自身血清抗体筛选人肝细胞癌抗原的分子辨认

新近发展起的重组克隆表达抗原的血清学鉴定（ＳＥＲＥＸ）技术已成功证明了几种新的人肿瘤抗原［１］。此方法在肿瘤抗原与病人自身血清反应的基础上可直接确定抗原分子，这比传统的基因法和生物化学法前进了一步。我们使用此法在肝细胞癌也筛选出一系列特异抗原或相关抗...     

SEREX方法鉴定胃癌肿瘤相关抗原基因

目的采用重组cDNA表达文库血清学分析法(SEREX法)寻找胃癌相关肿瘤抗原的编码基因.方法抽提胃癌细胞株SGC7901和1例胃癌组织标本PolyA+RNA,分别构建2个胃癌cDNA表达文库,用含有抗体的胃癌患者血清对2个文库进行筛选,并对筛选所得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果经测定2个原始文库滴度分别为1.6×106pfu和2.5×106pfu,重组率为95%和98%.2个文库经3轮筛选共获得14个胃癌肿瘤相关抗原编码基因,其中一个为未知基因.13个已知基因编码产物包括代谢酶、RNA转录和翻译调控蛋白、蛋白代谢相关分子、自身免疫疾病相关抗原及未知功能蛋白分子.结论胃癌相关肿瘤抗原编码基因的筛选和鉴定,为胃癌的临床诊断和特异性免疫治疗提供了靶点,有助于对胃癌发生机制的深入理解.     

HSV-gB、gD糖蛋白重组串联抗原表位蛋白的表达及鉴定

目的 制备HSV-gB、gD蛋白串联表位重组蛋白,为单纯疱疹病毒(HSV)疫苗的研制提供新型抗原蛋白以及新的抗原制备方法.方法 应用生物信息学软件laser gene DNASTAR分析HSV1-gB、gD和HSV2-gB、gD蛋白的抗原表位.选取9个表位,设计并合成表位串联重组蛋白编码基因X,构建其原核细胞表达重组体,在大肠杆菌BL21(DE3)表达该重组表位蛋白X,Western blot法(抗His标签)鉴定重组蛋白.结果 构建了HSV-gB、gD蛋白串联表位重组蛋白X的原核表达体,在BL21菌中表达了X蛋白,Western blot法(抗His标签)鉴定了重组蛋白X.结论 建立了制备HSV-gB、gD蛋白重组抗原表位蛋白的方法,为HSV疫苗的研制提供了可能的新型抗原蛋白.     

溶血性链球菌制剂OK432联合肿瘤冻融抗原诱导小鼠骨髓树突状细胞的成熟

目的 探讨溶血性链球菌制剂(OK432)联合肿瘤冻融抗原诱导小鼠骨髓树突状细胞(DCs)成熟的作用,改进体外诱导DCs成熟的方案,为后期制备临床使用的抗肿瘤DCs疫苗提供新的技术路线.方法 分离小鼠骨髓单核细胞(BMMCs),并在含10%胎牛血清(FCS)、重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)的培养体系中诱导培养,部分加入OK432和/或肿瘤冻融抗原冲击,光镜和透射电镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面分子CD83和CD86的表达情况.结果 经OK432联合肿瘤细胞冻融抗原冲击的DCs形态学特征典型.肿瘤冻融抗原冲击后,DCs表面CD83和CD86的表达上调,OK432进一步刺激后,CD83和CD86的表达率显著升高.结论 采用OK432联合肿瘤冻融抗原诱导DCs成熟的方案相对简便;OK432能有效促进肿瘤冻融抗原冲击后的骨髓DCs进一步成熟.     

肿瘤免疫研究进展——肿瘤配型抗原研究

本文简要回顾了近期肿瘤免疫研究进展。根据免疫学理论,提出“肿瘤配型抗原”研究,并通过作者及其研究室所完成的工作,阐述该设想成立的科学依据及展望。肿瘤配型抗原研究课题的提出,可望为肿瘤学的研究开拓一个新的领域,建立起一套检测、诊断和治疗人类肿瘤新的免疫学方法。     

