抗CCR7单链抗体的筛选及初步鉴定

目的从噬菌体抗体库中筛选抗CCR7单链融合抗体,并对其生物学特性进行初步检测。方法PCR检测大肠杆菌中ScFv基因插入率;琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果;分别以乳腺癌细胞及CCR7多肽片段为靶抗原对抗体库进行4轮和3轮筛选富集。将阳性克隆转化E.coliHB2151进行可溶表达。抗体亲和层析纯化后,经Western blot鉴定,通过ELISA法检测可溶性ScFv抗体的免疫活性。免疫细胞化学和放射免疫显像鉴定scFv抗体与乳腺癌细胞结合的特异性。结果ScFv基因插入率为90%(18/20),双酶切鉴定检测到目的条带。经4轮细胞筛选,3轮抗原筛选抗CCR7抗原的噬菌体抗体得到了明显富集,在E.coliHB2151中实现可溶表达。Western blot结果显示获得抗体相对分子质量为34ku左右。免疫细胞化学检测与放射免疫显像均证实单链抗体与表达CCR7的乳腺癌细胞MDA-MB-435s特异性结合。结论成功从噬菌体抗体库中筛选获得具有较高特异性的抗CCR7单链抗体。抗体在体内体外均与肿瘤细胞表达特异抗原结合。     

磁性纳米粒子及其在生物医学中的应用进展

磁性纳米粒子由于独有的特性在医药中有着多种用途。其中最独特的特性是磁响应性,利用这一特性磁性粒子被应用于药物载体、磁性分离和细胞的分选。近年来由于其可作为对比剂用于磁共振成像、作为热疗介质用于癌症热疗,并且可应用于磁力组织工程而引起研究者们的广泛关注。具有独特特性的功能性纳米磁性粒子的这些应用将更进一步促进医药生物技术的发展。该综述主要介绍磁性纳米粒子在磁性分离与磁性转染、磁力组织工程、药物靶向载体、核磁共振、肿瘤热疗中的应用。     

超pH敏感荧光纳米探针的pH转变点对其肿瘤成像效果的影响

在荧光引导的肿瘤手术治疗中,基于肿瘤偏酸性微环境而设计的超pH敏感(ultra-pH sensitive, UPS)荧光纳米探针具有实时、超高灵敏度和适用于多种肿瘤等多重优势,而受到广泛关注。超pH敏感探针在高pH环境下处于“OFF”状态,在低pH环境下转变成“ON”状态,发出强烈荧光,并可通过结构设计精确控制其pH转变点(transition pH point, pH_t)。目前已报道的UPS纳米探针具有良好成像效果,然而由于肿瘤微酸环境的复杂性,尚不清楚UPS纳米探针的pH_t对其肿瘤成像效果的影响。在本研究中,通过调节UPS聚合物中疏水性嵌段的结构,分别合成pH_t为4.5、6.2、6.6和7.8的UPS纳米探针。动态光散射检测显示,合成的UPS纳米探针在“OFF”状态下具有良好的稳定性。透射电子显微镜检测表明,该纳米探针粒径均一且形态完整。体外的成像效果检测显示,其都能够较为灵敏地响应pH的变化,在环境pH t时被激活,发出强烈荧光。体内小动物活体成像结果表明, pH_t     

磁性靶向药物的研究进展

磁性靶向药物是利用大分子物质包被磁性纳米粒子，携带抗肿瘤药物，利用体外磁场实现定向治疗的给药方式。靶向给药是一种比较理想的给药方式，属于第4代药物剂型。综述磁性靶向药物的分类，分别介绍磁性粒子和磁性靶向药物的制备方法和体外磁场所采用的形式。由于某些技术未获得突破，所以磁性靶向给药系统现在仍处于实验研究阶段，真正应用于临床还有待进一步研究。     

