再生障碍性贫血患者骨髓及外周血T、NK细胞膜分子和可溶性分子动态变化

目的研究T淋巴细胞及免疫分子在再生障碍性贫血（AA）致病中的作用及其与临床疗效的相关性。方法应用免疫荧光染色技术和流式细胞仪分析AA骨髓及外周血T淋巴细胞表型，ELISA测定骨髓和外周血白介素-2及其可溶性受体（IL-2，sIL-2R）、可溶性Fas配体（sFas-L）和Flt3配体（FL）的水平。结果（1）AA病人骨髓和外周血CD8+细胞百分率增加，CD4/CD8比例下降；骨髓血CD25+和HLA-DR+细胞百分率增多，急性AA增加尤为显著（P<0.01）；骨髓血中CD16+或CD56+细胞百分率也明显增多（P<0.05）。（2）所有AA患者骨髓及外周血IL-2含量均显著升高，绝大部分患者的sFas-L含量增加，FL水平升高尤为显著，高达正常水平的20倍。IL-2、sFas-L和FL的含量与临床疗效密切相关，经治疗有效的患者骨髓和外周血的IL-2、sFas-L和FL水平明显下降，但FL仍不能降至正常水平。结论T细胞的异常活化，多种免疫分子表达的异常升高，以及产生针对自身造血干/祖细胞的细胞毒效应，是AA造血功能衰竭的主要原因。     

Flt3配体促进再生障碍性贫血患者淋巴细胞向TH1表型分化

目的　探讨Flt3配体 (FL)对再生障碍性贫血 (AA)辅助性T细胞 (TH)分化的影响及与造血功能衰竭的相关性。方法　应用流式细胞仪分析AA患者骨髓及外周血中TH 亚群 ,并观察植物血凝素 (PHA)和白细胞介素 2 (IL 2 )对AA患者TH 亚群影响 ;体外培养研究FL对骨髓和外周血T细胞分化及细胞因子分泌的作用。结果　AA患者骨髓及外周血中TH1细胞比例明显增高 ,且以急性AA更为显著 (P <0 .0 1) ,TH1与TH2细胞比例失衡 ,TH1 TH2比例显著高于正常对照 (2 .1± 0 .8和 1.4± 0 .7,P <0 .0 5) ;AA及正常人淋巴细胞经PHA和IL 2激发后TH1比例并无明显变化 ,而正常人骨髓细胞经与FL共同孵育 10d后 ,培养上清中IFN γ含量增高 ,表型分析提示 ,除TH1细胞比例增加外 ,树突状细胞及自然杀伤细胞阳性率也有明显增加。结论　FL通过树突状细胞诱导淋巴细胞向TH1表型分化 ,是AA造血功能衰竭的原因之一。     

环孢菌素通过FLIP影响再生障碍性贫血患者CD8+T细胞亚群CD28的表达

目的研究共刺激分子CD28在再生障碍性贫血（AA）患者的不同T细胞亚群中的表达变化，及其与凋亡抑制蛋白FLIP的关系。方法取21例AA患者环孢菌素A（CyA）治疗前后的外周血，应用流式细胞仪检测T细胞CIMCD28、CD8CD28的表达；磁珠分选患者治疗前后外周血的CD8^＋T细胞，RT-PCR检测治疗前后FLIP、Caspase-8表达变化；分选获得的治疗前的CD8^＋ T细胞体外经CyA处理后检测其CD28、FLIP、Caspase-8的表达变化。结果AA患者的CD8^＋ CD28^＋ T细胞的比例较正常人显著升高，治疗有效者该亚群的细胞比例在治疗后趋于正常；患者CD8^＋ T细胞的FLIP表达显著上调，但Caspase-8的表达无明显变化；CyA能下调患者CD8^＋T细胞的FLIP的表达。结论AA患者CD8^＋CD28^- T细胞亚群比例升高与FLIP表达增加有关，CyA能抑制FLIP的表达，降低CD8^＋CD28^-T细胞的比例。     

