化学诱导剂5-氮杂胞苷及模拟生物微环境对骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响

背景:研究显示干细胞有随环境发生分化即"环境依赖性分化"的特性,但骨髓间充质干细胞在心肌组织是否存在此种特性目前尚未形成公识.目的:观察化学诱导剂和模拟的生物微环境诱导对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响.设计、时间及地点:随机分组设计,细胞学体外对比观察,于2008-01/2009-02在苏州大学心血管内科干细胞移植实验室完成.材料:6～8周龄SD大鼠,用于骨髓间充质干细胞的培养;新生1～3 d同种系SD大鼠,用于心肌细胞的培养.方法:取SD大鼠股骨骨髓,培养至第2代,经流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞纯度97%以上,制成4×108L-1的细胞悬液,实验分为4组:单纯DMEM培养组:用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养;5-氮杂胞苷组:24 h后培养液内加入10 μmol/L的5-氮杂胞苷;心肌细胞裂解液组:将4倍于骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞裂解液加入骨髓间充质干细胞培养瓶中;间接接触组:在培养体系中放入millicell插入式细胞培养皿,28 d收获细胞.主要观察指标:免疫组织化学法检测诱导后骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、CD31的情况;RT-PCR法检测各组早期心肌细胞特异性转录因子GATA4、NKX2.5、β-肌球蛋白重链及α-肌球蛋白重链基因的表达情况.结果:免疫组织化学检测显示实验组诱导4周后特异性抗原呈阳性表达,实验组与单纯DMEM培养组相比,差异有显著性意义(P<0.05);间接接触组较心肌细胞裂解液组阳性细胞数目稍增多,但组间差异无显著性意义(P>0.05);CD31是血管内皮细胞的表面抗原标志,单纯DMEM培养组和5-氮杂胞苷组无表达,其他两组弱阳性表达,组间差异无显著性意义(P>0.05).实验组诱导4周后,均表达心肌前体细胞特异性转录因子NKX-2.5和GATA4,同时表达胚胎期占优势的心肌细胞特异性β-肌球蛋白重链,而没有表达成年期占优势的心肌细胞特异性标志α-肌球蛋白重链.结论:5-氮杂胞苷可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,心肌细胞裂解液和细胞间接接触模拟的心肌微环境也可以诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞,分化的细胞介于成熟的心肌细胞和心肌祖细胞之间的心肌细胞前体.     

H9C2细胞培养液诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

背景：文献报道间充质干细胞经体外化学药物诱导或自体移植体内诱导或模拟心肌样微环境体外诱导等方法可不同程度的诱导心肌细胞分化,但这些方法诱导率低、操作复杂、毒副作用大。 目的：验证心肌细胞株H9C2细胞培养液对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的诱导作用。 方法：运用全骨髓贴壁筛选法分离培养大鼠间充质干细胞,制备 H9C2细胞培养液作为诱导培养液,将间充质干细胞诱导培养1,3,5,7 d;以单独10%F12-DMEM培养液培养的H9C2细胞为阳性对照组;单独10%F12-DMEM培养液培养的间充质干细胞为阴性对照组。用免疫荧光法和western-blot检测其肌钙蛋白T、心肌细胞结蛋白的表达,用实时荧光定量检测其心肌细胞特征性基因α-肌球蛋白重链和β-肌球蛋白重链mRNA的表达。 结果与结论：H9C2细胞培养液诱导间充质干细胞培养7 d,间充质干细胞增殖分化细胞中肌钙蛋白T阳性细胞达（16±7）%,显著高于对照组（P 〈0.05）;与阴性对照组比较,western-blot检测诱导培养间充质干细胞后分化细胞肌钙蛋白T表达明显上调（P〈0.05）,结蛋白表达明显上调（P 〈0.05）;RT-PCR检测分化细胞α-肌球蛋白重链与β-肌球蛋白重链mRNA表达均上调（P 〈0.05）。结果提示H9C2细胞培养液能诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化。     

