依达拉奉体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的电生理研究

目的探讨新型氧自由基清除剂依达拉奉诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的电生理特性。方法Ficoll-Paque分离液离心分离大鼠骨髓基质干细胞,体外扩增,含依达拉奉的无血清L-DMEM诱导。观察细胞形态变化,Western-blot检测分化前后细胞膜离子通道蛋白表达,全细胞膜片钳检测细胞电生理特性。结果分化的骨髓基质干细胞胞体收缩,突起伸出;钠、钾、钙膜蛋白分化前后均有表达,分化后钾、钠、钙膜蛋白表达上调;分化后细胞静息电位值增大,外向电流增大,尤以外向整流钾电流显著。结论依达拉奉诱导大鼠骨髓基质干细胞分化的细胞具有神经细胞电生理特性。     

骨髓移植在骨折愈合中的应用进展

骨髓移植是促进骨折愈合的重要手段,骨髓的成骨特性不断在实验及临床应用中得到证实,骨髓的成骨特性主要基于骨髓基质干细胞、骨形态发生蛋白及骨祖细胞的存在,而目前对骨髓成骨特性的研究主要分体内实验和体外实验,并且体外细胞培养及特性研究是重中之重。     

骨髓CFU-F体内、体外成骨功能研究

目的：研究骨髓基质成纤维细胞与成骨的关系,为临床应用奠定基础。方法：采用Ｌｉｕｒｉａ多器官培养器体外器官培养法、肾被膜下移植技术以及石蜡切片技术、Ｇｏｍｏｒｉ染色和Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色技术。结果：移植物在肾被膜下形成软骨细胞团及骨基质;在β－ＧＰ存在下,骨髓基质ＣＦＵ－Ｆ体外培养可见形成钙化的骨板。结论：骨髓基质ＣＦＵ－Ｆ为基质多能干细胞,能增生分化为成骨以及造血诱导微环境所必需的各种基质细胞系。     

骨髓基质饲养层对精原干细胞体外培养的影响

目的以原代培养小鼠骨髓基质细胞为饲养层，探讨精原干细胞能否在该饲养层上生长及生长的影响因素。方法采用原代培养的小鼠骨髓基质细胞，待细胞长成单层后用丝裂霉素C处理并接种生精细胞共培养。结果原代的小鼠培养骨髓基质细胞能很好的维持精原干细胞的非分化性扩增。结论小鼠原代培养的骨髓基质细胞能作为饲养层支持精原干细胞体外非分化性扩增，该细胞有望成为干细胞培养的新的饲养层。     

精原干细胞体外非分化扩增的初步研究

目的探讨精原干细胞体外非分化性扩增的影响因素。方法采用昆明系小白鼠骨髓基质细胞原代培养,待细胞长成单层后经丝裂霉素C处理,作为精原干细胞培养的饲养层,细胞在37℃环境下培养。结果接种后2～4d,精原干细胞数明显增加,细胞单个、成双或成群,非精原干细胞开始出现崩解死亡;接种4～8d,精原干细胞增殖不明显,处于相对静止期;接种10d后,又开始出现明显的分裂增殖,15d已具有精原干细胞特征,继续培养25d,细胞形态未见明显改变,胞质桥仍明显。结论精原干细胞能在37℃环境温度下,在以骨髓基质饲养层上保持良好非分化性扩增。     

脐血造血细胞体外集落培养最佳收获时机的探讨

目的 探讨脐血（CB）多系造血集落培养在不同培养条件下脐血造血细胞体外扩增的最佳收获时机。方法 将从新鲜CB标本中分离出的单个核细胞（MNC）分别接种于已建立的无血清培养基，该培养基分别含单用人骨髓基质细胞、单用细胞因子及细胞因子联合入骨髓基质细胞（HBMSC）支持培养体系。在0、6、10及14d各时间点分别取细胞进行巨细胞集落形成单位（CFU—MK）、红乐爆式集落形成单位（BFU—E）及粒单细胞集落形成单位（CFU—GM）培养。结果在体外培养过程中，第10d时各组CFU—MK、BFU—E及CFU—GM数均高于组内其它时间点（P〈0．05）；在含HBMSC支持培养的组集落生成数优于其它组（P〈0．05）。结论 脐血MNC体外培养过程中，第10d可能是收获的最佳时机。FIBMSC能更好地维持造血干／祖细胞的活性，使其集落形成能数得到有效扩增。     

