人类错配修复基因hMLH1和hMSH2错义突变真核表达载体的构建及表达

目的 构建人类错配修复基因hMLH1和hMSH2错义突变真核表达载体并检测它们在瞬时转染细胞中的蛋白表达.方法 重组pcDNA3.1-hMLH1-wt和pcDNA3.1-hMSH2-wt质粒为模板,用定点诱变的方法分别构建hMLH1基因和hMSH2基因错义突变真核表达载体,将诱变前后的重组质粒瞬时转染至HCT-116细胞(hMLh1基因缺陷型)或LoVo细胞(hMSH2基因缺陷型)中,免疫印迹法和免疫荧光法分别检测这两种基因在各自的转染细胞中的蛋白表达.结果 测序证实,定点突变成功,构建出hMLH1基因错义突变pcDNA3.1-hMLH1-T117M和pcDNA3.1-hMLH1-V384D真核表达载体以及hMSH2基因错义突变pcDNA3.1-hMSH2-L390F、pcDNA3.1-hMSH2-Q419K和pcDNA3.1-hMSH2-Q629R真核表达载体.结果 表明转染后,除hMLH1-T117M突变体蛋白表达缺失外,其余的野生型及突变型真核表达载体在转染细胞中均能表达相应的蛋白.结论 成功构建了在人的肿瘤细胞系中能有效表达的两种hMLH1基因错义突变和三种hMSH2基因错义突变的真核表达载体,为进一步研究这些错义突变的病因学作用和功能意义奠定了实验基础.     

人载脂蛋白M野生型和突变型表达载体的构建及鉴定

目的: 构建人载脂蛋白M (APoM)野生型和突变型原核表达载体PGEX-KG-APoM及真核表达载体PcDNA3.1(+)-APoM。方法: Trizol法抽提HePG2细胞总RNA,RT-PCR扩增APoM全长基因,将基因片断重组到PMD18-T质粒中构建PMD18-T-APoM重组质粒载体,转化到大肠埃希菌JM109后筛选阳性克隆,提取质粒酶切和测序鉴定。采用Sited-directedMutagenesis定点诱变试剂盒对APoM基因进行体外定点诱变,DNA测序鉴定定点诱变成功与否。用双酶切方法分别将APoM野生型和突变型基因定向连接到原核表达载体PGEX-KG和真核表达载体PcDNA3.1(+)中,构建野生型和突变型PGEX-KGAPoM重组体和PcDNA3.1(+)-APoM重组体,分别转化到大肠埃希菌DH5α内,提取质粒酶切鉴定和测序鉴定。结果: 成功克隆了APoM并构建了野生型和突变型原核表达载体和真核表达载体。结论: 通过RT-PCR,定点诱变及基因重组技术成功构建野生型和突变型重组表达质粒PGEX-KG-APoM和PcDNA3.1(+)-APoM,为进一步研究APoM的功能奠定了基础。     

肾上腺脑白质营养不良蛋白慢病毒载体的构建和表达

目的 构建并表达野生型及突变型肾上腺脑白质营养不良蛋白（adrenoleukodystrophy protein,ALDP）的慢病毒载体,探讨ABCD1基因突变对ALDP结构和功能的影响。方法 选择ABCD1基因的H283R和P534R两个突变,首先采用生物信息学方法,进行突变致病性及突变体结构稳定性预测;再利用分子克隆技术,将ABCD1基因克隆到pLEX-MCS慢病毒载体,构建野生型慢病毒载体：pLEX-ABCD1,定点诱变构建2个突变型重组载体：pLEX-ABCD1-H283R和pLEX-ABCD1-P534R,并与其他包装载体共转染293T细胞包装病毒。收集病毒并感染宿主细胞,RT-PCR检测慢病毒感染细胞中野生型与突变型ABCD1 mRNA表达,免疫荧光及蛋白质免疫印迹法分析野生型与突变型ALDP亚细胞定位及表达。结果 生物信息学预测显示H283R和P534R为ALD致病性突变;RT-PCR结果显示慢病毒感染细胞中野生型与突变型ABCD1 mRNA均过表达;免疫荧光及蛋白质免疫印迹结果表明,H283R和P534R突变可能导致ALDP突变体表达量下降,但未观察到ALDP定位改变。结论 成功构建ABCD1基因慢病毒表达载体,并评估了H283R和P534R突变对ALDP表达及亚细胞定位的影响,为深入研究ALD发病机制提供了实验依据。     

定点诱变HBcAg质粒在人永生化B淋巴母细胞系中的稳定表达

目的:构建携带V60, G87, L97突变位点的HBV全基因组真核细胞表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系(LCL),建立相同HLA背景下的慢性HBV感染CTL应答的刺激细胞和靶细胞.方法:用定点突变技术在HBVp3.8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60, G87, L97位置进行突变(p3.8Ⅱ- V60, G87, L97),转化E. coli XL1-Blue感受态细胞扩增筛选,用限制性内切酶SacⅠ和KpnⅠ分别将野生型和突变型p3.8Ⅱ质粒进行双酶切, 插入EBO-plpp真核细胞表达载体,转染LCL,潮霉素稳定筛选后,鉴定目的基因在转染细胞是能够稳定表达.结果:DNA序列分析表明,野型HBV DNA核心区第60, 87, 97位氨基酸发生了预期的突变,Western Blot和微粒子免疫荧光法证明,转染的LCL能稳定表达HBV 抗原.结论:定点诱变HBcAg质粒在人永生化B淋巴母细胞系中可稳定表达.     