体外诱导成人脂肪间充质干细胞分化为心肌样细胞

背景:目前对脂肪间充质干细胞在临床应用前还有许多问题需要解决,如脂肪间充质干细胞是否可以分化为完全意义上的心肌细胞,是否具备心肌细胞所特有的功能。如何提高脂肪间充质干细胞向心肌细胞的分化率,如何提高在移植后的归巢和存活率等问题的解决对于指导干细胞的临床应用有重要的意义。目的:观察体外培养并诱导成人脂肪间充质干细胞分化为心肌样细胞。设计:随机对照观察。单位:解放军总医院心内科实验室。材料:脂肪取自解放军总医院普外科腹部手术患者(均知情同意);IMDM(Hyclon公司),Ⅰ型胶原酶(Gibco公司),5-aza(Sigma),抗心肌特异性肌钙蛋白T(TnT)多克隆抗体(福建迈新生物技术公司),抗CD44、抗CD45、抗CD34、HLA2DR、Ⅷ因子单克隆抗体、抗结蛋白(Desmin),抗α-横纹肌肌动蛋白、抗肌球蛋白重链购自北京中杉金桥生物技术有限公司,DAB染色剂由北京中杉金桥生物技术有限公司提供,RT-PCR试剂盒由Invitrogen公司提供,心房利钠肽放免试剂盒(中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所)。方法:实验于2005-03/2006-04在解放军总医院心内科实验室完成。细胞培养:采用消化法和贴壁培养法分离培养脂肪间充质干细胞。干预及检测:对第3代细胞进行细胞表面分子CD44,CD13,CD105,CD45,CD34,HLA-DR,factorⅧ的免疫细胞化学鉴定,并用5-氮杂胞苷(5-aza)进行诱导,于诱导后第7,14,21,28天采用RT-PCR法检测心肌化基因GATA4和Nkx2.5的表达,应用放射免疫法测定心房利钠肽含量。主要观察指标:①细胞表面标志鉴定结果。②心肌化基因GATA4和Nkx2.5的表达。③心房利钠肽含量。结果:①细胞表面标志鉴定:原代细胞CD13、CD44、CD105阳性表达,CD45、CD34、HLA2DR、Ⅷ因子阴性表达。诱导后7d,所有细胞Desmin,α-横纹肌肌动蛋白、抗肌球蛋白重链和抗心肌特异性肌钙蛋白T呈阴性反应,大多数细胞CD44阳性表达。诱导后14d少量细胞出现Desmin、α-横纹肌肌动蛋白和抗肌球蛋白重链抗原阳性表达,TnT阴性表达,部分细胞CD44呈阳性表达。诱导后21d,多数细胞Desmin、α-横纹肌肌动蛋白、抗肌球蛋白重链和抗心肌特异性肌钙蛋白T呈阳性反应,CD44呈阴性表达。②心肌化基因GATA4和Nkx2.5的表达:诱导后14d出现GATA4和Nkx2.5cDNA的表达。③心房利钠肽含量:诱导后14d心房利钠肽含量为(0.022±0.01)ng/L,与诱导后7d比较差异无显著性(P>0.05),诱导后21d和诱导后28d分别为(7.92±0.21)和(8.12±0.50)ng/L,与诱导后7d比较差异均有显著性(P<0.05),但两者之间差异无显著性(P>0.05)。结论:成人脂肪组织中含有间充质干细胞,且可在5-氮杂胞苷诱导21d后分化为心肌样细胞。     

