一种检测异基因骨髓移植后供体植活的巢式PCR方法

目的　利用BALB C(H - 2Kd)和C5 7BL 6 (H - 2Kb)小鼠H - 2K等位基因不同 ,建立一种检测异基因骨髓移植 (allo -BMT)后供体植活的方法。方法　分别以供鼠 (BALB C)和受鼠 (C5 7BL 6 )及allo -BMT后小鼠骨髓和脾细胞DNA为模板进行巢式PCR ,并用琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。结果　以供鼠和移植后小鼠骨髓和脾细胞DNA行巢式PCR可扩增出约 42 1bp的特异性片段 ,而未经移植的C5 7BL 6小鼠无此条带 ,与预期结果相符。结论　巢式PCR可敏感检测到不同品系小鼠H - 2K基因间的差异 ,可作为异基因骨髓移植后检测异基因是否嵌合的方法     

自然杀伤细胞对小鼠异基因骨髓移植中移植物抗宿主病效应的影响

目的:研究自然杀伤细胞(NK)在异基因骨髓移植中对移植物抗宿主病(GVHD)的影响.方法:以近交系小鼠C57BL/6(H-2b)为供鼠、BALB/c(H-2d)为受鼠,在移植物中增加供者的外周T细胞和(或)NK细胞进行异基因骨髓移植,根据临床表现和病理检查,比较不同移植组的存活率和GVHD发生情况.结果:增加1×106供鼠NK细胞的移植组中40%小鼠出现GVHD,增加2×106供鼠NK细胞的移植组中仅30%出现GVHD;与单纯异基因骨髓移植细(80%急性GVHD、20%慢性GVHD)和骨髓 T细胞组(100%急性GVHD)比较,GVHD发生率显著下降(P＜0.01),30、60和120 d存活率显著增高(P＜0.01).结论:在小鼠异基因骨髓移植中,同种异基因反应性NK细胞可抑制GVHD效应,延长存活期.     

建立大鼠异基因骨髓移植模型的实验研究

目的：建立较稳定的异基因骨髓移植模型,为异基因骨髓移植的相关研究提供实验参照。方法：以雄性SD大鼠为供鼠,雌性Wistar大鼠为受鼠,受体大鼠随机分成A（对照组）、B（移植组）两组,移植当天A、B组均接受8.5Gy的全身照射（TBI）,于照射后6h,A组回输等量培养液,B组经尾静脉输注供鼠骨髓细胞（2×10^8个/kg）。观察生存期外周白细胞计数,B组存活鼠检测Y染色体及观察有无移植物抗宿主病（GVHD）临床及病理表现。结果：A组大鼠于15d内全部死亡,外周白细胞计数明显减低,骨髓病理示造血组织减少,提示死于造血衰竭。B组大鼠均达到造血重建,8只存活超过50d,骨髓中能检测到供鼠Y染色体,另2只鼠分别于18、31d死亡,肝及小肠病理未见明显GVHD。结论：B组大鼠异基因骨髓成功植入,预处理的方式是可行的,同时单纯输入异基因骨髓细胞不能引起明显的GVHD。     

NK细胞对小鼠H-2单倍体相合骨髓移植后GVHD及造血重建的影响

目的:研究自然杀伤(NK)细胞在单倍体相合骨髓移植中对移植物抗宿主病(GVHD)及造血重建的影响. 方法: 以近交系Balb/c(H-2d)×C57BL/6(H-2b)杂交F1代小鼠(H-2d/b)为供鼠、Balb/c(H-2d)为受鼠,在移植物中增加供者的外周T细胞和(或)NK细胞进行半相合骨髓移植,根据临床表现、病理检查及外周血白细胞(WBC)数,比较不同移植组GVHD发生及造血重建情况. 结果: 骨髓 T细胞组中90%的小鼠出现GVHD,外周血WBC平均在移植后4 wk恢复正常;而骨髓 T 低浓度NK细胞组中20%小鼠出现GVHD, 外周血WBC平均在移植后3 wk恢复正常;骨髓 T 高浓度NK细胞组中仅10%出现GVHD,外周血WBC也平均在移植后3 wk恢复正常. 后两组较骨髓 T细胞组GVHD发生率显著下降(P＜0.01),外周血WBC恢复时间显著提前(P＜0.01). 结论:在小鼠单倍体相合骨髓移植中,同种反应性NK细胞可降低GVHD发生率,促进造血重建.     

