基于CRISPR/Cas的大肠埃希菌分子标志物的监测研究

目的 探讨基于CRISPR/Cas的大肠埃希菌分子标志物的监测研究。方法 通过BLAST收集GenBank数据库中135株全基因组测序大肠埃希菌、203株鸟枪法测序大肠埃希菌的CRISPR/Cas和PCR扩增、测序获得本实验室保存361株大肠埃希菌（包括38株大肠埃希菌O157：H7）的CRISPR序列,应用CRISPR Finder在线软件分析CRISPR特征、DNAMAN软件进行间隔序列的比对,使用Clustal Ⅹ进行cas多序列比对和Mega 5.1软件构建系统进化树。结果 本研究以全新的视角对大肠埃希菌的CRISPR/Cas位置进行描述;结果显示,135株全基因组测序、203株鸟枪法测序和361株本实验室测序的大肠埃希菌中分别有77.04%、100.00%和75.62%的大肠埃希菌具有CRISPR1,分别有74.81%、100.00%和92.24%的大肠埃希菌具有CRISPR2,分别有11.85%、0和1.39%的大肠埃希菌具有CRISPR3和CRISPR4;GenBank数据库下载的全基因组测序的1株和本实验室测序的2株大肠埃希菌存在4个CRISPR位点;缺少cas的CRISPR1下游有插入序列存在。在699株大肠埃希菌中,8株O55：H7、180株O157：H7、8株O157：HNM、40株O104：H4、4株O145：H28有独特的CRISPR;间隔序列的缺失可发生在CRISPR中间;依据I-E和I-F的cas构建系统发育树,均可分为两类。结论 大肠埃希菌的CRISPR/Cas可能作为鉴定强毒株大肠埃希菌或者新型菌株的分子标志物。间隔序列的缺失或获得可能与噬菌体有关。     

CRISPR1上游侧翼序列用于大肠埃希菌和志贺菌鉴定的效果评价

目的 探讨基于成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）1上游侧翼序列对大肠埃希菌和志贺菌鉴定和评价效果。方法 通过BLAST重复序列识别并获得全基因组测序大肠埃希菌和志贺菌的CRISPRs和CRISPR相关基因（CRISPR-associated,cas）,并分析其种系;选取CRISPRs上、下游各500 bp侧翼序列,使用Clustal X进行序列比对;采用PCR方法扩增CRISPR1上游侧翼序列,以确定其对大肠埃希菌和志贺菌鉴定和评价效果。结果 73.4%（149/203）的大肠埃希菌存在I-E型CRISPR/Cas系统,包含了A、B1、D种系;8.4%（17/203）的大肠埃希菌存在I-F型CRISPR/Cas、17.2%（35/203）的大肠埃希菌不存在CRISPR/Cas,这2种大肠埃希菌均属于B2种系;9株志贺菌均存在I-E型CRISPR/Cas。在大肠埃希菌（B2种系外）、志贺菌CRISPR1上游和大肠埃希菌（B2种系）各存在61 bp侧翼序列,序列一致性为99%,且有种属特异性,PCR扩增此区域鉴定大肠埃希菌和志贺菌的灵敏度和特异度均>91%。结论 基于CRISPR1上游序列可用来鉴定大肠埃希菌和志贺菌,且具有很好的效果。     

基于不同方法的大肠埃希菌分型效果评价

目的 评价并验证成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPRs）、血清学和多位点测序分型（MLST）方法对大肠埃希菌分型的效果。方法 使用CRISPRsFinder分析大肠埃希菌全基因组序列的CRISPRs间隔序列,使用在线软件SeroTypeFinder和MLST获得血清型和序列型（ST）;采用PCR扩增并分析349株大肠埃希菌CRISPRs,使用CRISPRs间隔序列预测血清型和ST,并比较血清学和MLST分型结果。结果 将I-E型CRISPR/Cas、I-F型CRISPR/Cas和CRISPR3-4分别命名CT-Ⅰ、CT-Ⅱ和CT-Ⅲ。根据CRISPRs间隔序列构成和排列进一步进行分型,203株大肠埃希菌被分为79个CT型别,76个血清型和66个ST。CRISPRs分型的区分能力最强,辛普森指数为0.936。CRISPRs和血清学的关联程度最高,调整兰德指数为0.908。CRISPRs型能进一步区分相同血清或ST产志贺毒素的大肠埃希菌［O157∶H7（ST11）、O104∶H4（ST678）和O26∶H11（ST21）］菌株。扩增实验室菌株的CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3、CRISPR4和CRISPR3-4,检出率分别为81.1%、94.5%、1.4%、1.4%和4.6%;根据CRISPRs间隔序列预测O157∶H7（ST11）和ST131准确率分别为95.0%和100.0%。结论 基于CRISPRs的大肠埃希菌的分子分型方法呈现较好的分型效果和临床应用效果,预期可以成为大肠埃希菌分型的重要分子标志物。     

噬菌体筛选侵袭性大肠埃希氏菌初探

本文报告用6种肠杆菌科分属诊断噬菌体对侵袭性大肠埃希氏菌的7个血清型作了噬菌体裂解试验,提出了筛选侵袭性大肠埃希氏菌的5种噬菌体裂解模式;在赖氨酸、动力筛选试验基础上,噬菌体裂解试验可排除56.7%的非侵袭性大肠埃希氏菌。     