~(99m)Tc标记磁性纳米Fe_3O_4颗粒双模态探针的制备及其成像实验研究

目的制备99mTc标记磁性纳米Fe_3O_4颗粒双模态探针(SPECT/MRI),考察该探针应用于裸鼠模型的SPECT/MRI成像及其在体内、体外的靶向行为。方法选用多聚醇法制备经过PEG表面修饰的Fe_3O_4纳米颗粒为核心,在EDC/NHS的催化作用下,将多肽RGD和DTPA偶联在PEG上,在此基础上标记核素99mTc,制备了SPECT/MRI双模态探针。结果经DLS表征,该探针能在生理环境下能稳定分散,且放化活度测定核素标记率在90%以上。SPECT/MRI成像证明了细胞对探针的吞噬是由受体介导的。在SPECT/MRI成像结果中,核素计数(ID/g%:靶向组0.27%0.24%竞争组)有较明显差异。在MRI成像实验中进行了T1加权成像和T2加权成像,发现T1和T2加权成像增强较为明显,达到预期效果。结论制备的99mTc标记Fe3O4@PEG-DTPA-RGD双模态探针既具备T2造影能力,又具有T1造影潜能。     

抗人B细胞淋巴瘤噬菌体单链抗体库的构建

目的构建抗人B细胞淋巴瘤单链抗体(ScFv)库。方法从人B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞免疫的BALB/c小鼠脾细胞中提取mRNA,RT-PCR扩增重、轻链可变区基因片断,连接成ScFv基因并扩增,将其克隆到噬菌体载体pHEN1中,构建成单链噬菌体抗体库。结果抗体库容量为3.4×106,约100%的噬菌体基因中有ScFv基因的插入。结论成功构建了抗人B细胞淋巴瘤噬菌体单链抗体库,方便进一步筛选抗人B细胞淋巴瘤抗体。     

紫杉醇磁性纳米脂质体动物体内分布及抑瘤效果研究

目的:研究磁性纳米药物在动物体内的分布情况并考察其抑瘤效果。方法:尾静脉给予小鼠紫杉醇磁性纳米脂质体和紫杉醇脂质体,在磁性组体外施加0.5T的磁场,测定不同时间这2种药物在不同器官中的药物浓度;建立裸鼠肺癌模型,通过重量的变化比较几种药物的抑瘤效果。结果:紫杉醇磁性纳米脂质体组,在动物的肺部体外施加磁场,肺部位的药物浓度明显高于其它部位,且在给药后很快达到稳态浓度,而其它器官的药物浓度逐渐达到稳态浓度;紫杉醇脂质体组,给药后肺部位逐渐上升到稳态浓度。给予紫杉醇磁性纳米脂质体并施加磁场组的肿瘤抑制率为27.53%,显著高于紫杉醇脂质体组。结论:磁性靶向给药是一种有效的给药方式,可以将药物大量地聚集到靶部位,降低药物在正常器官的分布。     

APPβ分泌酶切割位点特异性单链抗体的制备和鉴定

目的制备针对人淀粉样蛋白前体(APP)β分泌酶切割位点的特异性单链抗体(ScFv),并进行鉴定。方法设计扩增单克隆抗体细胞株重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗人APPβ分泌酶切割位点单克隆抗体细胞株中扩增出VH和VL基因片段,然后通过重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成ScFv基因片段,再将其亚克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,目的蛋白经镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot等方法对其检测分析。结果成功从一株抗人APPβ位点单克隆抗体细胞株2H10中扩增出VH和VL并拼接成ScFv片段,片段长744 bp,编码248个氨基酸。PCR、酶切和测序表明表达载体构建成功,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导可以表达出约29 ku的目的蛋白,主要为包涵体形式,经镍柱纯化和复性后,获得纯度达90%以上的ScFv蛋白,ELISA和Western blot检测表明可溶性ScFv可以与人APPβ分泌酶切割位点序列短肽和全长APP结合。结论成功构建并表达人APPβ分泌酶切割位点的特异性单链抗体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。     

