人皮肤成纤维细胞原代培养方法的改良

目的：改良人皮肤成纤维细胞培养方法。方法：采用培齐后组织块消化法(简称改良法)培养成纤维细胞，以组织块贴瓶法(简称贴瓶法)作为对照。结果：改良法成功率为100％，43d左右成纤维细胞增殖形成单层并进行第1次传代；贴瓶法成功率为66．7％，47d左右成纤维细胞增殖形成单层并进行第1次传代结论：改良法是一种可行的成纤维细胞培养方法。     

大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞的分离培养及鉴定

探讨大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞体外分离及培养的方法.采用0.125％胰酶多次消化法收集新生SD大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞.高内涵细胞成像法检测细胞增殖能力,免疫荧光、Western blot和RT-PCR法检测波形蛋白表达水平,CD90标记成纤维细胞、鉴定细胞纯度.最新消化分离得到的细胞呈亮球形,轮廓清晰,单个散在或聚集成团分布,90 min后即有大量细胞贴壁,其中部分细胞已开始伸展.5～6 d可形成单层细胞,传代后的细胞呈长纺锤形或多边形.波形蛋白表达呈强阳性.传代3代的细胞培养体系中成纤维细胞约占87％.含5％FBS的DMEM/F12培养基培养24 h即可检测到细胞的大量增殖.胰酶消化法是获得大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞的有效方法.     

人牙周膜成纤维细胞的体外培养

目的：建立人牙周膜成纤维细胞体外培养的方法。方法：采用组织块贴附法原代培养人牙周膜成纤维细胞并传代。结果：牙周膜成纤维细胞体外培养成功率为20％。5代后细胞生长旺盛。经免疫组织化学SABC法证实为来源于中胚层的成纤维细胞。结论：采用组织块贴附法培养原代人牙周膜成纤维细胞。胰酶消化传代后，生长状况良好，可作为人牙周膜成纤维细胞的实验模型。     

人皮肤成纤维细胞原代培养中组织块法及其注意事项

0引言 成纤维细胞是皮肤组织受损后的主要修复细胞.正常情况下,其处于相对静止状态,当皮肤受损或发生某些病变时,成纤维细胞表现为增生活跃和代谢旺盛[1].近年来,国内已有一些科研单位开展皮肤成纤维细胞的培养技术,以获得在体外稳定生长的正常皮肤成纤维细胞,从而为自体皮肤成纤维细胞的基因治疗和相关疾病的研究提供充足、可靠的靶细胞[2].国内各实验室在进行成纤维细胞原代培养时方法不一,多以组织块法和酶消化法为主.我们通过应用组织块法进行皮肤成纤维细胞原代培养而获得大量稳定细胞,并总结出皮肤成纤维细胞原代培养中组织块方法的注意事项,为今后进行细胞培养起到了一定的指导作用.     

改良组织块法培养人肺成纤维细胞及其形态学观察

原代培养作为获取细胞的主要途径已成为科学研究的重要组成部分。过去人们通常采用酶消化法、差速离心法和贴壁法等方法,但结果都不大理想。例如酶消化法步骤繁多,且受多种因素影响,条件不易控制,所以统一推广比较困难。笔者在查阅文献的基础上,结合实践操作摸索出一套人肺成纤     

皮肤成纤维细胞培养的体会

国内已有一些科研单位开展了皮肤成纤维细胞的培养技术〔１〕，因其在核型分析中稳定性好，并能够表达其来源个体的基因组中与代谢有关的绝大多数基因，利用理化方法予以检测。此外皮肤组织取材方便、安全，易为患者接受，可以动态观察，细胞株可储存备用，故有着重要的实...     

人皮肤成纤维细胞的分离和体外培养

基因治疗方式可分为间接体内法 (ｅｘｖｉｖｏ)和直接体内法(ｉｎｖｉｖｏ)。离体基因治疗方法亦称间接法是将患者的某种组织或细胞取出体外 ,在短期培养的条件下转入目的基因 ,进行筛选和富集整合有外源基因的阳性细胞 ,然后再回输到患者体内。该方法具有靶细胞明确 ,转染效率高的优点 ,因此在基因治疗中被较多采用。目前 ,国际上已有 10余种疾病的基因治疗研究采用皮肤成纤维细胞为靶细胞 ,并且越来越多的研究已进入临床Ⅰ期试验。本实验探讨了人皮肤成纤维细胞的分离及体外培养方法 ,观察总结了体外培养的生长特征 ,以获得在体外稳定生长的正常皮肤成纤维细胞 ,从而为自体皮肤成纤维细胞基因治疗的研究提供充足、可     