志贺菌中成簇规律间隔短回文重复序列的分子分布特征

目的 探索志贺菌中成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)的分布。方法 共选择志贺菌分离株52株, 其中河南41株, 江西6株, 北京5株。利用PCR扩增志贺菌的4个CRISPR位点(S1、S2、S3、S4), 产物送测序, 分析CRISPR的重复序列和间隔序列。结果 志贺菌的4个CRISPR位点阳性率分别为33. 69%(S1)、50.00%(S2)、82.69%(S3)和73.08%(S4);S1和S3包括2种亚型, S2有3种亚型, S4包括4种亚型。2004年前分离的河南分离株中检出S1位点, 2004年后分离的菌株中均未检出该位点;S2、S3和S4在两组的分布没有差异。结论 志贺菌各CRISPR位点含有不同亚型, 河南分离株S1的分布与细菌分离时间有关, 而S2、S3 及S4和分离时间无关。     

大肠埃希菌O157:H7分离株MLVA分子分型

目的了解国内大肠埃希菌O157:H7菌株的分子流行特征。方法采用多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)方法对1999-2002年江苏、河南、安徽、山东、云南等地的大肠埃希菌O157:H7分离株135株进行分子分型,选取7个可变数目串联重复序列(VNTR)位点,应用PCR技术及毛细管电泳方法,检测分离株DNA多态性,使用BioNumerics软件进行聚类分析。结果 135株大肠埃希菌O157:H7可分为3个群(A群、B群、C群)38个MLVA型别,其中A群占20.7%(28/135)、B群占23.7%(32/135)、C群占55.6%(75/135);MLVA型别存在一定地域性,同一暴发来源的菌株具有相同MLVA型别。结论大肠埃希菌O157:H7国内分离株存在丰富的基因多态性;MLVA方法具有较高分子分型能力,可以在溯源和流行病学调查中发挥重要作用。     

大肠埃希菌宽宿主谱噬菌体生物学特性的比较研究

目的比较研究1株宿主谱发生突变的宽宿主范围噬菌体与其原始野生型单一宿主谱噬菌体株的生物学特性改变,探讨噬菌体识别特异性机制和将噬菌体作为生物消毒剂,应用于环境污水净化的可行性。方法利用大肠埃希菌285菌株自环境污水中筛选到1株具有宽宿主范围的噬菌体,与野生型噬菌体f2比较观察,分析宿主谱改变对噬菌体的生物学特性的影响。结果两噬菌体电镜下形态均为微球形且棱角不明显,但(噬菌体XY)颗粒偶见短尾,大小形态不均一;噬菌体f2和噬菌体XY的抗血清K值分别为30.1和41.5;噬菌体XY与噬菌体f2的相关度较低(K值比<0.45);结果显示,噬菌体XY较噬菌体f2具有吸附速率高、潜伏期短、裂解量大的特点;两噬菌体均为约6 000 bp的单链RNA噬菌体,但宿主谱改变前后它们的RAPD-PCR及RT-PCR差异有统计学意义;噬菌体XY对环境水样本中的大肠埃希菌杀灭率可达到36.75%~56.28%,而噬菌体f2则为19.19%~35.06%(P<0.01)。结论宽宿主谱噬菌体较噬菌体f2在超微形态、一步生长曲线、抗原性等方面差异均有统计学意义;微生物杀灭效果也明显高于噬菌体f2(P<0.01);核酸分析证实其宿主特异性裂解效应已从基因水平发生了变化。     

江苏省东台市大肠埃希菌O157:H7监测

为了解东台地区1999-2001年和2005-2006年间肠出血性大肠埃希菌(E.coli O157:H7)宿主动物和腹泻患者带菌情况,按照《江苏省大肠杆菌感染性腹泻监测工作实施计划》及《国家大肠杆菌感染性腹泻监测方案》在东台市开展E.coli O157:H7监测工作.     

大肠埃希菌的分布与耐药性分析

目的了解大肠埃希菌在临床各种标本中的分布及耐药性,为临床合理用药提供参考依据。方法统计分析2013年1-12月医院各种临床标本分离出的140株大肠埃希菌分布及耐药性,药敏试验采用K-B纸片琼脂扩散法,采用WHONET5.4-5.5软件分析数据。结果 2013年3 304份临床各种标本中分离出病原菌共1 062株,其中大肠埃希菌140株,占13.18%;大肠埃希菌在中段尿、血液、分泌物、痰液等不同临床标本中分别占44.44%、22.22%、19.08%、6.81%;大肠埃希菌耐药性严重,除对亚胺培南100.00%敏感外,对哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦和头孢西丁的耐药率均较低,分别为1.89%、3.77%、11.32%和20.75%;而对其他青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类及氨基糖苷类等抗菌药物耐药率均较高;产ELBLs大肠埃希菌的检出率为55.70%。结论标本来源不同,大肠埃希菌的分布和耐药性不同,临床医师应根据药敏试验结果合理选择使用抗菌药物。     

海盐县发现1例O157：H7大肠埃希菌

大肠埃希菌一直被人们认为是人类和动物肠道中正常菌群的一部分.但1982年在美国发生的多起食物中毒事物,其中出血性肠炎的病原菌为罕见的O157:H7大肠埃希菌,尔后在日本也多次发生因O157:H7引起的集体食物中毒事件,引起全世界的关注.     