磁性吉西他滨隐形纳米脂质体对MCF-7细胞生物学特性的影响

研究磁性吉西他滨隐形纳米脂质体 (magnetic gemcitabine stealth nano-liposomes, MGSL) 的体内磁响应性及对MCF-7细胞生物学特性的影响。对小鼠头颅部施加磁场, 并静脉注射MGSL, 通过对脑组织药物含量的分析, 研究MGSL在体内的磁响应性;然后在有磁场和无磁场的不同情况下, 静脉给予小鼠 MGSL, 通过对小鼠脑、心、肝、脾、肺及肾等组织的药物含量分析, 考察吉西他滨在体内的分布差异, 比较磁性靶向作用和单纯给药在组织分布的不同。在体外, 观察了MGSL诱导的MCF-7细胞凋亡过程中的细胞形态学改变、MTT法获得MGSL作用乳腺癌细胞生长抑制率、流式细胞仪分析MGSL引起的细胞凋亡率和细胞周期分布。最后制成裸鼠乳腺癌皮下移植瘤模型, 通过在移植瘤表面定时给予三维立体梯度磁场作用, 观察MGSL靶向治疗裸鼠乳腺癌的效果。低强度磁场组的吉西他滨血药浓度显著高于无磁场组 (P < 0.01), 而高强度磁场组吉西他滨的含量较低强度磁场组显著升高 (P < 0.01), 且当磁场强度达到5 000高斯时, 吉西他滨含量可达无磁场组的8.5倍。另外应用外加磁场, 吉西他滨可以有效聚集到靶部位, 显著提高病灶部位吉西他滨的浓度, 降低心脏、肾脏等器官的药物浓度。MGSL对人乳腺癌细胞在体外有明显的杀伤作用, 其杀伤作用随浓度升高有上升趋势; 结果还显示MGSL是主要作用于S期的细胞周期药物; 采用流式细胞术证实了MGSL还有促乳腺癌细胞凋亡的作用, 其诱导凋亡率达到51.62%。MGSL可以显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长, 与其他组别相比均有显著差异 (P < 0.05)。本法制备的MGSL符合作为纳米磁靶向给药系统的条件, 同时它具备较好的磁响应性, 在外磁场的作用下可以有效增加肿瘤组织内的药物浓度, 而降低正常组织的药物含量, 达到靶向化疗的目的, 且在体内外显示了较好的抑瘤效应, 可望成为一种有效的抗肿瘤制剂。     

前列腺癌新型靶向纳米超声造影剂的合成及初步评价

目的：研究制备一种前列腺癌新型靶向性纳米超声造影剂。方法：采用PEG及抗前列腺癌特异性膜抗原（PSMA）适体A10-3.2修饰多壁碳纳米管（MWCNTs）合成新型靶向纳米超声造影剂,对其进行合成验证、体外特征评价、生物相容性研究及体外显影评价。结果：Zeta电位、透射电镜扫描图（TEM）、红外分析图（FT-IR）均表明此靶向纳米造影剂合成成功。体外细胞学研究表明,该造影剂细胞毒性小、生物相容性好。体外显影结果表明,该造影剂具有良好的显影效果。结论：该新型造影剂制备成功,具备靶向显影的潜能。     

磁性药物载体在抗肿瘤方面的研究进展

通过外加磁场的引导作用,使负载抗癌药物的磁性载体靶向定位于靶区,提高靶组织的药物浓度,有效降低药物对正常组织或细胞的毒副作用及其他不良反应。磁性药物载体还具有靶向性、缓释、控释等优点,已成为了肿瘤靶向治疗常用的新型载体系统。本文综述了磁性药物载体磁性纳米颗粒、磁性脂质体、磁性微球在肿瘤治疗与诊断中的应用进展。     