两种膀胱癌抗原致敏方式对树突状细胞分泌IL-12的影响和意义

目的 研究负载膀胱癌冻融抗原和酸洗抗原肽对树突状细胞(Dcs)分泌IL-12的影响和意义.方法 反复冻融法和弱酸洗脱法分别获得膀胱癌细胞株BIU-87肿瘤抗原;联合应用重组人GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导健康志愿者DCs并负载膀胱癌肿瘤抗原;ELISA法检测第3、6、9 d培养细胞的上清液,评价DCs分泌IL-12 p70的能力.结果 联合应用重组人GM-CSF、IL-4和TNF-α可在体外诱导出DCs;经ELISA方法 检测,不同时期DCs分泌IL-12的量不同,负载肿瘤抗原DCs较未负载肿瘤抗原DCs有更强的分泌能力.负载酸洗抗原肽组分泌IL-12的量高于负载膀胱癌冻融抗原组(P＜0.05.结论 IL-12在DCs刺激特异性CTLs的过程中可能发挥重要作用,其分泌量受DCs的成熟状态及某些刺激信号的影响,膀胱癌肿瘤抗原是其刺激信号之一.酸洗抗原肽对DC分泌IL-12有更强的刺激能力.     

体内靶向树突状细胞的腺病毒通用肿瘤疫苗的构建

目的 采用细胞菌内同源重组法构建人端粒酶逆转录酶(hTRT)重组腺病毒,并将其以甘露聚糖进行表面修饰,以探索构建一种新型的体内靶向树突状细胞(DC)的通用型肿瘤抗原. 方法将编码hTRT的cDNA序列自pBABE-PURO-hTERT质粒亚克隆至腺病毒质粒pAdTrack-CMV中,将后者与骨架质粒pAdEasy-1经电冲击共转化宿主菌BJ5183进行同源重组.经过克隆筛选获得正确的重组腺病毒质粒后,将其线性化转染293细胞包装获得重组腺病毒.将重组腺病毒扩增纯化,以甘露聚糖进行表面修饰.最后将甘露聚糖修饰后的腺病毒免疫小鼠. 结果重组腺病毒能在293细胞产生细胞病变效应(CPE),腺病毒转染后的细胞通过PCR及免疫印迹能测到hTRT的表达.重组腺病毒经过甘露聚糖修饰后,经高碘酸席碱染色呈阳性.重组腺病毒能在小鼠体内靶向脾脏DC细胞. 结论成功构建能体内靶向DC细胞的hTRT重组腺病毒,为通用型肿瘤疫苗的研发作出了新的探索.     

正常和肿瘤组织中ZNF165 mRNA的表达及其自发性抗体检测

目的:分析正常和肿瘤组织中ZNF165的表达及其在肝癌患者体内诱导产生的自发性体液免疫反应.方法:采用RT-PCR和定量PCR方法检测16种正常和4种肿瘤(肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌)组织中ZNF165 mRNA及表达丰度;将ZNF165基因在原核细胞中进行蛋白表达,亲和层析法纯化重组ZNF165蛋白.Western blot方法对ZNF165在82例肝癌患者体内诱导的自发性抗体进行检测.结果:正常组织中ZNF165 mRNA只在睾丸组织表达,肝癌、胃癌、结肠癌和肺癌组织中ZNF165 mRNA阳性率分别为52.4%、 42.8%、 42.8%和21.4%.定量 PCR结果显示ZNF165 mRNA以高水平在肝癌组织与睾丸组织中表达,而在配对的癌旁组织与其他正常组织中仅存在很低水平的表达(P均＜0.01).82例肝癌患者血清中4例与ZNF165蛋白出现免疫反应,阳性率4.9%;36例正常人血清均为阴性.结论:ZNF165是一个新的肿瘤-睾丸抗原基因,它在机体内可诱导体液免疫反应,有可能作为肿瘤免疫治疗的候选抗原.     

精子蛋白17作为妇科肿瘤诊治靶标的实验研究

肿瘤免疫治疗和靶向诊断的关键是寻找合适的肿瘤相关抗原.近年发现,有数十种正常睾丸蛋白在恶性肿瘤中异常高表达[1].目前将这些蛋白归属为一组,统称为癌瘤-睾丸(cancer-testis, CT)抗原.CT抗原具有如下特征[2]:①在男性生殖细胞中高水平表达;②在正常体细胞中很少表达;③在多种类型的肿瘤中异常表达.精子蛋白17(sperm protein 17,Sp17)的基因在一些恶性肿瘤组织中被激活,并高水平表达,是一种新的CT抗原,又称CT22.其在肿瘤诊断和治疗中具有潜在价值,有望作为肿瘤诊断的标志和免疫治疗的靶点,尤其对于女性肿瘤患者.     

癌-睾丸抗原MAGE-C1及其在肿瘤免疫方面的研究进展

癌-睾丸抗原家族(Cancer testis antigens,CTAs)是一类能在多种肿瘤组织中表达,而睾丸、胎盘和胎儿卵巢以外的正常组织几乎不表达的抗原.这一表达特性使CTAs成为肿瘤免疫治疗的理想靶抗原.MAGE-C1/CT7 (melanoma antigen family C1)是CTAs家族中一个新的亚家族,近几年在肿瘤免疫领域研究较多.本文就MAGE-C1/CT7在肿瘤免疫方面的研究进展作一综述.     

