rhBMP2/TGF-β对β-磷酸三钙与骨髓基质细胞自体皮下成骨能力的影响

目的：观察rhBMP₂/TGF-β对β-磷酸三钙与骨髓基质细胞在自体皮下成骨能力的影响。方法：应用矿化条件培养液体外培养成年新西兰兔的骨髓基质细胞,收集细胞并以5×10⁶,·mL^-1浓度分成4组,A组加入rhBMP₂（15 μg）／TGF-β(30 ng) ,B组加入rhBMP₂（15 μg）,C组不加因子作为对照,然后将细胞接种在β-磷酸三钙上,体外培养3 d,D组细胞不接种材料上,继续体外培养。组织化学方法检测碱性磷酸酶。将复合物埋植于新西兰兔自体皮下。5周后常规HE染色、免疫组织化学染色并进行图像分析,观察Ⅰ型胶原、骨形成蛋白合成情况。结果：A、B组的碱性磷酸酶平均A值显著高于C、D组（P<0.01）;复合物植入皮下5周时HE染色见各组均有条索状骨基质形成, A、B组Ⅰ型胶原平均灰度值明显低于C组（P<0.01）,各组免疫组织化学检测及图像分析显示骨形成蛋白的表达差异无显著性（P>0.05）。结论：β-磷酸三钙与骨髓基质细胞在自体皮下能够形成骨组织,rhBMP₂/TGF -β较rhBMP₂有更强的促进骨形成作用。     

富血小板纤维蛋白对人牙髓干细胞增殖、凋亡 及碱性磷酸酶活性的影响

目的 探讨富血小板纤维蛋白（PRF）对人牙髓干细胞增殖、凋亡及碱性磷酸酶活性的影响及机制。 方法 从人牙髓组织中分离出人牙髓干细胞（hDPSCs）,hDPSCs 随机分为对照组及实验组,CCK8 实验检测PRF 刺激hDPSCs 第0、1、3、5 及7 天时细胞增殖情况;RT-PCR 检测PRF 刺激hDPSCs 第0、3、7 及14 天时 碱性磷酸酶（ALP）的mRNA 表达情况;流式细胞仪检测PRF 刺激hDPSCs 7 d 后细胞的凋亡情况,Western blotting 检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）、p38、p-p38 蛋白表达。结果 实验组第1 天时细胞的增殖与对照组比较,差异无统计学意义（P >0.05）,第3、5、7 天时细胞的增殖均高于 对照组,差异有统计学意义（P <0.05）;实验组第3 天时ALP mRNA 表达与对照组比较,差异无统计学意义（P > 0.05）,第7 和14 天时ALP mRNA 表达均高于对照组,差异有统计学意义（P <0.05）;细胞的凋亡率及 Cleaved Caspase-3 蛋白、p-p38 蛋白表达实验组与对照组比较,差异有统计学意义（P <0.05）,实验组细胞的 凋亡率及Cleaved Caspase-3 蛋白表达均下降,p-p38 蛋白表达上调,p38 蛋白表达两组间比较差异无统计学意 义（P >0.05）。结论 PRF 可促进hDPSCs 的增殖,上调ALP 的mRNA 表达,抑制其凋亡,其机制与激活p38 信号通路有关。     

体外培养人牙髓干细胞的生物学特性

目的 研究体外培养的人牙髓干细胞的生物学特性.方法 收集因正畸拔除的第一前磨牙,用酶消化法分离能够形成克隆且具有高增殖力的细胞,细胞以低密度接种传代培养;免疫荧光法检测第3代细胞表面标志的表达;取第4代细胞,用含有20%胎牛血清、地塞米松、β甘油磷酸钠和维生素C的培养液诱导3周,茜素红染色观察诱导后细胞矿化情况,免疫荧光法检测牙本质涎蛋白(DSP)表达,改良Kaplow氏法检测诱导前后碱性磷酸酶的表达.结果 诱导前细胞表达Stro-1、Cbfa-1、和Ⅰ型胶原,碱性磷酸酶呈弱表达,不表达DSP;诱导后细胞表达DSP,碱性磷酸酶呈强表达,并可见钙结节形成.结论 分离所得细胞具有较高的增殖和分化能力,与间充质干细胞具有相似的表面标志,并在诱导后表达DSP而具备牙髓干细胞的特征.     