仿生杂交膜纳米药物联合光动力治疗和化疗用于食管癌的研究

目的构建了具有靶向性的仿生纳米药物HASGA@TK-AKR(HG@TA),利用光动力治疗联合化疗策略治疗食管癌。通过对其理化性质、体外抗肿瘤活性、体内分布和成像等研究,验证该策略的抗肿瘤效果。方法(1)HG@TA的合成与表征:采用去溶剂交联法和膜融合技术制备纳米药物。观察其形貌特征及粒径,测定其包封率和释药率,检测其产生氧气的能力,测定其降低GSH的特性。(2)体外抗肿瘤活性研究:观察并定量分析食管癌细胞系AKR细胞对其摄取能力和胞内分布情况。考察了纳米药物对AKR细胞活力的影响。(3)体内分布和成像研究:考察纳米药物在小鼠体内的同源靶向功能及体内分布情况。结果成功构建HG@TA。体外产氧实验表明HG@TA表面的H2O2酶能催化H2O2生成大量O2。GSH实验结果表明,激光照射下HG@TA能显著降低细胞内GSH水平。体外抗肿瘤活性结果显示,激光照射下HG@TA能降低细胞活力,具有增强的细胞摄取和细胞杀伤效果。活体成像结果显示,由EPR效应引起的被动靶向和主动同源靶向,纳米药物在肿瘤部位的荧光强度高于其他组织,说明HG@TA具有良好的肿瘤靶向能力。结论制备的纳米药物HG@TA创新性地融合类囊体膜与食管癌细胞膜形成仿生杂交膜包载的白蛋白藤黄酸纳米颗粒,改善肿瘤乏氧的同时降低GSH水平,进步提高光动力治疗联合化疗的抗肿瘤效果,且能在近红外窗口产生荧光,实时非侵入性地指导体内治疗,为肿瘤的治疗提供了新策略。     

Fe3O4纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合物的制备、表征及体外毒性评价

采用改进的Hummers方法制备氧化石墨烯(GO),再用共沉淀法原位合成Fe3O4磁性纳米粒子修饰的GO复合材料.通过透射电镜(TEM)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和X-射线衍射(XRD)对Fe3O4纳米粒子-GO复合物的形态进行表征.结果表明,所制复合物中Fe3O4磁性纳米粒子的粒径为30 nm,少量粒子团聚后的粒径为50～100nm.该复合物中GO含有多种官能团,可作为药物连接的位点,还可通过π-π共轭作用与药物连接.在外加磁场作用下,可明显观察到该复合物迅速聚集在永磁体附近.体外细胞毒性试验表明,该复合物在0.5～5 000 μg/ml范围内对肺癌A549细胞和乳腺癌ZR-75-30细胞无细胞毒性.     

载血卟啉单甲醚中空金纳米球的光热光动力联合抗肿瘤研究

目的 设计基于中空金纳米球的新型纳米给药系统(HMME-PEI-HAuNS),在近红外光照射下研究其同步光热光动力联合抗肿瘤作用。方法 以钴纳米粒为模板制备中空金纳米球(HAuNS),将血卟啉单甲醚(HMME)通过枝状聚乙烯亚胺(PEI)装载到HAuNS表面,形成纳米给药系统(HMME-PEI-HAuNS);采用核磁共振氢谱、红外光谱、紫外光谱分析对HMME-PEI-HAuNS进行结构确证。建立荷瘤(SKOV3)小鼠模型,通过荧光活体成像仪考察其体内分布情况。将对肿瘤细胞表面EphB4受体具有特异性亲和力的靶向多肽TNYL修饰于其表面以增强该纳米体系的靶向性,用核染试剂Hoechst染色SKOV3细胞,在激光共聚焦显微镜下观察细胞内的荧光强度,用MTT比色法进行细胞毒性评价。结果 HAuNS能对HMME进行成功装载,装载率达63.4±5.2%。由于肿瘤的高通透性和滞留效应(EPR 效应),HMME-PEI-HAuNS较游离HMME和HMME-PEI胶束在肿瘤部位有更多的累积量和更长的滞留时间,累计效率约为1.6%。荧光定量统计显示在TNYL多肽的介导下纳米球的靶向性更高,在808 nm激光照射下,TNYL-HMME-PEI-HAuNS发挥光热和光动力协同作用产生强大的肿瘤杀伤作用,在高浓度时,细胞存活率不到10%。结论 主动靶向纳米球(TNYL-HMME-PEI-HAuNS)在808 nm近红外光照射下具有较强的光热光动力联合抗肿瘤作用。     