再生障碍性贫血外周血和骨髓免疫活性分子变化及临床意义

目的:研究免疫活性分子异常在再生障碍性贫血（AA）发病中的作用及临床意义。方法:应用ELISA测定AA患者骨髓（BM）及外周血（PB）白介素-2（IL-2）、Flt3配体（FL）、可溶性Fas配体（sFasL）的含量变化。结果:AA患者BM及PB中IL-2含量均显著升高;与正常对照相比,该种变化在急性AA尤为明显（P<0.01）,绝大部分患者sFas-L含量增加;FL水平升高尤为显著,达正常水平的25倍以上,且PB与BM的浓度无区别,经治疗有效者IL-2、sFasL和FL明显下降,但sFasL和FL水平不能恢复正常,动态测定表明IL-2、sFas-L和FL的含量与临床疗效密切相关。结论:AA患者PB和BM中免疫活性分子增多是其自身反应性T细胞的异常活化原因之一,定期测定IL-2、sFasL和FL有助于预后判断。     

再生障碍性贫血患者淋巴细胞表型变化

目的：研究再生障碍性贫血（AA）患者骨髓（BM）及外周血（PB）淋巴细胞及其活化相关分子的表达及临床意义。方法：采用单色和双色免疫荧光标记法，流式细胞仪分析AA患者的BM和PB中淋巴细胞膜分子的表达。结果：AA患者BM和BP中CD8^ 细胞增加，CD4／CD8比例下降，BM在CD25^ 细胞和HLA－DR^ 细胞增多，急性AA增加尤为显著（P＜0．01），BM中CD16^ 或CD56^ 细胞也明显增多（P＜0．05），双标记分析提示T细胞主要为CD8^ 细胞：急性AA患者CD8^ -CD25^ 细胞显著增多（P＜0．01），AA患者BM中淋巴细胞活化相关分子表达增多，尤其4－1BB^ ,CD95L^ 和CD40L＋细胞显著增多（P＜0．01），结论：AA患者BM中淋巴细胞活化相关膜分子增多，是AA免疫功能异常及最终导致造血功能衰竭的原因之一。     

SARS患者急性期外周血CD3+、CD4+及CD8+细胞数量的变化

目的 探讨SARS患者外周血T淋巴细胞亚群的变化及其临床意义。方法 用全自动血细胞分析仪检测44例SARS患者外周血白细胞计数及分类，用流式细胞仪检测SARS患者外周血T淋巴细胞亚群；并与正常对照组比较。结果 与对照组比较，SARS组患者白细胞总数显著下降，淋巴细胞百分数和绝对数显著下降，粒细胞绝对数显著下降，粒细胞百分数显著增加；CD3^ 、CD4^ 和CD8^ 细胞绝对数显著下降，CD3^ 、CD4^ 及CD8^ 细胞百分数和CD4^ /CD8^ 比值与对照组比较无显著性差异。结论 SARS冠状病毒感染损伤患者细胞免疫功能。     

树突状细胞在再生障碍性贫血患者T细胞寡克隆增生中的作用

目的：探讨树突状细胞（Dendritic cell,DC）在再生障碍性贫血（AA）发病中的作用,尤其是对淋巴细胞异常活化的激发作用。方法：采用直接免疫荧光标记流式细胞术分析AA患者骨髓中I型DC的比例;在体外用重组人粒单细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）及白介素4（IL-4）诱导外周血单个核细胞成为DC,流式细胞仪检测DC表型,并观察经纯化人脐血CD34^＋细胞抗原,经可溶性人CD40配体（rhsCD40L）激发后对自体T细胞活化和扩增效应;实时定量PCR（RQ-PCR）定量测定DC载荷抗原前后T细胞TCRVβ基因谱的改变。结果：AA患者骨髓中CD1a^＋CD11c^＋细胞和CD11c^＋CD83^＋双阳性细胞比例增多,且以CD11c^＋CD83^＋双阳性的成熟DC为主;外周血来源的DC负载人脐血CD34^＋细胞后对自体淋巴细胞具有明显的刺激作用,并使T细胞TCRVβ基因谱发生取用偏移。结论：DC在AA淋巴细胞寡克隆增殖中起重要作用,但识别的何种抗原尚进一步研究。     