人脐血CD34~+细胞在NOD/SCID小鼠上有效重建造血系统

目的探讨人脐血CD34+造血干细胞在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(no obese diabetic/severecombined Immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠模型上造血重建的作用。方法利用密度梯度离心法,从新鲜脐血中分离出单个核细胞,利用免疫磁珠分选法筛选CD34+造血干细胞,经尾静脉输注入经亚致死剂量照射后的NOD/SCID小鼠体内,移植后3、7、10、14 d分别用断尾法取小鼠外周血,血常规计数外周血动态变化情况;移植后4、6、8、10周,取其外周血,运用PCR法检测外周血中人特异性Alu基因的表达情况。结果免疫磁珠分选得到的CD34+细胞浓度达91.2%,照射后小鼠骨髓腔内有核细胞和巨细胞数量明显减少或消失,达到清髓目的。移植后第3天移植组小鼠外周血各系细胞均明显低于正常组(P<0.01),移植后第7天,移植组小鼠外周血象开始恢复,明显高于阴性对照组[白细胞:(3.90±0.53)×109/L vs(1.30±0.18)×109/L,血红蛋:(139.8±5.0)g/L vs(79.8±11.0)g/L,白血小板:(253.0±17.5)×109/L vs(52.0±6.9)×109/L,(P<0.01)],移植后第10天,移植组小鼠外周血象恢复到辐照前水平,与正常组无差别。移植4周后,PCR方法在小鼠外周血中可检测到人特异Alu基因序列,未移植组小鼠照射后2周内全部死亡。结论经照射后的NOD/SCID小鼠通过人脐血CD34+细胞植入可建立起人鼠嵌合模型。NOD/SCID小鼠经照射后,不破坏骨髓造血微环境及造血基质,可用于异基因细胞移植模型。人脐血CD34+细胞移植入NOD/SCID小鼠,其造血系统能有效重建。     

刺五加注射液对放射损伤小鼠骨髓造血微环境的保护作用

目的　观察刺五加注射液对放射损伤小鼠骨髓造血微环境的保护作用。方法　①60 Coγ射线辐射小鼠建立骨髓微血管放射损伤模型 ;②取 6周龄左右雌性小鼠随机分为正常、模型、模型 刺五加注射液低剂量、模型 刺五加注射液高剂量和模型 复方丹参注射液 5组 ,采用分光光度计法分别测定提取的各组小鼠股骨骨髓血红蛋白溶液标本的光密度(OD)值 ;鼠尾采血测定外周血红细胞、白细胞数量和血红蛋白含量 ;并分别观测骨髓毛细动脉根数、面积和骨髓造血组织容量百分率。结果　刺五加注射液能明显降低放射损伤小鼠骨髓血红蛋白含量、提高外周血红细胞和白细胞的数量以及增加骨髓毛细动脉根数、面积和骨髓造血组织容量百分率。结论　刺五加注射液能明显修复放射损伤小鼠骨髓微血管 ,保护骨髓造血微环境     

外源性mFasL-cDNA基因干预后骨髓造血细胞功能的实验研究

目的:探讨FasL基因转移后造血细胞活性是否到影响,骨髓移植(BMT)后受者骨髓造血功能是否受改变。方法:FasL-cDNA经鉴定后,常规收集BalB/c小鼠和BAC小鼠股骨和胫骨骨髓单个核细胞(BMMNC),采用脂质体转移法将FasL基因转入BalB/c小鼠BMMNC,然后按1∶0.625体外与BAC鼠BMMNC混合培养,6d后实验组(第3组)尾静脉输注给经致死量照射的BalB/c小鼠,同时设立:第1组(空白对照组即未移植细胞);第2组(未转染基因BalB/c鼠BMMNC+BAC鼠BMMNC);第4组(同基因BMT组)。观察移植后受者鼠造血功能及细胞来源,移植物抗宿主病(GVHD)及生存率。结果:BMT后10,20d,第4组白细胞及血小板计数明显高于第2、3组(P<0.01);第2、3组间差异不显著(P>0.05);30d,各组间均无显著性差异(P>0.05);第1组小鼠相继于1周内死亡,死亡后取脾观察未见脾结节形成。第2组、第3组存活的11只雌性BalB/c小鼠BMMNC中,Y染色体出现率为(79.35±6.77)%。第2组、第3组、第4组2月生存率分别为30%、80%、100%。第3组生存率明显高于第2组(P<0.01),与第4组无显著差异(P>0.05)。第3组少数及第2组中大部分鼠移植30d出现GVHD表现,两组死亡鼠及第2组存活鼠组织因子改变符合Ⅱ-Ⅲ度GVHD病理变化,第3组存活7只鼠中有Ⅰ度GVHD病理变化。结论:转基因自体造血细胞与异基因供体BMMNC混合培养后移植,能使受者获给供体来源的造血重建,并明显降低GVHD发生。     