量子点甲胎蛋白抗体探针毒性及裸鼠体内代谢

目的探讨量子点甲胎蛋白抗体探针的生物相容性及毒性特点。方法将巯基乙酸修饰的水溶性量子点(QD)结合鼠抗人甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体(Ab)制备成水溶性QD-AFP-Ab复合物探针,用荧光、紫外光谱分析及透射电镜研究其特性,MTT法检测其细胞毒性。裸鼠尾静脉iv给予QD-AFP-Ab复合物探针0.2μmo·lkg-1,观察裸鼠死亡情况并检测血清谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、尿素氮(BUN)和肌苷(Cr)水平,并采用四极电感耦合等离子质谱测定该探针0.1μmol·kg-1在裸鼠血清中的浓度及在各主要组织中的含量。结果QD-AFP-Ab复合物探针在水溶液中分散性好,当其浓度低于0.1μmol·L-1时,无明显细胞毒性。裸鼠尾静脉iv给予QD-AFP-Ab0.2μmol·kg-1均无死亡,血清GPT,GOT,BUN及Cr水平与正常对照组相比无显著性差异。该探针在裸鼠体内的循环半衰期约为2h;代谢24h后,主要分布于脾脏、肝脏及肾脏。结论QD-AFP-Ab复合物探针体外低于0.1μmol·L-1和体内0.2μmol·kg-1时未观察到明显的细胞毒性和急性毒性,具有较好的生物相容性,主要分布在脾脏、肝脏和肾脏,最终可能通过肾脏排出体外。     

检测乙酰胆碱酯酶的双光子荧光探针的设计、合成及生物学评价

目的 设计并合成用于检测乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）的双光子荧光探针，并考察探针对AChE的成像检测性能。方法 经酯化、取代等多步有机反应合成探针，并通过¹H-NMR、¹³C-NMR和ESI-MS确认结构。考察探针与AChE发生响应后的荧光信噪比、灵敏度、特异性、酶动力学和双关子吸收截面积数值等指标；研究探针可否用于AChE抑制剂的体外筛选；利用单-双光子成像试验考察探针在细胞和组织水平上对AChE活力变化的检测能力。结果 通过¹H-NMR、¹³C-NMR和ESI-MS确认了产物的结构。体外试验表明探针与AChE响应后的荧光信噪比为15倍，检测限达到0.23 U·mL^–1，并具有很强的特异性和优良的酶亲合能力，在波长820 nm有最优的双光子吸收；探针可用于AChE抑制剂的体外筛选；探针通过单-双光子成像技术可对细胞和组织水平上的AChE活力变化进行成像检测，并且组织成像检测深度可达110 μm。结论 本研究成功开发了可用于AChE检测的双光子荧光探针，有潜力成为可用于活体中检测AChE活力的双光子成像试剂。     

不同粒径的固态及胶体纳米粒子体内动力学特性的比较

纳米粒子在生物医学工程研究领域有着广阔的应用前景,其体内分布及清除等体内动力学特性对开发其体内应用有着极其重要的指导意义。本文分别对不同粒径的固态及胶体纳米粒子在小鼠动物模型体内的分布及清除等动态过程进行了详尽的研究。其中水凝胶纳米粒子由自由基沉淀聚合法合成,通过调控反应液中表面活性剂的浓度而获得不同粒径的纳米水凝胶,并将其包裹近红外荧光探针而进行体内动力学特性的在位研究;固态纳米粒子则通过合成Si O2包裹的近红外荧光量子点获得,通过控制Si O2外壳厚度而控制其粒径。近红外成像结果表明:不同粒径的胶体纳米粒子在体内的分布没有明显的组织特异性,但其清除时间随着粒径的增大而延长;而不同粒径的固态纳米粒子在体内的分布具有明显的特异性,为体内各种疾病的诊断提供了实时动态数据。     

PEG-PCL 纳米胶束用于肿瘤诊断治疗的靶向成像和药物输送(英文)