成人脂肪间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的实验研究

目的 体外培养并诱导成人脂肪间充质干细胞（ADMSCs）分化为心肌样细胞，为心肌细胞的替代治疗提供新的来源。方法 采用消化法和贴壁培养法分离培养ADMSCs，对第3代细胞进行免疫化学鉴定和5-氮杂胞苷（5-aza）诱导，于诱导后第7、14、21和28天行免疫化学鉴定．并测定GATA4和Nkx2．5表达和心房利钠肽（ANP）含量。结果 人脂肪中含有梭形细胞，CD44、CD13、CD105阳性表达，而CD45、CD34、HLA-DR、Ⅷ因子阴性表达。诱导后细胞排列方向一致．部分细胞聚集成团；结蛋白、α-横纹肌肌动蛋白、肌球蛋白重链和心肌肌钙蛋白T呈阳性表达。有GATA4和Nkx2．5的表达及心房利钠肽的分泌。结论 成人脂肪组织中含有问充质干细胞，且可在5-氮杂胞苷诱导21d后分化为心肌样细胞。     

脐血问充质干细胞体外定向诱导向心肌样细胞的转化

目的：观察脐血间充质干细胞经5一氮杂胞苷诱导在体外定向分化为心肌样细胞的形态学及分子生物学特征。方法：选取2003-05／2005-04在郧阳医学院附属十堰市太和医院妇产科患者12例，脐血来源者家属及本人知情同意。取脐静脉血50mL，分离并培养骨髓间充质干细胞，用5-氮杂胞苷定向诱导向心肌样细胞分化。每日采用相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征，采用RT-PCR检测心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结果：①形态学变化：5-氮杂胞苷诱导后，约1周出现短棒状或珠状结构。2周排列具有方向性，3周有肌管样结构形成。②超微结构：诱导四五周细胞内含大量线粒体，可见心房颗粒、肌丝形成。③RT-PCR检测：经5-氮杂胞苷诱导四五周骨髓间充质干细胞有心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。且心房利钠肽出现3条阳性带。结论：经5-氮杂胞苷诱导脐血间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞，是细胞移植的优良供体。     

脐血源性间充质干细胞与人心肌细胞共培养条件下对心肌细胞凋亡的抑制

背景:脐带血来源的间充质干细胞有多系分化的潜能,其归巢或植入心脏后能够修复心肌组织,但其移植治疗的安全性,以及在与人心肌细胞共培养情况下,能否抑制人心肌细胞凋亡仍有待观察.目的:观察人脐血间充质干细胞与人心肌细胞共培养条件下对人心肌细胞凋亡的抑制作用,以及移植治疗的安全性.方法:人脐血源性间充质干细胞来源于分娩孕妇脐血,经5-氮杂胞苷处理24 h向心肌细胞诱导分化.分别取体外培养3～5代细胞以及诱导后细胞,检测其端粒酶活性及肿瘤相关基因RNA水平的表达、染色体核型G带分型、细胞表面抗原表达、裸鼠体内成瘤情况、共培养条件下细胞凋亡情况.结果与结论:脐血源性间充质干细胞经5-氮杂胞苷体外诱导能分化成心肌细胞,诱导前后其端粒酶活性及p53,cyclin A,cdk2,β-actin,c-fos,h-TERT,c-myc等肿瘤相关基因的表达均基本相似:均未发现异常染色体核型;免疫表型无明显变化,CD34呈阴性,CD44及CD90(Thy-1)呈阳性.脐血源性间充质干细胞接种裸鼠体内未见肿瘤生长.与单纯心肌细胞比较,共培养情况下脐血间充质干细胞能够显著抑制心肌细胞的凋亡(P<0.05).结果提示人脐血间充质干细胞用于细胞移植治疗安全有效,与心肌细胞共培养时具有明显抑制心肌细胞凋亡的作用.     