CEA重组痘苗病毒对CEA阳性肿瘤的防治研究

肿瘤的免疫治疗是治疗肿瘤的新方法 ,它通过增强肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的免疫原性 ,诱导机体产生肿瘤特异性的免疫应答反应而杀伤肿瘤细胞。本系列研究采用同源重组方法构建了表达人癌胚抗原 (carcinoembryonicantigen ,CEA)的重组痘苗病毒 ,经动物实验证明了其具有强免疫原性、安全性和防治CEA阳性肿瘤的可靠性。     

梅毒螺旋体0751基因的克隆、表达及鉴定

目的 构建梅毒螺旋体0751基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达及进行免疫学鉴定.方法 以梅毒螺旋体基因组DNA为模板,PCR扩增梅毒螺旋体0751基因,构建其重组原核表达载体,并采用Western-blot方法初步鉴定该蛋白的特异性.结果 成功扩增出梅毒螺旋体0751基因,该基因在大肠杆菌表达系统中得到表达,并且特异性识别梅毒患者血清.结论 在大肠杆菌中成功表达梅毒螺旋体0751基因,为梅毒螺旋体的诊断提供了新的特异性抗原.     

衰老标记蛋白-30--一种新的肝细胞癌相关抗原

目的：寻找人肝细胞癌（ＨＣＣ）特异抗原。方法：应用重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术（ＳＥＲＥＸ）,用病人自身血清从广西肝细胞癌ＣＤＮＡ文库中选出编码ＨＣＣ肿瘤抗原的基因克隆,用肝癌患者及其他人血清检验ＨＣＣ肿瘤抗原原肝癌的特异性,测定抗原ＤＮＡ序列并一基因库核对寻找其同源结构。结果：其中一种ＨＣＣ肿瘤抗原与衰老标记蛋白－２０（ＳＭＰ－３０）是同源结构。相应抗体主要只见于ＨＣＣ病人,在２０例其它５种     

CEA重组痘苗病毒对CEA阳性肿瘤的防治研究

肿瘤的免疫治疗是治疗肿瘤的新方法,它通过增强肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的免疫原性,诱导机体产生肿瘤特异性的免疫应反应而杀伤肿瘤细胞。本系列研究采用同源重组方法构建表达人癌胚抗原的重组痘苗病毒,经动物实验证明了其具有强免疫原性,安全性和防治ＣＥＡ阳性肿瘤的可靠性。     

肺癌相关抗原的血清学筛选与鉴定

目的:筛选和鉴定肺癌肿瘤相关抗原,为肺癌早期诊断提供血清学标志物,并为研制肺癌疫苗提供候选抗原.方法:5份异体肺癌患者血清采用重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)技术对肺癌cDNA表达文库筛选;对阳性克隆插入片段进行测序、生物信息学分析.结果:①筛选出70个阳性克隆,插入片段大小为300～2 800 bp.②测序:70个阳性克隆代表63个不同的基因.③生物信息学分析:1个基因与肺癌的发生、发展关系密切;34个基因报道与细胞的分化、代谢及信号转导等有关系,与其他肿瘤的发生、发展有关;26个基因的生理功能未见文献报道;2个插入片段未发现有同源基因,推测可能为新发现的基因.结论:使用SEREX技术成功鉴定了一组肺癌相关的肿瘤抗原.     

肝细胞癌肿瘤抗原分子生物学辨认与应用研究

肝细胞癌（HCC）是病死率很高的一种恶性肿瘤,目前,HCC的诊断与治疗技术亟待改善。特异性肝癌抗原的辨认及其与宿主的关系的探讨对特异性的肝癌的诊断及免疫治疗有极其重要的意义。广西是肝细胞癌（HCC）高发区,对肝癌抗原的识别辨认具有更加重大的现实意义。SEREX技术是Sahin等于1995年创立的一种新的肿瘤抗原筛选技术。它是以肿瘤患者能对其自身肿瘤抗原产生体液免疫反应为基础。利用肿瘤患者自体血清来筛选肿瘤细胞cDNA表达文库,从而获得肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的方法。相对于传统方法来说,SEREX技术相对省时节支,而且操作起来也较为简单。很快得到了广泛的应用。     