人皮肤成纤维细胞的高效分离培养及鉴定

[摘要] 目的 建立高效的人皮肤成纤维细胞的原代培养和体外连续培养体系,为组织工程皮肤真皮的构建提供充足的种子细胞。方法 取临床无菌切除的幼儿包皮,利用II型胶原酶分离表皮和真皮, 再用胰蛋白酶消化,剪碎真皮,接种于培养瓶,加少许含10%胎牛血清的高糖-DMEM培养液进行培养,次日补加培养液。原代长满后,进行传代,并对所培养的细胞进行形态学观察及免疫荧光鉴定。结果 接种次日倒置镜下可见有长梭形细胞迁出、生长,3～4d进行传代,传代后3d长满,可长期传代。细胞免疫荧光检测,Vimentin表达阳性。结论 该方法可快速高效获得构建组织观察皮肤真皮所需的成纤维细胞。     

优化贴壁法人皮肤成纤维细胞的原代培养

目的:优化贴壁法原代培养人皮肤成纤维细胞的条件,建立稳定?经济?高效可行的人皮肤成纤维细胞培养方法?方法:采用包皮环切术后皮肤组织,剪成均匀组织块后贴壁,皮肤边缘长出薄层致密细胞团后胰酶消化?传代,并对所培养的细胞进行形态学观察及细胞免疫荧光鉴定?此方法与酶消化法相对照?结果:优化贴壁法成功率100%,取得组织后2 d沿皮肤边缘均开始生长高密度类圆形细胞层,在1周内可获得高质量?高数量的细胞,传代贴壁后经镜下形态观察及细胞免疫荧光染色确定为皮肤成纤维细胞?结论:较之酶消化法,优化贴壁法细胞存活率高,活性及纯度好?该方法可稳定?经济地获得足够数量的细胞?     

人皮肤成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定

目的：探索和建立一种新的、适宜于人皮肤成纤维细胞（Fbs）的体外分离、培养及鉴定方法。方法：采用冷胰蛋白酶和胶原酶联合消化法对人皮肤Fbs的进行体外培养，通过生物化学、免疫细胞化学及ELISA实验技术，对人皮肤Fbs的活力检测、生长曲线、羟脯氨酸（HYP）含量及Ⅰ型胶原含量指标进行研究。结果：人皮肤Fbs原代培养时间较大鼠长。人皮肤Fbs冻存复苏后所得生长曲线与冻存前所得曲线基本相似；人皮肤Fbs培养液中，3～5 d的HYP含量与1 d相比有显著增加（P<0.01）；2～6 d Ⅰ型胶原含量与1 d相比有显著增加（P<0.01）。结论：培养的人皮肤Fbs增殖能力强、适应性强、易培养且性状稳定，可为人类凹陷性瘢痕修复和美容除皱提供可靠的细胞来源。     

大鼠心肌成纤维细胞体外培养的生物学特性及转基因研究

目的观察大鼠心肌成纤维细胞(CFs)体外培养的生长增殖情况及肌肉转录调节因子(MyoD)基因转染对其生物学特性的影响。方法采用改良的差速贴壁法培养大鼠CFs,利用携带MyoD cDNA的真核表达载体pLenti6/V5-DEST-MyoD转导培养的大鼠CFs,用稻瘟菌素筛选2周,挑选转基因单克隆细胞,传代培养,进行细胞形态观察、生长曲线以及细胞免疫化学鉴定。结果成功建立高纯度大鼠CFs的细胞培养模型,且具有良好的细胞形态、正常的生长增殖等生物学功能。转染细胞的MyoD cDNA基因表达阳性,其下游抗α-肌动蛋白(α-actin)呈阳性表达,胞质呈棕黄色,并且含有与细胞纵轴平行排列的肌丝,细胞核用苏木素复染后呈淡蓝色。在2.0×10~5/mL细胞密度的CFs接受转MyoD基因后,抗α-actin阳性率为(27.04±9.41)%。结论真核表达载体成功介导MyoD cDNA转导入体外培养的大鼠CFs,诱导其转化为具有潜在功能的类骨骼肌细胞,CFs可成为心血管疾病基因治疗的靶细胞。     

人皮肤成纤维细胞原代培养及增殖能力研究

目的探索和建立永生化的人皮肤成纤维细胞,为皮肤成纤维细胞在临床医学上的应用提供可靠的科学依据。方法胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞;细胞生长曲线及MTT法测定细胞增殖能力;流式细胞仪测定成纤维细胞生长周期及细胞增殖指数。结果不同代次原代及冻存复苏后的人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强。结论人皮肤成纤维细胞在增殖能力上完全可以作为体细胞基因治疗的靶细胞,而且是未来最有希望的永生化基因治疗细胞之一。     