植物源性活性因子促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

背景：以往研究已证实,在心肌梗死的大鼠体内,柔毛水杨梅粗提物 EGJ 能有效促进外源性的骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞。课题组进一步分离 EGJ,最终得到植物源性的活性因子 cardiogenin,其是否也能促进间充质干细胞向心肌细胞分化呢？ 目的：分离柔毛水杨梅的活性因子 cardiogenin,并观察其促进骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞的作用。方法：分离并纯化大鼠的骨髓间充质干细胞,分别用柔毛水杨梅醇的粗提物 EGJ 100 mg/L 和 cardiogenin 10 mg/L 来处理间充质干细胞。在处理间充质干细胞的第 3 天和第 7 天用免疫荧光的方法进行心肌分化特异性标记物免疫染色,检测被处理的间充质干细胞是否表达心肌特异性标记物。结果与结论：处理 3 d 后,EGJ 组和 cardiogenin 组有 39%的细胞表达心肌分化早期的特异性标记物 Mef2。第 7 天,EGJ组和 cardiogenin 组有 70%以上的细胞表达心肌细胞的肌球蛋白重链 MHC。结果显示 EGJ 和 cardiogenin 均能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,但 cardiogenin 的用量比 EGJ 少 5~10 倍,诱导分化的效率也略高。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化前后离子通道基因表达的变化

目的：观察体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化前后某些离子通道mRNA表达的变化，以进一步探讨离子通道在骨髓间充质干细胞增殖和向心肌细胞分化中的作用。 方法：实验于2004-12/2005-07在哈尔滨医科大学病理生理学实验室和组织与胚胎学实验室完成。实验选用Wistar大鼠，雌雄不限，体质量100～120g。分离、培养和纯化大鼠骨髓间充质干细胞，以DAP（5mg／L）标记第三代的骨髓间充质干细胞后，采用10μmol／L5-氮胞苷诱导，于诱导后第4周做细胞免疫荧光化学检测细胞肌钙蛋白的表达。采用反转录聚合酶链反应技术检测诱导分化前后钙通道的α1e，α1D，α1G，α1H，α1S亚基；钾通道：ERG，IK1，KvLQT1和钠通道SCN5AtuRNA的表达. 结果：①5-氮胞苷诱导后第4周细胞可见心肌细胞特异性肌钙蛋白的表达。②反转录聚合酶链反应结果显示分化后的细胞表达L-型钙通道的α1c，α1D，T-型钙通道的1G亚基和钾通道：ERG-1，kir2．1，KvLQT-1和钠通道SCN5A mRNA的表达，与成熟心肌细胞相似。③在诱导分化前的骨髓间充质干细胞也发现了L-型钙通道的α1c亚基，ERG-1和KvLQT-1钾通道的表达。 结论：骨髓间充质干细胞可被诱导分化为心肌样细胞，分化后的细胞表达形成动作电位的相关离子通道基因，进一步表明骨髓间充质干细胞可作为心肌细胞移植的种子细胞。实验观察到未分化的骨髓间充质干细胞也有L-型钙通道，ERG-1和KvLQT1钾通道的表达，推测这些离子通道可能在骨髓间充质干细胞的增殖和向心肌细胞分化中具有重要的作用。     

脐带结缔组织多潜能干细胞向内皮及心肌方向的分化

背景：脐带结缔组织富含多潜能干细胞,其免疫原性弱、增殖力强。目的：验证体外培养人类脐带结缔组织（wharton’s jelly）中多潜能干细胞向内皮细胞及心肌细胞方向的诱导分化。方法：贴块法培养人类脐带结缔组织多潜能干细胞。结果与结论：①流式细胞仪进行表型鉴定,多潜能干细胞CD105、CD73、CD90、CD44、CD54阳性,而CD45、CD34、CD106和CD133阴性。②加入血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞诱导后,细胞表现内皮细胞形态,可以吞噬ac-LDL并结合UEA-1。③以5-氮杂胞甘诱导后经免疫组织化学染色显示,心肌细胞标记物肌钙蛋白Ⅰ和β肌球蛋白重链表达阳性。提示在体外培养的条件下,可以从脐带结缔组织中得到大量干细胞,该细胞可以向心肌及内皮方向分化。     