趋化因子及受体与中国HCV/HIV合并感染相关性的研究

目的：探讨趋化因子自细胞介素8（IL-8）、干扰素诱导蛋白10（IFN-inducible 10-kdaprotein，IP-10）及趋化因子受体CCR5、CXCR3，在丙肝病毒（HCV）单纯感染，艾滋病病毒（HIV）单纯感染和HCV／HIV合并感染过程中的表达及意义。方法：采用流式细胞术，检测HCV感染组（n=21）、HIV感染组（n=14）、HCV／HIV感染组（n=28）及正常对照组（n=30）人外周血CD4^＋T淋巴细胞和CD8^＋T淋巴细胞表面CCR5、CXCR3的表达。ELISA方法检测血清趋化因子IL-8、IP-10含量。结果：HCV感染组、HIV感染组和HCV／HIV合并感染组，血清IP-10水平都明显升高，而在合并感染组水平最高；血清IL-8水平在3组亦明显升高。HIV感染组及HCV／HIV合并感染组CD4^＋T细胞表面CXCR3表达显著降低（P〈0．001），CD8^＋T细胞表面CXCR3表达显著升高（P〈0．001）；HCV感染组CD4^＋及CD8^＋T细胞表面CXCR3表达轻度升高，但差异不显著。HCV感染组及HCV／HIV合并感染组CD4^＋及CD8^＋T细胞表面CCR5表达显著降低（P〈0.001）；HIV感染组CD4^＋及CD8^＋T细胞表面CCR5表达显著升高（P〈0.001）。结论：中国HCV／HIV合并感染患者中，血清IL-8和IP-10水平都明显升高；受体CXCR3在CD4^＋T细胞表面表达降低，而在CD8^＋T细胞表面表达升高；受体CCR5在CD4^＋及CD8^＋T细胞表面表达降低，提示趋化因子及受体与HCV／HIV合并感染密切相关。     

CD226在系统性红斑狼疮患者T淋巴细胞亚群上的表达

目的：研究CD226在SLE患者外周血T淋巴细胞亚群上的表达，以阐明CD226抗原在SLE患者体内T细胞活化中作用以及与SLE发病的关系。方法：31例SLE患者和30例健康志愿者外周血单个核细胞，在体外培养72h后，三色荧光标记的单克隆抗体染色，利用流式细胞仪测定T细胞亚群细胞表面CD226抗原的表达。结果；SLE患者组的CD3^ 、CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞上CD226^ 表达均高于正常对照组（P＜0．01）；活动期SLE组、静止期SLE组的CD3^ 、CD4^ 、CD8^ T细胞上CD226^ 表达均显著高于对照组（P＜0．01），而活动期与静止期患者之间T细胞亚群上CD226^ 表达则无显著性差异（P＞0．05）。SLE患者CD3^ 、CD4^ 、CD8^ T细胞CD226^ 抗原表达水平与SLEDAI之间无明显相关性（P＞0．05）。结论：SLE患者体内存在T细胞亚群异常活化；活动期、静止期SLET淋巴细胞CD226^＋表达均增高，CD226^ 可能参与了SLE的免疫发病。     

多发性硬化患者淋巴细胞亚群的研究

目的 观察多发性硬化患者外周血及脑脊液中淋巴细胞亚群的水平。方法 用碱性磷酸酶抗磷酸酶法检测了56例多发性硬化（MS）活动期患者外周血和脑脊液（CSF）的淋巴细胞亚群。结果：活动期MS患者外周血CD4^ 、CD8^ 细胞较对照组减少，CD25^ 细胞、CD4^ /CD8^ 比值较对照组升高（P＜0．05）。CSF中CD4^ 、CD25^ 细胞、CD4^ ／CD8^ 比值较对照组升高，CD8^ 细胞降低（P＜0．05＜0．05），且CSF中淋巴细胞亚群均高于自身外周血中的相应细胞（P＜0．05）。经肾上腺皮质类固醇激素治疗后，随病情缓解，外周血、CSF中的淋巴细胞亚群均有不同程度的改善。结论 淋巴细胞亚群可能参与MS的发病，并与MS的缓解－复发有关。     