移植前输注供体细胞的小鼠单倍体相合骨髓移植实验

目的建立小鼠非清髓性单倍体相合骨髓移植模型,探讨移植前输注供体细胞的造血干细胞植入效果。方法以CB6F1雌性小鼠为受鼠,C57BL/6雄性小鼠为供鼠,移植前3d经尾静脉输注供鼠脾细胞或骨髓细胞3×107,输注细胞后24h和48h分别通过腹腔注射阿糖胞苷0.015g/d,移植前1d予450cGy全身照射（TBI）,移植当天输注供鼠骨髓有核细胞5×107/只。监测受鼠白细胞恢复、Y染色体性别决定基因（SRY）以及外周血供鼠CD3＋细胞嵌合状态。结果单纯给予TBI小鼠均存活,且移植后30d白细胞恢复正常,TBI＋骨髓细胞移植（TBI＋BMT）组移植后14、30、60d时外周血SRY基因PCR检测结果均阳性,60d供体CD3^＋细胞嵌合率达54.4%。移植前输注供体脾细胞组嵌合率最高,移植后60d达93.5%±4.8%,优于移植前输注供体骨髓细胞组（P〈0.05）。结论 450cGy TBI的非清髓性预处理可以成功建立非清髓性单倍体相合骨髓移植模型,移植前输注供体脾细胞可促进造血干细胞植入。     

川芎嗪对骨髓移植小鼠造血细胞SDF-1表达水平的影响

为探讨川芎嗪对骨髓移植(BMT)后造血重建过程中基质细胞来源因子(SDF-1)的作用,建立了典型同基因BMT小鼠模型,胃饲川芎嗪注射液每次2 mg,2次/d,分别于BMT后第7、14 d计数外周血细胞骨髓单核细胞(BMNC)并测定骨髓组织切片中SDF-1的表达.结果表明川芎嗪组BMT后第7、14 d外周血细胞计数、BMNC计数及骨髓组织切片中SDF-1表达水平均高于BMT组.提示川芎嗪能在骨髓移植造血重建早期促进骨髓基质细胞表达SDF-1,可能是促进BMT后造血干细胞(HSC)回髓、加速造血重建的机制之一.     

不同小鼠之间异基因骨髓移植免疫耐受的实验研究

目的　研究有效诱导异种骨髓移植耐受的方法和对异基因骨髓移植重建的影响。方法　将C57BL 6J小鼠辐射后 ,尾静脉注射 1× 10 7个BALB c小鼠骨髓细胞 (输入骨髓细胞前 4h ,注射供鼠的活化NK细胞 ) ,观察生存期、体重、病理组织学等指标。结果　经骨髓及NK细胞输注的小鼠能显著提高受体小鼠的生存率 ,减轻移植物抗宿主病 (GVHD)的病理伤害程度。结论　在小鼠异基因骨髓移植初期 ,输入供鼠的NK细胞和骨髓细胞 ,能促进造血重建 ,预防移植物抗宿主病的发生     

Graft-versus-leukemia effects from donor lymphocyte infusion after nonmyeloablative allogeneic bone marrow transplantation in mice