体外培养人牙髓干细胞的生物学特性

目的研究体外培养的人牙髓干细胞的生物学特性。方法收集因正畸拔除的第一前磨牙,用酶消化法分离能够形成克隆且具有高增殖力的细胞,细胞以低密度接种传代培养;免疫荧光法检测第3代细胞表面标志的表达;取第4代细胞,用含有20%胎牛血清、地塞米松、β甘油磷酸钠和维生素C的培养液诱导3周,茜素红染色观察诱导后细胞矿化情况,免疫荧光法检测牙本质涎蛋白(DSP)表达,改良Kap low氏法检测诱导前后碱性磷酸酶的表达。结果诱导前细胞表达Stro-1、Cbfa-1、和Ⅰ型胶原,碱性磷酸酶呈弱表达,不表达DSP;诱导后细胞表达DSP,碱性磷酸酶呈强表达,并可见钙结节形成。结论分离所得细胞具有较高的增殖和分化能力,与间充质干细胞具有相似的表面标志,并在诱导后表达DSP而具备牙髓干细胞的特征。     

CCN2 对人牙髓干细胞增殖及分化的影响

目的探讨CCN2对体外培养的人牙髓干细胞增殖、分化的影响。方法收集在延安大学附属医院口腔修复科因正畸或阻生而拔除的牙齿,酶消化法获得人牙髓干细胞,光镜下进行形态学观察,免疫荧光法检测细胞表面标志蛋白的表达。取对数生长期牙髓干细胞,加入不同浓度的CCN2将其分为CCN26．25、12．5、25、50、100μg/L组,同时设置阴性对照组;采用噻唑蓝（MTr）法检测CCN2对牙髓干细胞增殖作用的影响,通过碱性磷酸酶及Western blot检测CCN2对牙髓干细胞分化的影响。结果人牙髓干细胞呈集落状生长,免疫荧光法检测STRO-1呈阳性表达,CCN26．25、12．5、25、50、100μg／L组OD值分别为（0．78±0．05）、（0．91±0．03）、（1．23±0．09）、（1．57±0．11）、（1．61±0．15）,均高于对照组（0．51±0．02）,差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）;细胞增殖实验表明,CCN2可显著促进牙髓干细胞的增殖;此外,CCN2可促进牙髓干细胞碱性磷酸酶的活性,并呈现浓度依赖关系,CCN26．25、12．5、25、50、100μg/L组OD值分别为（0．32±0．04）、（0．43±0．04）、（0．61±0．03）、（0．79±0．06）及（0．81±0．07）,与对照组（0．19±0．03）比较,差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）;Western blot结果表明。CCN2可诱导牙本质细胞特异性标志蛋白的表达。结论CCN2可促进牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化。     

构建siRNA慢病毒载体调控人牙髓干细胞Delta1表达的实验研究

目的构建Notch配体Delta1基因慢病毒干扰载体及建立Delta1基因稳定干扰的人牙髓干细胞系。方法将Delta1基因特异性siRNA靶序列与双酶切慢病毒载体pGCSIL-GFP连接,转化,挑取阳性克隆进行PCR鉴定;利用包装细胞293T获得重组的慢病毒,感染人牙髓干细胞,分为DPSCs/Delta1-RNAi组、DPSCs/vector组和DPSCs/wt组;RT-PCR和Western blot分别检测Delta1 mRNA及蛋白的表达。结果经PCR和DNA测序鉴定,成功构建Delta1特异性siRNA的慢病毒载体,并感染牙髓干细胞;经检测DPSCs/Delta1-RNAi组Delta1 mRNA及蛋白表达较DPSCs/vector组和DPSCs/wt组明显降低,DPSCs/vector组和DPSCs/wt组之间无明显差异。结论通过成功构建的Delta1特异性siRNA慢病毒载体对人牙髓干细胞的转染实现了对其Delta1 mRNA和蛋白的调控。     