脐血与成人骨髓淋巴细胞及其亚群比较

比较脐血与骨髓T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞亚群的分布特点及血清sIL-2R和IgG水平的不同,探讨脐血移植后免疫重建延迟、GVHD及GVL效应的发生机制。应用流式细胞仪分别检测脐血及骨髓CD3+、CD3+CD5+、CD3+CD45RA+、CD3+CD45RO+、CD3+CD25+、CD19+、CD19+CD10+、CD19+CD40+、CD19+CD23+、CD3-CD16+CD56-及CD3-CD16+CD56+细胞的含量。应用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)及速率免疫散射比浊法分别检测脐血及骨髓血清中sIL-2R及IgG水平。CD3+T细胞数在脐血及骨髓中无显著差异(P>0.05)。脐血中CD3+CD45RA+、CD19+、CD19+CD10+及CD3-CD16+CD56-细胞数显著高于骨髓(P<0.05)。脐血中CD3+CD5+、CD3+CD45RO+、CD3+CD25+、CD19+CD40+、CD19+CD23+及CD3-CD16+CD56+细胞数显著低于骨髓(P<0.05)。脐血血清中sIL-2R及IgG水平显著低于骨髓(P<0.05)。脐血中成熟T细胞、成熟B细胞及成熟NK细胞亚群的细胞数显著低于骨髓,这可能是脐血移植后免疫重建延迟、GVHD发生率低及GVL效应低的原因之一。     

bcl-2 expression by multicolor flow cytometric analysis assists in the diagnosis of follicular lymphoma in lymph node and bone marrow

The expression of bcl-2, CD10, and CD20 was examined by multicolor flow cytometry in 78 samples including lymph node or other tissue biopsy specimens containing follicular lymphoma (FL; n = 17), reactive hyperplasia (RH; n = 28), or other malignant lymphomas (n = 20), as well as bone marrow aspirates (n = 13). The presence of CD10+ cells with high bcl-2 expression predicted the presence of FL rather than RH with a positive predictive value of 100% and negative predictive value of 96%. CD10+ cells with high bcl-2 expression also were found in a subset of diffuse large B-cell lymphomas and were otherwise rare in other types of malignant lymphoma. In contrast with immunohistochemical studies, a reduced but apparently measurable level of bcl-2 was present in benign follicular center cells. Hematogones showed lower bcl-2 levels than did FL cells in the bone marrow, and neutrophils were bcl-2-. Measurement of bcl-2 expression levels by multiparameter flow cytometry offers a rapid, quantitative assessment that may assist in the diagnosis of FL in lymph nodes or bone marrow, even when other CD10+ cells or admixed normal B cells are present.     

环孢素A治疗再障和骨髓增生异常综合征T淋巴细胞异常激活的变化

研究再生障碍性贫血(AA)用环孢素A(CsA)治疗前后和骨髓增生异常综合征(MDS)患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞培养前后早期激活标志CD69的表达及其意义。将外周血在PHA20μg/ml条件下进行全血细胞培养,于0h和4h分别用双色免疫荧光标记流式细胞仪对CD4+、CD8+T淋巴细胞CD69的表达进行分析。发现PHA刺激前初治SAA和MDS-RA+MDS-RAS患者CD4+、CD8+细胞CD69的表达率增高,CAA与RAEB+RAEB-T患者CD8+细胞CD69的表达率增高;PHA刺激后AA与MDS患者CD4+、CD8+细胞表达CD69明显增强,AA患者CD4+细胞CD69的表达率高于CD8+细胞。CsA治疗后SAA患者PHA刺激前CD4+、CD8+细胞CD69的表达率较治疗前明显减低,CAA患者CD8+细胞CD69的表达率较治疗前明显减低。治疗后AA患者PHA刺激后CD4+、CD8+细胞CD69的表达率较治疗前明显减低。CsA治疗有效的AA患者治疗前PHA刺激前后CD4+、CD8+细胞CD69的表达率明显增高,治疗后明显减低。初治AA患者PHA刺激前后CD4+细胞CD69的表达率均明显高于MDS患者。说明T细胞早期活化及其活化潜能增强,以及产生针对自身造血干/祖细胞的细胞毒效应在AA和MDS发病中起重要作用,CsA能抑制AA患者T细胞的早期激活。     