正常人皮肤成纤维细胞不同培养条件下的生物学特性

目的 观察成纤维细胞在不同培养条件下生长,增殖,代谢及蛋白质合成等情况,探讨成纤维细胞的最佳培养模型。方法 将正常皮肤中的成纤维细胞（NsFb）分离出来并进行原代及继代培养,之后建立不同的成纤维细胞培养系统,分别利用绘制细胞生长曲线,^3H-胸腺嘧啶（^3H-TdR）掺入及^3H-脯氨酸掺入等方法观察细胞的增殖,DNA代谢及胶原合成等情况,研究细胞在不同条件下的生物学特性。结果 成纤维细胞在单层及纤维蛋白胶中培养时细胞的增殖,代谢及蛋白质合成等生物学功能均明显强于两种胶原凝胶中培养时的情况。结论 以纤维蛋白胶为支架的三维培养系统能更好地模拟生理条件下创面愈合时成纤维细胞的生物学特性。     

胎鼠成纤维细胞组织块体外培养方法的改良

目的:建立改良的胎鼠成纤维细胞(MEF)体外培养的简单有效方法,为成功培养胚胎干细胞奠定基础.方法:分别应用传统的消化法和改良的组织块贴附培养法对MEF进行体外培养,倒置显微镜下观察2种培养方法培养的原代和传代培养的MEF的生长形态、结构及细胞数量的变化.结果与结论:改良组织块贴附培养法省去了消化离心过程,简单易行,培养的成纤维细胞具有良好的增殖能力,原代培养成纤维细胞增长快,细胞产出量高,明显优于消化法培养,是MEF体外培养的良好方法.     

人皮肤角质形成细胞的制备及体外培养

目的 探讨人皮肤角质形成细胞制备及体外培养的方法.方法 皮肤标本用胰酶、胰酶＋分离酶（dispase酶）2种方法消化,并分别以DMEM培养基、RPMI 1640培养基、限制性角质形成细胞无血清培养基（KC-FSM培养基）培养,MTT法通过比色分析测定培养48 h、72 h后细胞的光密度值（D值）,以判断不同培养基对角质形成细胞增殖的影响.结果 胰酶＋分离酶消化可获得较纯的原代角质形成细胞,细胞在限制性KC-FSM培养基中生长良好,培养48 h、72 h后测得的D值显著高于DMEM培养基和RPMI 1640培养基（P＜0.05）.结论 胰酶＋分离酶消化、限制性KC-FSM培养基体外培养是制备和培养人皮肤角质形成细胞的好方法.     

高纯度原代大鼠肝细胞的分离与培养

目的 :分离及培养高纯度的原代大鼠肝细胞。　方法 :用含EGTA的D Hanks液及含DNaseⅠ的胶原酶消化液分两步原位灌注大鼠肝脏 ,分离细胞经 3次低速离心 (5 0 g ,5min)后获得纯化的肝细胞。肝细胞存活率检测用锥虫蓝拒染法 ,纯度检测用苏木精 伊红染色。采用加入特殊营养成分的RPMI 16 4 0培养液培养 ,用倒置相差显微镜观察细胞活力。　结果 :每只 180～ 2 0 0 g的大鼠平均可获 (1.0～ 1.5 )× 10 8的细胞 ,存活率 >5 0 % ,纯度高于98%。培养 1、3、5天肝细胞的存活率分别为 10 0 %、94 .5 %、89.5 % ,形态良好。　结论 :改良原位灌注消化法分离肝细胞产率较高 ,活性较好 ,加入特殊营养成分的RPMI 16 4 0培养液培养能保持肝细胞良好的形态。     

东方田鼠皮肤成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的 探索和建立东方田鼠皮肤成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性。方法采用含10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle培养液(DMEM)和1640两种培养体系,运用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1 、3 d和5 d的东方田鼠乳鼠皮肤成纤维细胞进行原代分离、培养。苏木素-伊红染色及倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态和生长特性。结果0.25%胰酶消化分离出生后1 d和3 d东方田鼠乳鼠皮肤较出生后5 d组织可获得较多数量细胞,成纤维细胞在体外快速贴壁生长,一般6 ～7 d长满培养瓶,细胞纯度高,HE染色细胞呈长梭形,胞核明显；DMEM和1640两种培养液均可用于东方田鼠皮肤成纤维细胞的培养,但细胞传代后生长趋缓,只可传代2～3次。本实验运用组织块贴壁法未能培养出皮肤成纤维细胞。结论确定了有效分离东方田鼠皮肤成纤维细胞的日龄和方法,为进一步深入研究提供了技术方法和操作依据。     

乳鼠皮层神经元原代培养与观察

目的:通过原代培养乳鼠皮层神经元,为脑血管疾病的研究提供实验模型。方法:酶消化法原代培养出生1天Wistar乳鼠的皮层神经元,利用免疫细胞化学和免疫荧光方法进行鉴定。结果:培养的细胞贴壁生长,胞体饱满,突起较长。免疫细胞化学染色显示神经元特异性烯醇化酶阳性细胞达85%,免疫荧光显示胶质细胞酸性蛋白阳性细胞达15%。结论:酶消化法原代培养乳鼠皮层神经元是一种可靠、稳定的获得神经元的方法。