SEREX方法鉴定胃癌肿瘤相关抗原基因

目的采用重组CDNA表达文库血清学分析法(SEREX法)寻找胃癌相关肿瘤抗原的编码基因。方法抽提胃癌细胞株SGC7901和1例胃癌组织标本PolyA+RNA,分别构建2个胃癌cDNA表达文库,用含有抗体的胃癌患者血清对2个文库进行筛选,并对筛选所得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果经测定2个原始文库滴度分别为1.6×106pfu和2.5×106pfu,重组率为95%和98%。2个文库经3轮筛选共获得14个胃癌肿瘤相关抗原编码基因,其中一个为未知基因。13个已知基因编码产物包括代谢酶、RNA转录和翻译调控蛋白、蛋白代谢相关分子、自身免疫疾病相关抗原及未知功能蛋白分子。结论　胃癌相关肿瘤抗原编码基因的筛选和鉴定,为胃癌的临床诊断和特异性免疫治疗提供了靶点,有助于对胃癌发生机制的深入理解。     

布氏杆菌PBP39蛋白抗原表达及免疫效果的研究

目的获得纯化的布氏杆菌PBP39重组蛋白抗原,观察PBP39重组蛋白的免疫原性.方法扩增不同种布氏杆菌PBP39基因,测序、连接表达载体PET32a,诱导表达,柱纯化PBP39重组蛋白抗原,免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗体及抗体亚型.结果我国牛、羊、猪布氏杆菌PBP39基因与国外已报道的PBP39编码基因不完全相同.在蛋白N端58位碱基后多一G,造成移码突变.故在85、86、87位编码终止子TCA.而在134、135、136位的ATG又编码了新的起始密码.布氏杆菌PBP39蛋白在大肠杆菌高效表达,表达量达40%,纯化重组蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,产生了较高水平的特异性抗体免疫应答,抗体亚型主要是IgG1.结论我国牛、羊、猪布氏杆菌PBP39编码抗原蛋白同国外已报道的不完全相同,纯化的PBP39重组蛋白抗原可诱导高水平的抗体反应,为筛选布氏杆菌病新型疫苗保护性抗原分子奠定了基础.     

鼻咽癌患者血清中自身抗体的初步检测

目的:探讨鼻咽癌患者血清中是否存在抗鼻咽癌自身抗原的抗体,为寻找鼻咽癌新的肿瘤标志物提供依据.方法:制备Epstein-Barr病毒阴性的鼻咽癌细胞株CNE1细胞板,酶联免疫吸附实验(ELISA)分析其与32例鼻咽癌患者血清和54例正常血清反应的差异性;提取CNEl总蛋白,Western印迹分析其与鼻咽癌患者血清反应是否存在特异性的蛋白质.结果:ELISA分析显示鼻咽癌患者血清平均滴度(0.904±0.032)明显高于正常人血清平均滴度(0.736±0.028)(P＜0.01);Western印迹分析发现鼻咽癌患者血清与正常人血清相比,部分阳性条带一致,但条带强度增加,还发现出现了部分新的阳性条带,这些条带可能属于鼻咽癌相关抗原或鼻咽癌特异性抗原.结论:鼻咽癌患者血清中存在抗鼻咽癌自身抗原的抗体,这些抗体并非针对Epstein-Barr病毒,为寻找鼻咽癌血清肿瘤标志物提供了依据.     

食管癌及癌前病变患者血清中多个自身抗体检测的研究

目的:探讨多个肿瘤相关抗原微阵列在食管癌及癌前病变患者血清自身抗体检测中能否提高癌和癌前病变患者的检出率。方法:肿瘤相关抗原微阵列包含8个重组的癌抗原蛋白C-myc,p53,cyclinB1,p16,p62,Koc,IMP1,Survivin,它们分别来自相应的cDNA文库的表达。应用间接酶联免疫反应法检测863例食管不同病理类型血清中的自身抗体。结果:在8个抗原中,p53、C-myc、IMP1、p16、Koc和Survivin在食管各级病变中阳性百分率具有线性趋势。在食管各级病变中,尤其是Survivin,从正常到癌其阳性百分率分别是:10%、10%、20%、100%,正常和DYS和SCC之间差异显著。单一抗体的反应频率均较低,当应用多个抗原分析时,即在8个肿瘤相关抗原中至少有一个反应为阳性时,本研究的阳性率明显增高,即:10%、30%、50%和100%,正常与各级病变之间差异显著(P<0.05)。结论:联合应用多个肿瘤相关抗原比应用单个肿瘤相关抗原分析食管癌及癌前病变患者血清中的自身抗体变化更能够提高癌和癌前病变患者的检出率。食管癌特异性的多个相关抗原微阵列的进一步优化有可能作为临床上食管肿瘤和高危人群检测和诊断的非侵袭性方法。