人根尖乳头干细胞生成牙髓牙本质复合体的实验研究

目的应用组织工程方法,探讨人根尖乳头干细胞（SCAP）进行牙髓牙本质复合体再生的可能性。方法从牙根未发育完
全的健康阻生智齿中分离牙乳头,用组织贴块法培养SCAP。细胞分别在成骨诱导液中培养3周及普通培养基中培养60 d后,
用茜素红检测钙结节形成情况,免疫荧光法和RT-PCR检测成骨细胞标志物碱性磷酸酶（ALP）、骨涎蛋白（BSP）、骨钙素（OC）和
牙本质涎蛋白（DSP）的表达情况。选取5~6周雌性裸鼠6只,将SCAP与羟磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）复合培养作为实验组,仅
有HA/TCP作为对照组,分别植入同一只裸鼠背部皮下,左右侧各1个。8周后移植物行HE染色和免疫组化染色观察新生组织
情况。结果SCAP在体外经成骨诱导3周及普通培养基培养60 d后,茜素红染色阳性,且表达成骨细胞标志物ALP、BSP、OC
和DSP。实验组移植物8周后可见牙髓牙本质样结构形成,且紧靠牙本质样结构内侧的细胞DSP阳性表达,而对照组未见任何
硬组织形成。结论SCAP可应用于组织工程,进行牙髓牙本质复合体再生。
     

碱性成纤维细胞生长因子体外诱导犬骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的探讨不同剂量的碱性成纤维细胞生长因子体外定向诱导犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌样细胞分化的可行性。方法采用密度梯度离心法分离犬BMSCs并进行传代培养。四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞术检测第3代BMSCs的增殖及DNA周期;取第3代BMSCs设置对照组,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）10、100μg·L^-1组进行体外诱导培养,镜下观察其形态变化,细胞生长曲线法检测细胞增殖情况;免疫荧光法鉴定心肌肌钙蛋白I（TnI）、肌球蛋白重链（MHC）和波形蛋白（Vimentin）的表达。结果密度梯度离心法得到的BMSCs呈长梭形、聚集性生长,第3代BMSCs MTT法检测结果显示细胞生长阶段为潜伏期、对数生长期及平台期。DNA周期检测结果:G₀/G₁期为（91.90±1.68）%,表明绝大部分细胞处于非增殖状态。经诱导分化3周后,3组细胞经生长曲线法检测结果显示:1³ d,bFGF10、100μg·L^-1组细胞数较对照组增殖明显,差异有统计学意义（P<0.05）;4⁵ d,对照组细胞呈对数生长趋势,bFGF 10、100μg·L^-1组细胞数量减少;6⁷ d,bFGF诱导组较对照组细胞数明显减少（P<0.05）,而bFGF 10μg·L^-1组与bFGF100μg·L^-1组比较细胞数量明显偏少（P<0.05）。免疫荧光法检测结果显示:经诱导分化4周后,bFGF 10μg·L^-1组和bFGF100μg·L^-1组的细胞均表达TnI和MHC,不表达Vimentin;对照组均不表达TnI、MHC和Vimentin。结论 10μg·L^-1bFGF能够有效促进BMSCs的体外增殖,并具有向心肌样细胞分化能力。     

五味子多糖对脑肿瘤干细胞的凋亡诱导及生长抑制作用

目的：探讨五味子多糖（SCP）对脑肿瘤干细胞（BTSCs）生长的抑制作用,阐明SCP抑制BTSCs生长的抑制机制。方法：培养原代人脑肿瘤细胞,CD133免疫磁珠法分选获得BTSCs,免疫荧光法鉴定BTSCs中神经干细胞标记抗原CD133和Nestin表达情况;将BTSCs分为对照组和不同剂量SCP组,分别用0、200、400和800 μg·L^-1SCP处理;噻唑蓝（MTT）法检测各组BTSCs的增殖率,Annexin Ⅴ-PI分析细胞凋亡率,酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组BTSCs培养上清中Bax、Bcl-2和Cascpase-3蛋白表达水平。结果：免疫荧光染色,CD133和Nestin在BTSCs中呈阳性表达。MTT检测,与对照组比较,各剂量SCP组BTSCs增殖率降低,400和800 mg·L^-1组差异有统计学意义（P<0.05）。Annexin Ⅴ-PI检测,800 mg·L^-1SCP组细胞凋亡率明显升高,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。ELISA法检测,与对照组比较,各剂量SCP组BTSCs中Bax蛋白表达水平升高（P<0.05）,800 mg·L^-1SCP组Bcl-2蛋白表达水平降低（P<0.05）,各剂量SCP组Bax/Bcl-2比值明显升高（P<0.05）。与对照组比较,800 mg·L^-1 SCP组BTSCs中Caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。结论：SCP可抑制BTSCs生长,诱导细胞凋亡可能是其作用机制之一。     