辛伐他汀促进骨髓基质细胞的成骨分化

目的：观察辛伐他汀对骨髓基质细胞成骨分化的影响，探讨其刺激成骨的作用机制。方法：体外培养成年小鼠骨髓基质细胞，不同浓度的辛伐他汀作用72h后，RT-PCR检测骨钙素(osteocalcin，OCN)mRNA水平的变化，Western blot检测OCN和骨桥蛋白(osteopontin，OPN)表达水平的变化，细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)细胞化学染色及酶比活性测定。结果：辛伐他汀作用72h后，OCN的mRNA表达水平增高，OCN、OPN蛋白表达水平增高，呈剂量依赖关系，细胞ALP染色增强，ALP比活性显著增高。结论：辛伐他汀促进骨髓基质细胞的成骨分化，辛伐他汀刺激成骨的作用机制可能与此有关。     

人脐血基质细胞自发分泌多种造血生长因子的实验研究

目的探讨体外培养的人脐血基质细胞分泌血小板生成素(thrombopoietin,TPO)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、干细胞生长因子(stem cell factor,SCF)的能力.方法留取不同培养时相点的培养液上清,ELISA法检测上清中TPO、GM-CSF、SCF的浓度,并与骨髓基质细胞的培养上清液对照比较其特点.结果人脐血基质细胞和骨髓基质细胞均可分泌TPO、GM-CSF和SCF等造血生长因子,二者造血生长因子的分泌随着培养时间的延长而逐渐下降,其中人脐血基质细胞分泌TPO和SCF的高峰期出现在第7天,而GM-CSF的分泌则无高峰期的出现;通过与骨髓基质细胞分泌三种造血生长因子量进行对比发现,人脐血基质细胞SCF和GM-CSF的分泌量低于骨髓基质细胞,而TPO的分泌高于同期培养的骨髓基质细胞.结论人脐血基质细胞与骨髓基质细胞一样具有分泌造血生长因子,支持调控造血的作用.     

幼龄及成龄鼠骨髓基质干细胞生物学特性的比较

目的比较幼龄及成龄大鼠骨髓基质干细胞体外培养过程中生物学特性的差异.方法取3周及3月龄SD大鼠股骨骨髓原代培养基质干细胞.第2代细胞添加诱导成骨培养液,分别通过相差显微镜观察细胞生长,MTT法检测细胞增殖,钙钴法、茜素红染色了解体外矿化,测定细胞总蛋白含量,RT-PCR测Ⅰ型胶原mRNA表达,透射电镜了解细胞及胞外基质分泌来比较两者差异.结果幼鼠细胞增殖更快,倍增时间4.8 d;培养第7天出现较多集落;钙钴法、茜素红染色深染细胞数目多,结节典型;细胞总蛋白含量高.成龄鼠细胞增殖相对慢,倍增时间5.4 d;未见细胞集落,钙化呈片状;细胞总蛋白含量较低.两者琼脂糖电泳均可显示Ⅰ型胶原mRNA条带;超微结构内质网丰富,胞外基质为前胶原样结构.结论不同鼠龄的骨髓基质干细胞经体外诱导均可分化为成骨细胞,考虑到细胞增殖及成骨潜能,幼鼠基质干细胞是研究细胞/生物材料相互作用更理想的工具.     