5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：5-氮杂胞苷能诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。目的：以5-氮杂胞苷诱导人脐带间充质干细胞分化为心肌细胞。方法：采用贴壁培养法分离、纯化人脐带间充质干细胞,以5-氮杂胞苷诱导第3代人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞。结果与结论：诱导前人脐带间充质干细胞呈典型的梭形;诱导后一二周细胞体积变大,三四周后相邻细胞间胞膜有接触,逐渐相连呈肌管状,细胞胞质内可见细丝样结构。诱导4周后免疫组织化学鉴定人脐带间充质干细胞cTnI表达阳性,未诱导细胞cTnI表达阴性;诱导组Nkx2.5、GATA4mRNA表达水平较未诱导组显著增加（P〈0.05）。提示5-氮杂胞苷可能通过调控GATA4、Nkx2.5基因的表达促进人脐带间充质干细胞分化为心肌样细胞,并促进其成熟。     

5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:骨髓基质干细胞具有扩增迅速、分化潜能广泛等特点,因此建立骨髓基质干细胞的体外定向诱导模型有利于组织工程学研究.目的:探讨应用5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的可能性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-06/2008-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成.材料:SD大鼠20只,由辽宁医学院实验动物中心提供.5-氮胞苷为Sigma公司产品.方法:大鼠麻醉后,分离股骨和胫骨,全骨髓法+贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,待细胞生长融合至90%后传代扩增.取P3代骨髓基质干细胞,以2×10~4/孔密度接种于24孔培养板,分别加入5,10,15,20 μmol/L 5-氮胞苷诱导培养,同时设立不加诱导剂的空白对照,诱导24 h后更换为正常培养液继续培养至3周.主要观察指标:细胞形态及生长曲线,诱导后细胞形态变化,诱导后细胞连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达.结果:①培养的骨髓基质干细胞大多呈梭形,有时可见细胞融合,P3代细胞接种后第1,2天为静止生长期,从第3天开始进入对数生长期,第9天达高峰,以后进入平台期,第12天细胞数量开始减少.②5 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,骨髓基质干细胞形态无明显变化;10 μmol/L 5-氮胞苷诱导后骨髓基质干细胞变长,宽大,并朝一个方向延伸,具有肌管形成细胞的形态特点;15 μmol/L 5-氮胞苷诱导后,24孔板周边区有少量细胞存活;20 μmol/L 5-氮胞苷诱导后细胞死亡.③经10 μmol/L5-氮胞苷诱导3周后.骨髓基质干细胞胞浆内可见连接蛋白43和α-横纹肌肌动蛋白的表达;空白对照组均呈阴性表达.结论:骨髓基质干细胞自身无法向心肌细胞方向转化,体外经5-氮胞苷诱导后具有向心肌细胞分化的潜能.5-氮胞苷浓度过低不能起到诱导分化作用,浓度过高则会造成细胞大量死亡,10 μmol/L为较适宜的诱导浓度.     

共培养条件下人脐血间充质干细胞抑制心肌细胞凋亡:是否安全有效?(英文)

背景:脐血间充质干细胞归巢或植入心脏后能够修复心肌组织,但其移植治疗的安全性尚有待分析.目的:观察共培养情况下人脐血间充质干细胞能否抑制人心肌细胞凋亡,以及人脐血间充质干细胞移植治疗的安全性.方法:人脐血间充质干细胞来源于分娩孕妇脐血,经5-氮杂胞苷处理24 h向心肌细胞诱导分化.分别取体外培养3～5代细胞以及诱导后细胞,检测其端粒酶活性及肿瘤相关基因的表达、染色体核型G带分型、细胞表面抗原表达、裸鼠体内成瘤情况、共培养条件下细胞凋亡情况.结果与结论:脐血间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导前后,其端粒酶活性及p53,cyclin A,cdk2,β-actin,C-fos,h-TERT,c-myc等肿瘤相关基因的表达均基本相似;均未发现异常染色体核型;免疫表型无明显变化,CD34呈阴性,CD44及CD90(Thy-1)呈阳性.脐血间充质干细胞接种10周后裸鼠仍健康存活,体内未见肿瘤生长,石蜡切片苏木精-伊红染色显示为正常的皮下组织.与单纯心肌细胞比较,共培养情况下脐血间充质干细胞能够显著抑制心肌细胞的凋亡(P < 0.05),提示人脐血间充质干细胞用于细胞移植治疗安全有效.     