志贺菌成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白基因cas1 和cas2 研究

目的 研究成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白基因cas1和cas2在志贺菌中的分布,并分析cas1和cas2基因突变与细菌耐药的关系。方法 采用PCR扩增196株志贺菌cas1和cas2基因。对3株志贺菌（Z23、2003135、2008113）的cas2、cas1（a）和cas1（b）基因进行测序,分析其突变与耐药之间的关系。结果 196株志贺菌均检出CRISPR相关蛋白基因cas1和cas2。测序结果显示,cas2 的一致性为 96.44%,cas1（a）的一致性为 97.61%,cas1（b）的一致性为96.97%。菌株 2003135 的 cas1（b）基因有 2 个突变位点：3177129 位点（C→G）及 3177126 位点（G→C）,Z23、2008113 对应位置没有突变。药敏结果显示菌株 2003135 的耐抗生素种类和耐抗生素数目均大于菌株Z23、2008113。结论 志贺菌中CRISPR基因广泛存在。cas1（b）基因突变菌株与未突变株比较,耐药性增强。cas1（b）基因突变可能是引起耐药程度不同的原因之一。     

利用GoPubMed对CRISPR相关文献的计量学分析

为了解CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)相关研究现状,笔者采用GoPubMed数据库的在线分析软件,对CRISPR相关文献进行计量分析.共检索到文献758篇.CRISPR相关研究文献呈逐年上升趋势,其中美国在CRISPR的文献数量和影响力均居首位,中国以北京地区发表文献最多(30篇).PLoS One刊登相关文献47篇,占发表总量的6.20%,居首位.CRISPR研究主题词涉及基因、基因组学、免疫等.高产作者为Horvath,共发表CRISPR相关文章11篇.利用GoPubMed可较好反映CRISPR研究的现状和发展趋势.中国CRISPR研究文献在整体质量和数量上均有待进一步提高.     

甘肃省鼠疫耶尔森菌规律成簇间隔短回文重复序列位点多态性分析及地区分布

目的 研究甘肃省鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）的规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）位点多态性及地区分布。方法 选取1962－2014年分离的203株鼠疫菌,培养并提取DNA。采用3对CRISPR引物对菌株DNA进行PCR扩增,对PCR产物进行测序。根据菌株CRISPR位点的间区序列种类和排列情况,确定菌株的基因型（类群）,采用BioNumerics 5.10软件进行聚类分析。结果 203株鼠疫菌发现有16种间区序列,包括YPa位点9种、YPb位点4种、YPc位点3种,发现新的间区序列a1''。共发现5个CRISPR基因簇,分别为Cb2、Ca7、Ca7''、CaΔ5''、Ca35''。不同的基因簇呈现区域性特征：Cb2主要分布在会宁县、平川区,Ca7主要分布阿克塞哈萨克族自治县;Ca7''主要分布在夏河县;Ca35''主要分布肃北蒙古族自治县、玉门市;CaΔ5''主要集中在肃南裕固族自治县。结论 CRISPR分子分型方法能够较好地区分甘肃省不同疫源地的菌株,且各基因簇呈现一定的区域性特征。对研究甘肃省鼠疫菌进化规律和人间疫情分子生物学溯源有一定意义。     

Genomics in medicine: A new era in medicine

The sequencing of complete human genome revolutionized the genomic medicine. However, the complex interplay of gene-environment-lifestyle and influence of non-coding genomic regions on human health remain largely unexplored. Genomic medicine has great potential for diagnoses or disease prediction, disease prevention and, targeted treatment. However, many of the promising tools of genomic medicine are still in their infancy and their application may be limited because of the limited knowledge we have that precludes its use in many clinical settings. In this review article, we have reviewed the evolution of genomic methodologies/tools, their limitations, and scope, for current and future clinical application.     

我市首次分离到O157:H7大肠杆菌分离株的生化特征、毒力因子与耐药性的探讨

目的：了解金华市外环境中O157：H7大肠杆菌分离株中生化特征、毒力因子的携带与耐药情况。方法：直接分离接种于O157显色培养基。结果：从51份样品中分离出2株O157：H7大肠杆菌,对这2株O157：H7大肠杆菌分离株进行PCR毒力因子的测定,携带eaeA、stx2毒力因子。结论：药敏试验结果显示,这两株O157：H7大肠杆菌分离株对利福平类、四环素耐药。     

Hemolytic uremic syndrome risk and Escherichia coli O157:H7

We reviewed medical records of 238 hospitalized patients with Escherichia coli O157:H7 diarrhea to identify risk factors for progression to diarrhea-associated hemolytic uremic syndrome (HUS). Data indicated that young age, long duration of diarrhea, elevated leukocyte count, and proteinuria were associated with HUS.