黄芪多糖对小鼠骨髓及外周血造血干细胞的增殖及动员作用

探讨APS-P对正常或化疗后小鼠的骨髓、脾及外周血造血干细胞的促增殖及外周动员作用。给正常或经环磷酰胺化疗后的C57BL／6小鼠注射APS-P，然后取骨髓细胞、外周血细胞及脾细胞，并用荧光抗体PerCP-Sca-1，APE-c-kit及PE-Lineage(CD3，CD4，CD8，Trll9，B220 CDllb，Gr-1)进行染色标记，用流式细胞仪检测小鼠造血干细胞(Lin c-kit^ Sca-1^ )数量变化。注射APS-P能使正常及化疗小鼠骨髓、脾及外周血中的造血干细胞有不同程度的增加。这一作用可能是由于APS-P促进骨髓造血干细胞的增殖，而在外周血及脾中的增加则可能是由于APS-P对骨髓造血干细胞的外周动员作用。     

尘螨诱导新生儿脐血单个核细胞ICOS与转录因子表达的研究

为了解尘螨(HDM)抗原对新生儿脐血单个核细胞(CBMC)及成人外周血单个核细胞(PBMC)CD3+ICOS+细胞阳性率、转录因子T-bet、GATA-3、Foxp3 mRNA表达水平以及培养上清中IL-4、IL-10、IFN-γ表达水平的影响。用流式细胞术,检测新生儿CBMC、成人PBMC体外经PHA和/或HDM抗原刺激前、后CD3+ICOS+细胞阳性率;用RT-PCR法检测细胞体外经PHA和/或HDM抗原刺激前、后T-bet、GATA-3以及Foxp3 mRNA表达水平;用ELISA法,检测细胞在体外经PHA和/或HDM刺激前、后培养上清液中IL-4、IL-10、IFN-γ表达水平。结果表明,高剂量HDM抗原显著下调CBMC经PHA刺激后的CD3+ICOS+阳性率(P<0.05),同时也显著上调PHA刺激前其T-bet mRNA表达(P<0.05),而显著下调该类细胞经PHA刺激后的Foxp3 mRNA的表达(P<0.05)。也显著增加其PHA刺激前的IFN-γ分泌(P<0.01),减少其PHA刺激后IL-10分泌(P<0.05)。高剂量HDM抗原对CBMC的作用强于PBMC,可下调CD3+ICOS+阳性率,显著上调PHA刺激前CBMC T-bet mRNA表达,增加PHA刺激前IFN-γ的分泌,减少PHA刺激后IL-10分泌,提示早期接触高剂量HDM抗原对机体免疫功能的影响较强,可促进新生儿Th1样反应,高剂量HDM抗原可能通过作用于下调Foxp3 mRNA的表达而下调CD4+CD25+调节性T细胞的功能。     

Study of T-lymphocyte subsets of healthy and Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis-infected cattle.

The relative contributions of T-lymphocyte subsets to host defense in cattle infected with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis is reported. The subsets were purified with appropriate monoclonal antibodies and a magnetic bead column separation system, and their purity was verified by flow cytometry. Biological activity of each subset, expressed as lymphoproliferation and gamma interferon (IFN-gamma) production, was measured in response to phytohemagglutinin (PHA) and an M. avium antigen preparation (A-PPD). IFN-gamma was measured by antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay. The results showed a correlation between proliferation and IFN-gamma production in response to A-PPD but not to PHA. In response to PHA, CD4+ lymphocytes were the most prolific producers of IFN-gamma. CD8+ lymphocytes produced IFN-gamma to a lesser extent, whereas gammadelta+ T lymphocytes produced little or no IFN-gamma. Differences observed between the amount of IFN-gamma produced by CD4+ versus CD8+ cells and CD4+ versus gammadelta+ cells were significant (P < 0.01), but those between peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and CD4+ T cells were not. Similar responses to A-PPD were observed except that PBMC produced higher levels of IFN-gamma than did CD4+ T cells. These data for cattle are similar to observations made for other animal species, where CD4+ cells are the major type of T lymphocytes producing IFN-gamma. They further suggest that whatever the role gammadelta+ T cells may play in paratuberculosis, it is not likely to be mediated by IFN-gamma production.     