透明质酸钠对大鼠成肌细胞体外成骨分化的影响

 目的研究透明质酸钠对成肌细胞体外成骨诱导分化的影响。方法运用差速贴壁法和（或）酶消化法分离纯化的大鼠
成肌细胞,将培养至第3 代的细胞分为：（1）实验组：采用含0.1%的透明质酸钠和500 ng/mL 的重组人骨形态发生蛋白2
（rhBMP-2）的培养基进行培养;（2）对照组：以含500 ng/mL rhBMP-2 的培养基进行培养。观察诱导过程中成肌细胞形态变化。第
3 周时对其进行成骨指标检测（碱性磷酸酶活性,I 型胶原免疫组化,茜素红和碱性磷酸酶的钙结节染色）。结果实验组和对
照组成肌细胞在诱导过程中形态学改变相似。实验组和对照组碱性磷酸酶活性均升高,2组间差异无统计学意义,I 型胶原免疫
组化均呈阳性,茜素红和碱性磷酸酶染色均可见大量钙结节。结论透明质酸钠不抑制成肌细胞体外成骨分化,与成肌细胞具
有良好的生物相容性。     

BMP2在大鼠牙髓损伤修复中的表达及其对牙髓细胞的生物学效应

目的：从体内体外两方面探讨BMP2在牙髓损伤修复，尤其是牙髓细胞分化过程中的作用。方法：建立大鼠牙髓损伤修复模型和体外人牙髓细胞连续培养，采用免疫组织化学、MTT法和酶动力学等方法，检测BMP2在体内牙髓组织损伤修复过程中的表达，并比较不同浓度rhBMP2对体外人牙髓细胞连续培养各阶段细胞增殖活性及ALP活性的影响。结果：体内牙髓组织损伤修复过程中存在BMP2的表达，牙髓组织损伤修复的不同阶段其表达部位和强度发生变化；rhBMP2可提高体外培养人牙髓细胞的增殖活性，与其本身浓度有关，并可促进人虎髓细胞ALP活性，呈浓度依赖性；结论：BMP2是参与牙髓损伤修复，尤其是牙髓细胞的增殖和分化的重要因子之一。     

rhBMP2对牙髓成纤维细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响

目的了解重组人骨形成蛋白(rhBMP2)对牙髓成纤维细胞增殖活性及碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。方法用MMT比色法检测不同浓度rhBMP2作用下,牙髓成纤维细胞增殖活性的变化;用酶动力学方法检测不同浓度rhBMP2作用下ALP活性的变化。结果低浓度的rhBMP2可提高体外培养人牙髓细胞的增殖活性,浓度为200ng/mL时,增殖活性达到最大值,与对照组间差异有统计学意义(P<0.05)。并可促进人牙髓细胞ALP活性,呈浓度依赖性,与对照组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论rhBMP2能够促进牙髓细胞增殖和ALP活性,是牙髓细胞增殖和分化的重要因子之一。     