贫血患者瘦素水平的测定

目的　通过对贫血患者体内瘦素水平的测定 ,了解在贫血状态下是否存在瘦素分泌的异常。方法　分别抽取正常人、再生障碍性贫血 (再障 )、营养不良性贫血、溶血性贫血患者骨髓液及外周血 ,用放射免疫分析法分别测定其瘦素含量。结果　营养不良性贫血、溶血性贫血患者骨髓瘦素含量和外周血瘦素含量比 (BM/PB)与正常人接近 (P >0 0 5 ) ,而再障患者两者的比值比正常人明显升高 (P <0 0 1 ) ,而贫血程度与瘦素含量无明显相关性 (P >0 0 5 ) ,但骨髓与外周血瘦素含量则高度相关 (P <0 0 1 )。结论　再障患者瘦素水平明显高于正常人及其他类型贫血患者 ,可能与再障骨髓脂肪细胞明显增多、脂肪细胞分泌瘦素明显增多有关。瘦素受体的不完整及造血干 /祖细胞对干细胞因子 (SCF)的反应性降低、破坏了瘦素与SCF协同刺激原始造血祖细胞增殖的作用 ,可能是造成再障瘦素水平高 ,但造血干 /祖细胞数量减少的一个原因     

BG/PHBV复合多孔支架材料与成骨细胞体外复合培养

目的用生物活性玻璃BG/聚羟基烷酸酯PHBV复合多孔支架材料与骨髓基质细胞来源的成骨细胞体外复合培养了解其生物相容性,为骨组织工程支架材料选择提供依据。方法:将体外培养的兔骨髓基质细胞诱导分化的成骨细胞,与BG/PHBV复合多孔支架材料体外复合培养,对复合体进行形态学、扫描电镜、细胞增长能力的测定,评价细胞与材料的相容性。结果:骨髓基质细胞有较强的向成骨细胞分化和繁殖能力成骨细胞与BG/PHBV复合多孔支架材料体外复合培养8d,分布于支架材料的成骨细胞迅速分化增殖,分泌细胞外基质并形成钙结节。结论:骨髓基质细胞是骨组织种子细胞的良好来源BG/PHBV复合多孔支架材料与成骨细胞具有良好的生物相容性,是构建组织工程骨的一种理想支架材料。     

富血小板血浆诱导骨髓基质干细胞联合软骨支架治疗兔激素性股骨头坏死

目的 观察自体富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)诱导骨髓基质干细胞联合同种骨软骨支架治疗早期兔激素性股骨头坏死的疗效,探索早期股骨头坏死治疗的新方法.方法 采用含有抗凝剂的真空采血管从实验兔的耳中央动脉采取动脉血5 mL,再通过离心方法获取PRP,用16号骨髓穿刺针从实验兔自体股骨髓腔抽取骨髓5 mL,把抽取的骨髓进行密度梯度离心,获取兔骨髓基质干细胞,并进行细胞原代培养和成骨诱导.对已获取PRP和骨髓基质干细胞的实验兔进行激素性股骨头坏死造模,取同种股骨髁部骨软骨制作软骨支架,最后以制备的软骨支架为载体,将经过成骨诱导的骨髓基质干细胞移植到软骨支架上,形成细胞-支架复合物,用16号骨髓穿刺针对坏死的股骨头进行髓芯减压术,术中将细胞-支架复合物植入坏死的股骨头下.实验动物共分为4组,每组20只,A组为空白对照;B组仅进行髓芯减压;C组髓芯减压后植入经过成骨诱导培养的细胞;D组髓芯减压后植入细胞-支架复合物.实验后在第2、4、8周各组分别处死6、6、8只,每只实验兔的股骨头行大体标本及组织学检查.结果 D组治疗效果最显著,通过空骨陷窝计数发现D组与其他各组的差异有统计学意义(P<0.05).结论 骨髓基质干细胞通过PRP的诱导向成骨细胞分化;软骨支架材料为骨髓基质干细胞向成骨细胞分化提供良好的空间结构,有利于其向成骨细胞分化;PRP和软骨支架材料联合应用可促进早期兔激素性股骨头坏死的修复.     