纳米胶束, 是由疏水性内核及亲水性外壳自组装形成的纳米粒子, 利用其在肿瘤部位增强的渗透和滞留效应(EPR效应), 已成功用作靶向药物输送载体。本研究将近红外荧光染料Cy7-NHS与NH2-PEG-b-PCL连接合成了Cy7-PEG-PCL,并将其组装修饰在胶束结构中, 作为紫杉醇药物的递送载体。研究结果显示, 当药物/载体比例确定为1/4, 由聚乙二醇-聚己内酯共聚物自组装形成的胶束粒径为30 nm左右, zeta电位为 -3 mV, 包封率可达95%以上。体外细胞毒实验表明,载紫杉醇胶束对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制能力与Taxol 制剂相似。活体成像实验结果显示Cy7标记的聚合物胶束在静脉注射后可以有效地被动靶向到肿瘤部位。另外, 以异位接种MCF-7细胞荷瘤裸鼠为模型的体内药效学实验中,载紫杉醇聚合物胶束显示出与Taxol 制剂相似的抗肿瘤活性。综上所述, 在肿瘤靶向成像和治疗方面, 本研究所构建的胶束载药系统显示出良好的潜力。     

阿霉素磁性明胶微球的研究

报告了阿霉素磁性明胶微球（Ａｄｒ－ＭＧ－ｍｓ）的制备与性质，研究了超细氧化铁粒子的合成和磁性明胶微球（ＭＧ－ｍｓ）在狗体内的栓塞效果。阿霉素磁性明胶微球由２％阿霉素（Ａｄｒ）、６８％明胶和３０％的磁铁粒子组成，微球的平均粒径为２２μｍ。在体外实验中，药物释放速度证明微球有缓释的性质。磁铁粒子的平均粒径约为１０ｎｍ，磁性明胶微球与￣（９９ｍ）Ｔｃ标记磁性明胶微球通过导管分别输入狗的肝动脉内进行栓塞，照相和血管造影显示在未加外磁场时磁性明胶微球在左右肝叶分布几乎相等，而在１２００高斯的外磁场作用下，靶部位肝左叶的微球分布是肝右叶的２．２５倍，而甲状腺、脑、心脏的微球很微量，结果表明磁性明胶微球在外磁场作用下是一个很好的治疗肝癌的栓塞剂。     

pH敏感的氧化钽纳米材料的制备及其肿瘤靶向成像与治疗作用研究

目的 制备以西妥昔单抗(cetuximab，C225)作为靶分子的pH敏感的氧化钽纳米粒(TaO_x-C225 nanoparticles， TaO_x-C225 NPs)，用于肺癌的靶向诊疗。方法 以C225作为靶分子连接到TaO_x NPs表面，在其表面通过pH敏感的化学键连接功能性分子二氢卟吩e6、化疗药物盐酸阿霉素制得靶向表皮生长因子受体的pH敏感性纳米材料TaO_x-C225 NPs，并采用透射电镜、紫外光谱、HPLC对其进行表征和药物释放测试，通过体外细胞试验以及活体成像试验测试TaO_x-C225 NPs靶向肿瘤细胞的能力以及荧光成像能力，通过构建动物模型评价TaO_x-C225 NPs光动力和化疗联合杀伤肿瘤细胞的能力。结果 体外成像结果表明，TaO_x-C225 NPs能够被肿瘤细胞HCC827特异性摄取；在体内成像中，TaO_x-C225 NPs能够特异性地汇集在表皮生长因子受体高表达的HCC827肿瘤组织中，并具有较好的肿瘤与背景的对比度。体内肿瘤治疗研究表明，TaO_x-C225 NPs联合氙灯对肿瘤具有明显的抑制效果。此外，TaO_x-C225 NPs对健康组织无明显毒性。结论 利用靶向分子探针技术以及荧光成像技术实现了肿瘤的精准诊断，并通过光动力治疗与化疗的结合克服肿瘤耐药性，实现肺癌的精确杀伤。TaO_x-C225 NPs对未来肿瘤的诊断和局部治疗具有一定的借鉴意义。