CGRP影响人牙髓干细胞增殖分化的研究

目的 研究降钙素基因相关肽(CGRP)对人牙髓干细胞增殖分化的调控作用,并初步探讨CGRP的调控信号通路.方法 首先获取健康的牙髓,体外培养并筛选牙髓干细胞;采用MTT法检测不同浓度的CGRP对牙髓干细胞的增殖作用,获取适宜的作用浓度;利用茜素红染色法观察CGRP作用下牙髓干细胞形成矿化结节的效果;在实时定量RT-PCR法及免疫印迹法检测CGRP作用下牙髓干细胞中Ⅰ型胶原(Col-1)、转录因子Runx2的mRNA和蛋白表达水平;最后利用实时定量RT-PCR法检测MAPK信号通路抑制剂作用下CGRP对牙髓干细胞中Ⅰ型胶原、Runx2 mRNA表达水平的影响.结果 经过筛选培养获得生长稳定的牙髓干细胞;MTT法检测可知CGRP可促进牙髓干细胞的增殖,在CGRP的浓度达到10-7 mol/L时效果最显著;在CGRP作用牙髓干细胞28 d后,经茜素红染色可见矿化结节;经实时定量RT-PCR法和免疫印迹法检测可知CGRP作用下牙髓干细胞中Col-1、Runx2的mRNA和蛋白表达水平得到显著提高;MAPK信号通路中ERK激酶通路能够调控CGRP作用下牙髓干细胞中Runx2表达的水平,ERK激酶和p38通路能够调控CGRP作用下牙髓干细胞中Col-1表达的水平.结论 CGRP能够促进牙髓干细胞的增殖分化,这一作用受到MAPK信号通路的调控.     

Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞

目的 建立利用Ⅰ型胶原酶消化组织块体外培养人牙髓细胞方法。方法 通过组织块Ⅰ型胶原酶消化法进行人牙髓细胞体外培养，免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源，进行细胞传代，酶组织化学法对体外复层生长的人牙髓细胞爬片进行碱性磷酸酶组织化学染色，并检测其矿化能力。结果 采用Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养的原代牙髓细胞，在第15～20d出现汇合，第4～6代牙髓细胞在连续培养后具有复层生长特性，并具有显著的碱性磷酸酶活性．阳性染色强弱部位呈区域性分布，连续培养的牙髓细胞可形成矿化结节。结论 Ⅰ型胶原酶消化组织块法可以很好地进行人牙髓细胞体外培养，可以用酶组织化学法研究牙髓细胞的生物学特性。     

rhBMP-2在体内诱导成骨中I，II型胶原及碱性磷酸酶的表达

目的：对rhBMP－2在诱导成骨中CollagenI,II及碱性磷酸酶（ALP）的表达进行研究,方法：将含rhBMP-20.5mg的松质骨载体植入55只BALB／c小鼠的右侧股部股袋内,分别术后3－21d共8个时间点取材,采用免疫组织化学方法对新生骨组织中的I,II型胶原进行检测,对ALP活性进行定量分析,观察rhBMP-2在诱导成骨中CollagenI,II及ALP的表达情况,结果：（1）II型胶原的出现是和成软骨,软骨细胞的出现相伴随的,但是,肥大,变性的软骨细胞并不表达II型胶原,（2）作为成骨细胞成熟标志物的I型胶原,ALP在软骨形成期即有表达,但是随着成骨细胞的出现,骨组织的形成I型胶原仍表现为高表达,而ALP的表达则呈下降趋势,结论：在诱导成骨中rhBMP－2促进了CollagenI,IIey ALP的表达。     

DEX和rhBMP2对体外培养人牙髓细胞碱性磷酸酶活性的影响

目的 探讨不同浓度地塞米松(Dexamethasone,DEX)、重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein 2,rhBMP2)及两者联合应用对体外培养的人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性的影响.方法 组织块法培养HDPCs并进行鉴定;采用酶动力学的方法,观察 DEX、rhBMP2及二者联合应用对HDPCs的ALP活性的影响.结果 单独应用DEX时ALP活性明显增高,且在生理浓度范围内当浓度为0.01 nmol/ml时,对HDPCs的ALP活性达到最大的刺激作用,rhBMP2对HDPCs的ALP活性呈浓度依赖性增强;当联合应用DEX和rhBMP2,ALP活性比单独应用相应浓度的rhBMP2明显增高.结论 DEX、rhBMP2对HDPCs的ALP活性均有增强作用,同时二者对HDPCs的ALP活性有显著的功能放大性协同增强作用.     

神经生长因子对兔牙髓干细胞体外增殖、成骨分化影响的实验研究

目的:探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对兔牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)体外增殖及成骨分化的影响,为牙髓组织的损伤修复提供新线索.方法:采用酶解组织块法分离培养健康新西兰兔的DPSCs,光镜下观察其形态学及生长变化.将培养的第3代DPSCs分为3...