Human cord blood CD133+ cells immunoselected by a clinical-grade apparatus differentiate in vitro into endothelial- and cardiomyocyte-like cells

BACKGROUND: Recent findings on human hematopoietic stem cell (HSC) properties suggest a possible therapeutic role of human umbilical cord blood (UCB) HSC-based cellular therapies in the treatment of myocardial infarction. STUDY DESIGN AND METHODS: Nine UCB units were subjected to sequential red cell removal, freezing, and postthawing CD133+ HSC immunoselection by a clinical-grade, CE-approved, magnetic apparatus and microbead-coated anti-CD133 monoclonal antibody. Selected UCB CD133+ cells were cultured in vitro in medium supporting either endothelial or cardiomyocytic differentiation in parallel experiments. RESULTS: Immunoselection allowed recovery of 79 percent of initial CD133+ cells with a CD133+ cell purity of 81 percent, on average. Parallel cultures showed the appearance of endothelial markers (VE-cadherin, CD146, and KDR and bright expression of CD105), morphofunctional features of endothelium in endothelial-supporting cultures, of cardiac muscle proteins (troponin I and myosin ventricular heavy chain alpha/beta; MYHC) and specific gene expression (GATA4, NKX2.5, troponin I, and MYHC) in cardiomyocyte-oriented cultures. CONCLUSIONS: The appearance of both endothelial- and cardiomyocyte-like cells from parallel cultures of frozen-thawed-immunoselected UCB CD133+ cells by a clinical-grade method and previously reported data on lack of major signs of rejection of these cells in immunocompetent rats subjected to experimental liver damage suggest a possible role of these allogeneic HSCs in cell therapies designed for regenerative treatments of ischemic diseases of human myocardium.     

丁酸钠诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

背景:组蛋白乙酰化是诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的机制之一。目的:观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对体外培养的骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响,并分析其诱导分化的机制。方法:分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行鉴定。取第2代骨髓间充质干细胞,应用1mmol/L丁酸钠诱导其向心肌样细胞分化。结果与结论:实验分离培养的骨髓间充质干细胞高表达CD90,CD29;低表达CD45,CD31。加入丁酸钠后细胞增殖能力及组蛋白去乙酰化酶活性明显降低,但未发生明显凋亡现象,表明丁酸钠具有低毒性的特征。real-timePCR检测显示,经丁酸钠诱导后细胞GATA-4,MEF-2c,β-MHC等心肌细胞早期标志基因表达率明显增高(P<0.05)。Westernblot检测发现,经丁酸钠诱导后细胞心肌细胞特异性蛋白连接蛋白43和肌钙蛋白T的表达明显增高。免疫荧光测得的肌钙蛋白T表达结果与Westernblot一致。说明丁酸钠能够有效诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,其机制可能与抑制组蛋白去乙酰化酶活性,增强组蛋白的乙酰化有关。     