不同来源的人间质干细胞分离与基本生物学特性研究

目的：分离并比较人胚胎骨髓、成人骨髓和新生儿脐血来源间质干细胞（MSC）的生物学特性,为组织工程选取种子细胞提供实验依据.方法： 用贴壁方法分离三种来源的间质干细胞,观察其形态与生长曲线,并用流式细胞仪测定其表面标志.结果： 骨髓标本均可成功分离出MSC,但是人胚胎骨髓MSC增殖能力要明显强于成人骨髓MSC,而脐血分离MSC没有得到成功.结论： 人胚胎骨髓MSC是很好的组织工程种子细胞,成人骨髓MSC的增殖能力相对较弱,应用受到一定的限制.脐血MSC分离与扩增有待进一步研究.     

无机纳米晶体发光颗粒-量子点对小鼠骨髓造血细胞的标记成像

目的：观察新型发光纳米材料—无机纳米晶体颗粒量子点对小鼠骨髓造血细胞的标记和成像,探讨它在血液细胞分化发育研究中的作用。方法：采用最大发射波长为550nm的绿色量子点转铁蛋白复合物分别在体外和体内对小鼠骨髓造血细胞进行标记研究,并观察量子点转铁蛋白复合物对骨髓造血干细胞CFU-GM的影响。结果：量子点转铁蛋白复合物可标记骨髓中大部分造血细胞,而且荧光强度强,光学和化学稳定性好,对骨髓造血干细胞的增殖分化功能无影响。结论：量子点在血液细胞成像方面表现了优良的特性,在细胞生物学研究中具有重要作用。     

骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的：通过体外细胞的培养方法将骨髓间充质干细胞由骨髓血中分离出来并加以纯化，进一步在体外培养条件下研究其增殖及生长特征，从而为探讨后续利用组织工程学方法修复肌肉骨骼系统组织缺损的可能性提供实验基础。方法：从骨髓血中提取间充质干细胞，体外培养扩增，再以相差显微镜、电镜观察并绘制生长曲线。结果：（1）通过离体培养，可以使体内环境下低丰度的骨髓间充质干细胞实现数目扩增。（2）体外培养条件下骨髓间充质干细胞具有成纤维细胞的生长特性。（3）体外单层培养条件下贴壁生长的骨髓间充质干细胞会出现“返祖现象”。（4）骨髓间充质干细胞内细胞器与其生物活性变化相一致。结论：骨髓间充质干细胞体外培养成功为今后利用自体间充质干细胞通过组织工程学方法修复肌肉骨骼系统的组织缺损提供功能细胞奠定了基础。     

胚胎卵巢生殖细胞表达的Stra8在成年雌鼠骨髓干细胞离体分化中的表达

目的探索雌性骨髓干细胞（FBMSCs）离体培养条件下是否表达生殖干细胞减数分裂启动标志基因Stra8,判断其是否有向卵母细胞样细胞分化的能力。方法全骨髓贴壁法分离青年雌性SD大鼠FBMSCs,传代培养第3代FBMSCs。将第3代FBMSCs随机分为2组：（1）对照组应用DMEM＋15%胎牛血清培养8d;（2）全反式维甲酸（ATRA）组在对照组基础上加入终浓度为10^-5mol/L的ATRA。用RT-PCR方法检测2组Oct4、Vasa、Stra8 mRNA的表达。结果对照组和ATRA组连续培养8d都可检测到Oct4、Vasa、Stra8 mRNA在诱导分化的FBMSCs中的表达。结论FBMSCs中具有能向卵母细胞样细胞分化的多能干细胞;减数分裂启动标志基因Stra8不仅在雌性胚胎生殖干细胞表达,也在成年FBMSCs离体分化中表达。     