Background Nonmyeloablative allogeneic bone marrow transplantation has been used since the 1990s as a new hematological stem cell transplantation strategy for treating hematological diseases. The purpose of this study was to explore the graft-versus-leukemia (GVL) effects of donor lymphocyte infusions (DLIs) after nonmyeloablative allogeneic bone marrow transplantations, while assessing the declines in treatment-associated morbidity, mortality, and graft-versus-host disease (GVHD).Methods A total of 615 (H-2k) mice were injected with L615 tumor cells and received 500 cGy (60Coγ-ray) irradiation three days later, followed by an allogeneic bone marrow transplantation (allo-BMT). The allo-grafts consisted of 3×10（7） bone marrow cells and 1×10（7） spleen cells from BALB/C (H-2d) donor mice. Two days after the allo-BMT, the recipient mice were given 200 mg/kg of cyclophosphamide. Subsequently, recipient mice were infused with either donor spleen cells ［2×10（7）］ on day 14 or 21, or donor spleen cells ［5×10（7）］ pretreated with hydrocortisone and cyclosporin A (CsA) in vitro on day 14 post-BMT.Results The median survival time of mice that received DLI on day 21 and pretreated DLI on day 14 post-BMT was longer than that of controls and the day 14 DLI group (P&lt;0.01). No evidence of severe GVHD was observed in the day 21 DLI group nor in the day 14 treated DLI group. Mixed chimerism was confirmed in the day 14 DLI group, the day 14 treated DLI group, and the day 21 DLI group on the thirteenth day post-transplantation; full donor chimerism was observed two weeks after DLI.Conclusion Donor lymphocyte infusion after nonmyeloablative bone marrow transplantation may reduce transplantation-associated morbidity and mortality while strengthening graft-versus-leukemia effects.     

骨髓移植治疗DMD模型鼠后骨髓重建和目的蛋白的表达

目的：观察在骨髓移植(bone marrow transplantation，BMT)治疗Duchenne型肌营养不良症(DMD)模型鼠mdx鼠后．骨髓重建过程及目的蛋白的表达情况方法：对致死剂量放疗的20只mdx鼠进行BMT，于放疗后2、4、7、14、21、30d断尾取血，观察血液性状，用红细胞计数板计数红、白细胞数量，瑞-姬染色观察血涂片中血细胞变化情况，于移植后2个月用荧光免疫组化染色观察受体骨骼肌dystrophin的表达情况。结果：白细胞对放疗的反应最敏感、下降最快，红、白细胞在放疗1周内下降到最低点、血容量减少1周后白细胞和血容量逐渐增多，1个月左右恢复正常在移植后2个月部分mdx鼠肌膜上有dystrophin的表达结论：对外周血象的观察，可间接、敏感地反映放疗效果及骨髓造血情况，从而推断BMT成功与否BMT可使骨髓重建后病损骨骼肌上表达目的蛋白，利于骨骼肌修复。     

Effect of ligustrazine on hematopoiesis in bone marrow transplantation mice

Hematopoietic reconstitution after bone marrowtransplantation is a complicated process,whichconcerns with the quality and quantity ofhematopoietic stem cell (HSC) ,and also with therecovery of hematopoietic inducing microenvironment(HIM) .The contact of HSC and HIM is critical forhematopoietic reconstitution.1　MATERIALSAND METHODS1 .1　Materials1 .1 .1　 Animals　　 BALB/c mice of both sexes(clean class,close copulatory series (H- 2 d,MLSb) )were 8— 1 0 weeks old,and 1 7— 2 …     

Effect of Ligustrazine on the Expression of LFA-1, ICAM-1 Following Bone Marrow Transplantation in Mice

Asablood activatingChinesedrug ,ligustrazinecanimprovethemicroenvironmentofbonemarrow ,increasetheadherentfunctionofstromalcellsandpromotethegrowthofhematopoieticcells[1] .Toin terprettherolesthatligustrazineplaysinbonemar rowhematopoieticreconstitutionan…     

骨髓间充质干细胞对急性淋巴细胞白血病小鼠骨髓移植后GVHD和GVL的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞(BMMSC)对急性淋巴细胞白血病(ALL)小鼠异基因骨髓移植(allo-BMT)后移植物抗宿主病(GVHD)和移植物抗白血病(GVL)的影响。方法:以ALL小鼠为动物模型,对其进行al-lo-BMT的同时,静脉输注经体外培养的供鼠BMMSC,同时设立单纯allo-BMT对照组。流式细胞仪检测受鼠CD4+、CD8+T细胞亚群的差异;记录受鼠存活时间;观察受鼠发生GVHD一般反应及病理学变化。结果:BMMSC减少受鼠CD4+T细胞数量的同时增加CD8+T细胞的数量;明显延长ALL小鼠allo-BMT后的生存时间;推迟GVHD发生的时间。结论:BMMSC与allo-BMT联合移植具有一定的GVL;BMMSC能抑制ALL小鼠allo-BMT后GVHD的发生,但同时具有一定程度的GVL。     