中药单体黄芩苷体外诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:抗氧化剂法及细胞因子法是体外诱导脐血间充质干细胞定向分化为神经元的2种方法,怎样选择既可广泛保护神经,又具有较强抗氧化作用的诱导剂?通过广泛筛选,应用中药下预脐血间充质干细胞的体外纯化、扩增并向神经元细胞分化.目的:观察中药单体黄芩苷对人脐血间充质干细胞体外纯化、扩增及向神经元样细胞诱导分化的作用.设计,时间,地点:随机对照,细胞学体外观察,于2005-02/06在南昌大学第一附属医院神经内科实验窒完成.材料:年龄为23～35岁的健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份;黄芩苷,纯度＞95%,由中南大学湘雅医学院药剂科提供:抗氧化添加剂β-巯基乙醇为SABC公司产品.方法:采集胎儿脐带血,肝素抗凝,分离出脐血单个核细胞,调整细胞浓度为1×109L-1,以含体积分数为20%胎牛血清、谷氨酰胺、B27、粒巨噬细胞集落刺激因子、干细胞因子的DMEM液体培养基进行纯化和扩增.按照抗氧化添加剂的不同分为4组:黄芩苷组加入黄芩苷:空白对照组不添加抗氧化剂;β-巯基乙醇组添加β-巯基乙醇;共培养组添加黄芩苷、β-巯基乙醇.连续培养4周.主要观察指标:①脐血冷冻保存后7,14,21,28dCD34及CD29阳性细胞的表达.②细胞形态学观察.③流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志.④免疫细胞化学染色观察间充质干细胞扩增培养4周后神经细胞特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的表达.结果:①与冻存前相比,冻存后7,14,21,28 d脐血单个核细胞锥虫蓝拒染率均明显降低(P＜0.05).②细胞形态学观察:脐血单个核细胞培养第2-3天开始贴壁生长,2周左右达高峰,3周后细胞生长达80%～90%融合,此时脐血原始间充质干细胞呈较均一的长梭形.4周后,黄芩苷组原来呈梭形的胞体一部分发生收缩,细胞边缘出现细的突起;一部分胞体逐渐近似圆形、锥形、三角形,伪足有多个细长突起.β-巯基乙醇组、共培养组有少量细胞存在脱落、死亡现象,且随着培养时间延长呈逐渐增加的趋势.⑧培养4周后,空白对照组以CD45阳性细胞为主;其余3组均以CD29和CD83阳性细胞为主,其中共培养组最多,黄芩苷组次之,β-巯基乙醇组最少,组间两两比较差异具有显著性意义(P＜0.01);各组贴壁生长细胞中均未见CD34阳性细胞.④扩增培养4周后与黄芩苷组比较,空白对照组、β-巯基乙醇组神经细胞特异性烯醇化酶及神经微管相关蛋白2阳性细胞表达率均显著降低(P＜0.01).各组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率均低于1%.结论:100 μ mol/L黄芩苷可促进脐血间充质下细胞体外扩增,且随抗氧化作用时间的延长效果显著增强,同时在一定程度上还能够诱导其向神经元样细胞方向分化.     

心肌梗死大鼠血清对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

背景:骨髓间充质干细胞的分化与微环境密切相关,心肌梗死后,心肌细胞发生坏死,补体活化,自由基产生,分泌各种细胞因子,患者的血清成分也发生改变,这些改变究竟对骨髓间质干细胞向心肌细胞分化存存怎样的影响?目的:观察急性心肌梗死大鼠血清在体外对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的作用.设计、时间及地点:对比观察体外细胞学实验,于2005-09/2006-06在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成.材料:体质量50～80g三四周龄SD大鼠用于骨髓间质干细胞分离培养;体质量200～300 g 6～8周龄SD大鼠用于制作急性心肌梗死大鼠模型.方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.结扎左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死大鼠模型,并抽取正常大鼠与模型大鼠血清备用.取第3代骨髓间充质干细胞分6组培养:未诱导组、5-氮胞苷诱导组、5-氮胞苷+心肌梗死模型大鼠血清诱导组、5-氮胞苷+正常大鼠血清诱导组、心肌梗死模型大鼠血清诱导组、正常大鼠血清诱导组.主要观察指标:大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后的形态学变化.大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后心肌肌钙蛋白的表达情况.大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后GATA-4和结蛋白mRNA表达水平.结果:大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷联合血清诱导后.部分细胞渐伸长、变细,胞体中央形成球形,二三周后可见细胞呈球形、棒状,邻近细胞之间形成连接,镜下可见部分分化的细胞旱节律性跳动,晕心肌样细胞改变,其心肌肌钙蛋白、GATA-4、结蛋白表达阳性.对照组和单纯血清诱导组骨髓间充质干细胞未见形态改变.其心肌肌钙蛋白为阴性,GATA-4、结蛋白呈弱阳性.结论:单纯使用心肌梗死大鼠血清不能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,但心肌梗死血清能促进5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并促进分化的心肌细胞成熟.     