骨髓间充质干细胞分化为内耳毛细胞前体细胞的研究

目的 探索大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导分化成内耳毛细胞前体细胞的过程,以期为耳蜗MSCs移植提供实验依据.方法 采用贴壁法提取SD大鼠MSCs,体外培养纯化.分别以EGF＋IGF-1＋BDNF＋ATRA、EGF＋IGF-1＋bFGF＋BDNF＋NT-3作为诱导条件,诱导MSCs分化.观察诱导组及对照组细胞形态的变化,并采用免疫细胞染色法检测毛细胞前体细胞或毛细胞特异性抗原myosinVI、Pax-2、nestin、p27kip1的表达.结果 EGF＋IGF-1＋BDNF＋ATRA诱导组细胞呈短梭形样、方形样,未形成突触;myosin VI、Pax-2、nestin、p27kpi1均有不同程度阳性表达.EGF＋IGF-1＋bFGF＋BDNF＋NT-3诱导组细胞变圆或变细长,逐渐伸出突触,部分形成网络状、大环状结构;nestin、p27kpi1均呈阳性表达.结论 大鼠MSCs在体外培养诱导分化后,可形成内耳毛细胞前体细胞和神经前体细胞.     

生长因子(EGF和PDGF-BB)对小鼠骨髓基质干细胞增殖的作用及其意义

目的探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和血小板源生长因子(platet-derived growth factor,PDGF-BB)对体外培养的小鼠骨髓基质干细胞(murine bone marrow stromal stem cells,mMSCs)增殖的作用,探索小鼠骨髓基质干细胞体外快速增殖的条件和方法.方法将小鼠骨髓基质干细胞进行分离和纯化培养后,加入EGF和PDGF-BB,利用3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入反映细胞增殖效果,倒置显微镜下观察细胞增殖及分化状态.结果EGF和PDGF-BB干预后,3H-TdR掺入(11456.14±968.86)dpm较对照组(3271.88±420.91)dpm明显增高,说明EGF和PDGF-BB可促进小鼠骨髓基质干细胞的增殖;倒置显微镜下观察可见EGF和PDGF-BB处理组mMSCs具有增殖优势,分化相对延迟,而对照组提前显示出自然分化现象.结论生长因子(EGF和PDGF-BB)可促进小鼠骨髓基质干细胞的增殖,是小鼠骨髓基质干细胞体外大量培养和快速增殖的有效刺激因子.     

兔骨髓基质细胞同种异体移植修复骨缺损的实验研究

目的 :观察同种异体骨髓基质细胞移植治疗骨缺损的效果。方法 :取新生新西兰大白兔四肢长管骨骨髓 ,分离后加入条件培养液体外培养 ,冻存复苏的细胞以明胶海绵吸附后回植于异体兔的桡骨缺损处作为实验侧 ,对侧以明胶海绵吸附生理盐水作为对照侧。分别于术后 2、4、8、 1 2周取材 ,观察其修复骨缺损的能力和免疫排斥反应。结果 :植入异体骨髓基质细胞明胶海绵复合体未见明显的免疫排斥反应 ;术后 1 2周实验侧全部骨性愈合 ,对照侧由纤维组织填充。结论 :同种异体骨髓基质细胞移植能有效地修复骨缺损     

骨髓基质细胞与人脐血基质细胞表达造血生长因子的实验研究

目的在分子生物学水平上探讨体外培养的骨髓基质细胞与人脐血基质细胞表达TPO、GM-CSF、SCF的mRNA的能力的差异.方法收集培养28d的骨髓基质细胞与人脐血基质细胞,采用RT-PCR方法在mRNA水平上分析其造血生长因子GM-CSF、SCF、TPO的表达,比较二者表达TPO、GM-CSF、SCF等造血生长因子的mRNA能力的差异.结果体外培养的人脐血基质细胞与骨髓基质细胞均能表达:(1)TPO的mRNA,人脐血基质细胞表达能力强于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为1.57;(2)SCF的mRNA,人脐血基质细胞表达能力弱于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为0.83;(3)GM-CSF的mRNA,人脐血基质细胞表达能力弱于同期培养的骨髓基质细胞,二者积分光密度量化比为0.68.结论人脐血基质细胞和骨髓基质细胞均可以表达造血生长因子TPO、GM-CSF、SCF的mRNA,具有支持调控造血的物质基础.