的分离株之间PFGE指纹图谱有很高的相似度（93.2%）,基于全基因组的遗传进化分析显示,广东省和广西壮族自治区柳州市的宋内志贺菌分离株同处在一个进化分支上,与来自韩国的菌株亲缘关系最为接近。结论 广东省和广西壮族自治区部分地区分离的宋内志贺菌对常用抗生素具有较高的耐药性,对阿奇霉素、氯霉素和亚胺培南有较高的敏感性。试验菌株之间具有相似的PFGE指纹图谱,遗传进化关系相近。     

广东省2018-2022年侵袭性非伤寒沙门菌病原学特征分析

目的 了解2018-2022年广东省侵袭性非伤寒沙门菌（iNTS）的血清型分布、耐药性以及分子流行情况,为沙门菌侵袭性感染的防治提供科学依据。方法 对2018-2022年广东省分离自血液和粪便样本的沙门菌进行血清学鉴定、药敏试验、多位点序列分型（MLST）和全基因组测序。同时利用微生物基因注释系统对测序结果开展耐药基因与毒力因子注释。结果 136株iNTS分为25种血清型,肠炎沙门菌占38.24%（52/136）。以鼠伤寒变种沙门菌作为对照计算其余iNTS血清型的OR值,奥雷宁堡、里森和波摩那3种沙门菌血清型的OR值较高,分别为423.50、352.92和211.75。iNTS耐药率在0.74%~66.91%之间,普遍低于非iNTS株（3.90%~77.21%）。iNTS耐药以氨苄西林和四环素为主,耐药率分别为66.91%（91/136）和50.00%（68/136）,而对环丙沙星（5.88%,8/136）、头孢他啶（5.88%,8/136）、庆大霉素（5.13%,7/136）和头孢西丁（0.74%,1/136）耐药率较低。iNTS携带多种耐药基因与毒力因子,但尚未发现共同毒力因子分布特征。MLST聚类分析显示,iNTS分为26种序列型别,ST11型占38.24%（52/136）。结论 2018-2022年广东省iNTS以肠炎沙门菌为主,其中奥雷宁堡、里森和波摩那3种血清型可能与更高的侵袭性感染风险有关。iNTS对临床一线治疗药物（头孢类和氟喹诺酮类抗生素）敏感,序列呈现高度多样性且具有明确的系统发育分支,以ST11型为本地优势克隆群。