Effects of Platelet Factor 4 on Expression of Bone Marrow Heparan Sulfate in Syngenic Bone Marrow Transplantation Mice

Platelet factor 4 ( PF4) is a negativehematopoietic factor.It can inhibit the prolifera-tion of endothelial cells and hematopoietic stem/progenitor cells,particularly megakaryoryocyticcells,reversibly[1] ,inhibit DNA synthesis,blockcell cycle progression during S phase and reducethe sensibility of normal hematopoietic stem/pro-genitor cells,but not some cancer or leukemia celllines,to cytotoxic drugs and ionizing radia-tion[2 - 3] ,and it also can cause a population in-crease of the stem cel…     

具骨髓间充质干细胞表型的成体干细胞移植造血

目的为了探索骨髓成体干细胞是否能重建超致死剂量射线照射后小鼠的造血功能.方法采用液体培养分离,培养,扩增雄性小鼠骨髓成体干细胞,作为供体细胞,将受体雌性小鼠预先经Cs137全身照射850rad后在4 h内从尾静脉输入细胞.受体小鼠分为5组,每组10只a正常小鼠不经任何处理;b输入6×106cell/只(0.3ml)新鲜全骨髓;c输入6×106 cell/只(0.3 m1)去基质细胞的造血细胞;d输入6×106cell/只(0 3 m1)经培养后的成体干细胞,输注细胞后第1天上、下午肌肉注射各一次Granulocyte colony stimulating factor(G-CSF)等细胞因子;e注射D-Hanks液0.3ml/只.观察各组小鼠的存活情况,小鼠在输注前查尾静脉血,计细胞总数、涂片、分类,输细胞后每周各组分别取小鼠肝、脾、股骨,固定作病理切片,另外一侧股骨冲出骨髓,计数一条股骨有核细胞数、涂片、测定colonyforming unit-granulocyte/macrophage(GM-CFU)值.结果输全骨髓组外周血有核细胞和骨髓有核细胞数及GM-CFU值在输注后的第1,2周都高于单输成体干细胞组,但单输基质细胞组有核细胞逐渐恢复,小鼠存活好,至输注后第3周,无论外周血或骨髓中的有核细胞都较第2周明显恢复,GM-CFU也明显升高,而单输造血细胞和D-hnks液组小鼠存活7～8 d死亡.结论小鼠超致死剂量照射后,输入经培养后的同种小鼠骨髓成体干细胞配合G-CSF等细胞因子注射可重建小鼠造血功能.     

Study on the effects of Guiqi Oral Liquid in promoting recovery of hematopoiesis in acute irradiation injured mice

Objective: To explore the effects and possible mechanisms of Guiqi Oral Liquid (GQOL) on the recovery of hematopoiesis in acute irradiation injured mice.Methods: The acute irradiation injured mice were randomly divided into 2 groups: the treated group and the control group, and also a normal control group was set up with 6 mice in it receiving no treatment. After the mice in the former two groups were irradiated by 6.0 Gy⁶⁰Coγ-ray, every one of them was given 0. 4 ml GQOL or saline in equal volume through a gastric tube twice a day for 14 days. On the 4th, 8th and 14th day after irradiation, the bone marrow mononuclear cells (BMMNC) and megakaryocytes in bone marrow tissues of the mice were counted, the proportion of hematopoietic tissues (by area) was measured, and the expression of adhesion molecules, CD44 and CD54, in bone marrow were estimated by immunochemistry. The colony forming unit of spleen (CFU-S) in the mice were counted on the 8th day after irradiation.Results: On the 4th, 8th, 14th day after irradiation, the count of BMMNC and megakaryocyte, and the proportion of hematopoietic tissues in the treated group were higher than those in the control group (P<0.01 orP<0.05). CD44 and CD54 expression in the treated group were higher than those in the control group on the 4th and 8th day (P<0.01), but near normal on the 14th day (P<0.01). On the 8th day, CFU-S count in the treated group was higher than that in the control group (P<0.01).Conclusion: GQOL can regulate the expression of adhesion molecules, CD44 and CD54, in the bone marrow of the acute irradiation injured mice, which may be one of the mechanisms of GQOL in accelerating the early phase hematopoiesis recovery of mice. Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 39870926)