失代偿期乙肝肝硬化患者的骨髓间充质干细胞的免疫调节作用

目的 观察失代偿期乙型肝炎肝硬化患者的骨髓间充质干细胞（BMSCs）对自体外周血淋巴细胞增殖及调节性T细胞（Tregs）亚群的影响.方法 从8例失代偿性肝硬化患者骨髓中分离培养MSCs,采用流式细胞仪分析鉴定MSCs的纯度,分离患者外周血淋巴细胞行羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯（CFDA SE）荧光染色,在植物血凝素（PHA）刺激下,培养基为自体血清,自体外周血淋巴细胞与BMSCs共培养,流式细胞术检测各组淋巴细胞增殖情况及CD4＋ CD25＋ CD127-Tregs频数.结果 流式细胞术显示：接触培养组及非接触培养组的细胞增殖较阳性对照组明显减低（P均＜0.01）,但亦显著高于阴性对照组（P均＜0.01）,其CD4＋ CD25＋ CD127-Tregs频率显著高于阳性及阴性对照组（P均＜0.01）;接触培养组与非接触培养组比较,淋巴细胞增殖及CD4＋ CD25＋ CD127-Tregs频数差异均无统计学意义（P均＞0.05）.结论 肝硬化患者BMSCs可抑制自体外周血淋巴细胞增殖、上调CD4＋ CD25＋ CD127-Tregs表达.     

Gamma interferon production and two-color fluorescence flow cytometry analysis of peripheral blood mononuclear cells in allogeneic bone marrow transplant recipients

Gamma interferon (gamma-INF) production was studied and two-color fluorescence flow cytometry analysis was done on the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in allogeneic bone marrow transplant recipients. Gamma INF was not detected in any patients within a year after transplantation whether PBMC was stimulated with PHA or not. A year after transplantation, gamma-INF was produced in the normal level in the stimulated and unstimulated PBMC. The number of suppressor-inducer T cells (CD4+2H4+) was decreased and that of suppressor T cells (CD11+CD8+) was normal. The numbers of helper-inducer T cells (CD4+4B4+) and helper T cells (CD4+2H4-) were normal. The numbers of activated helper-inducer T cells (CD4+HLA-DR+) and suppressor-cytotoxic T cells (CD8+HLA-DR+) were elevated. In the NK cells, Leu7+ CD16-cells were elevated, whereas Leu7+CD16+ cells and Leu7-CD16+ cells were normal. Leu7+CD8+ cells were elevated. These results indicated immunodeficiency after transplantation.     

Peripheral blood antigen-presenting cells from African-Americans exhibit increased CD80 and CD86 expression.

Despite the increased incidence and severity of many autoimmune diseases and transplant rejection in African-Americans (AA) compared with Caucasians (CS), very few studies have addressed issues of racial variation during antigen presentation. This investigation was performed as a preliminary exploration of differences in peripheral blood cell costimulatory functions between healthy AA (n = 20) and CS (n = 20) subjects. The expression of surface costimulatory molecules on peripheral blood cells, mononuclear cells enriched by Ficoll density centrifugation, and plastic adherent antigen-presenting cells (APC) was determined by flow cytometry using fluorescent-labelled MoAbs. The expression of both B7 costimulatory molecules was significantly higher on the cells from AA subjects compared with cells from CS subjects (CD80, P < 0.05; CD86, P < 0.05). Also, following 18 h of culture with rhIL-1beta, there was a significant increase in the percentage of APC from AA expressing high levels of the costimulatory molecule CD80 (P < 0.05). Costimulatory function during mitogen and antigen presentation was determined by 3H-thymidine incorporation during T cell proliferation. Purified T cells from AA subjects demonstrated significantly increased proliferation to phytohaemagglutinin (PHA). The differences reported here suggest that racial variations in peripheral blood APC characteristics may exist. Given the importance of costimulation in maintaining long-term immune responses, these data suggest a further direction for the investigation of racial disparity in autoimmune disease pathology and transplant rejection rates.