改良法体外培养脐带血间充质干细胞及其生物学特性分析析☆

背景:目前报道的脐带血间充质干细胞分离成功率较低,且缺乏较为统一的鉴定方法.目的:对传统的体外分离培养脐带血问充质干细胞方法加以改良,以提高细胞培养成功率,并进行生物学特性观察.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-04/2007-01在上海交通大学医学院附属第九人民医院完成.材料:取自足月健康顺产新生儿的脐带血标本28份,由上海市红房子医院产科提供,经产妇和家属同意.方法:无菌条件下取新牛儿脐带血,以密度梯度离心法分离单个核细胞,以含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基进行体外培养,原代培养5～7 d后半量换液,后每隔三四天全量换液一次.待细胞贴壁后,按处理方法不同分为2组:改良1组当皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的皿中培养:改良2组待皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时,将培养基换为含体积分数为15%小牛血清的α-MEM培养液,当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基.取第5代脐带血间充质干细胞,进行体外成骨及成脂诱导.主要观察指标:显微镜下观察脐带血间充质干细胞的形态,流式细胞仪测定细胞免疫表型,碱性磷酸酶染色及油红染色检测绌胞诱导分化能力.结果:28份脐带血中20份培养出贴壁细胞(改良1组6份/10份,改良2组14份/18份),其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞(改良1组4份,改良2组9份),成功率为46.4%,可传至22代且形态无变化,强烈表达CD105、CD29等问充质干细胞表面标志,而CD34、CD45和CD106等呈阴性表达.在特定诱导条件下,脐带血间充质干细胞可分化为成骨细胞和脂肪细胞.结论:脐带血中存在问充质干细胞,具有多向分化潜能,且易于体外扩增、传代稳定,体外培养方法经改良后可提高脐带血间充质干细胞的培养成功率.     

Mesenchymal stem cells from rat olfactory bulbs can differentiate into cells with cardiomyocyte characteristics

Mesenchymal stromal/stem cells (MSCs) are widely distributed in different tissues such as bone marrow, adipose tissues, peripheral blood, umbilical cord and amnionic fluid. Recently, MSC‐like cells were also found to exist in rat olfactory bulb and are capable of inducing differentiation into mesenchymal lineages – osteocytes, chondrocytes and adipocytes. However, whether these cells can differentiate into myocardial cells is not known. In this study, we examined whether olfactory bulb‐derived MSCs could differentiate into myocardial cells in vitro. Fibroblast‐like cells isolated from the olfactory bulb of neonatal rats were grown under four conditions: no treatment; in the presence of growth factors (neuregulin‐1, bFGF and forskolin); co‐cultured with cardiomyocytes; and co‐cultured with cardiomyocytes plus neuregulin‐1, bFGF and forskolin. Cell differentiation into myocardial cells was monitored by RT–PCR, light microscopy immunofluorescence, western blot analysis and contractile response to pharmacological treatments. The isolated olfactory bulb‐derived fibroblast‐like cells expressed CD29, CD44, CD90, CD105, CD166 but not CD34 and CD45, consistent with the characteristics of MSCs. Long cylindical cells that spontaneously contracted were only observed following 7 days of co‐culture of MSCs with rat cardiomyocytes plus neuregulin‐1, bFGF and forskolin. RT–PCR and western blot analysis indicated that the cylindrical cells expressed myocardial markers, such as Nkx2.5, GATA4, sarcomeric α‐actinin, cardiac troponin I, cardiac myosin heavy chain, atrial natriuretic peptide and connexin 43. They also contained sarcomeres and gap junction and were sensitive to pharmacological treatments (adrenal and cholinergic agonists and antagonists). These findings indicate that rat olfactory bulb‐derived fibroblast‐like cells with MSC characteristics can differentiate into myocardial‐like cells. Copyright © 2013 John Wiley & Sons, Ltd.