颗粒状角膜营养不良一家系的BIGH3基因突变研究

 【摘要】 目的 对一颗粒状角膜营养不良家系进行分子遗传学分析, 探讨BIGH3基因突变的类型。方法 收集一颗粒状角膜营养不良家系中2名患者和1名家系中正常成员的外周血5ml,提取白细胞DNA,利用合成的BIGH3基因第4、11和12外显子的特异性引物, 进行聚合酶链反应 (PCR)扩增, 并对PCR产物直接DNA测序分析。结果 该家系患者成员的BIGH3基因第4外显子存在CGC>CAC (R124H) 突变杂合子, 家系表现正常成员无此基因位点突变。结论 该颗粒状角膜营养不良家系存在BIGH3基因突变, 为R124H杂合突变类型,确诊为Avellino角膜营养不良。     

CD2AP突变对肾小球足细胞骨架蛋白F-actin 分布的影响

目的 构建突变型CD2相关蛋白(CD2AP)荧光表达载体并转染肾小球足细胞,观察细胞内骨架蛋白F-actin分布的变化.方法 定点诱变真核表达质粒pcDNA6-V5-CD2AP致CD2AP第2外显子160G＞A杂合突变,测序鉴定.利用野生型和突变型质粒和pEGFP-C1荧光表达载体,分别构建野生型和突变型重组质粒pEGFP-C1-CD2AP荧光表达载体并转染小鼠肾小球足细胞,荧光显微镜观察处于不同细胞周期的足细胞内F-actin分布情况.结果 测序结果显示,pcDNA6-V5-CD2AP真核表达载体CD2AP的2号外显子第160位碱基G诱变为A,而其他碱基未发生改变.在细胞分裂间期,未转染足细胞内F-actin平行排列成纤维束;野生型重组质粒转染足细胞内F-actin在细胞核周围呈点、块状浓聚;而突变型重组质粒转染足细胞内F-actin主要在细胞膜上勾出轮廓.在细胞分裂中期,野生型重组质粒转染足细胞内F-acin纤维丝呈粗纤维状,环细胞浓聚;突变型重组质粒转染足细胞则仅见胞质内F-acin纤维丝增多,部分区域浓聚.结论 成功构建野生型和突变型重组CD2AP荧光表达载体.CD2AP基因160G＞A杂合突变使肾小球足细胞分裂间期和分裂中期的F-actin纤维骨架发生改变.     

CD2AP突变对肾小球足细胞骨架蛋白F-actin分布的影响

目的 构建突变型CD2相关蛋白（CD2AP）荧光表达载体并转染肾小球足细胞,观察细胞内骨架蛋白F-actin分布的变化.方法 定点诱变真核表达质粒pcDNA6-V5-CD2AP致CD2AP第2外显子160G＞A杂合突变,测序鉴定.利用野生型和突变型质粒和pEGFP-C1荧光表达载体,分别构建野生型和突变型重组质粒pEGFP-C1-CD2AP荧光表达载体并转染小鼠肾小球足细胞,荧光显微镜观察处于不同细胞周期的足细胞内F-actin分布情况.结果 测序结果显示,pcDNA6-V5-CD2AP真核表达载体CD2AP的2号外显子第160位碱基G诱变为A,而其他碱基未发生改变.在细胞分裂间期,未转染足细胞内F-actin平行排列成纤维束;野生型重组质粒转染足细胞内F-actin在细胞核周围呈点、块状浓聚;而突变型重组质粒转染足细胞内F-actin主要在细胞膜上勾出轮廓.在细胞分裂中期,野生型重组质粒转染足细胞内F-acin纤维丝呈粗纤维状,环细胞浓聚;突变型重组质粒转染足细胞则仅见胞质内F-acin纤维丝增多,部分区域浓聚.结论 成功构建野生型和突变型重组CD2AP荧光表达载体.CD2AP基因160G＞A杂合突变使肾小球足细胞分裂间期和分裂中期的F-actin纤维骨架发生改变.     

BIGH3R555w突变转基因小鼠模型的建立

目的建立BIGH3R555w突变转基因角膜营养不良小鼠模型。方法构建以磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceratekinase,PGK）为启动子的BIGH3（M）-IRES-EGFP重组质粒载体,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒注射入C57小鼠受精卵中,胚胎移植入假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT—PCR及Western印迹法检测BIGH3基因表达。结果8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎84枚,出生35只子代鼠,经PCR检测得到4只转基因阳性小鼠。RT—PCR和Westem印迹法检测结果显示,BIGH3R555w在转基因小鼠角膜表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因B1GH3555w突变体在小鼠基因组中整合,成功建立了BIGH3突变转基因小鼠模型,该模型可为今后进一步研究角膜营养不良疾病的发病机制提供依据。     

野生型及c.454C＞T突变型人血管内皮生长因子A基因重组真核表达载体的体外表达

目的:探讨野生型和c.454C＞T突变型人血管内皮生长因子A(VEGFA)基因重组真核表达载体(pEGFP-VEGFA)体外表达有无差异.方法:用脂质体法将野生型和突变型pEGFP-VEGFA转染人胚胎肾细胞(HEK293T),采用荧光显微镜观察重组载体VEGFA和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白的表达,以实时荧光定量PCR法检测VEGFA mRNA的表达.结果:在经转染的HEK293T细胞内观察到绿色荧光,转染后48 h突变型pEGFP-VEGFA转染组荧光强度低于野生型pEGFP-VEGFA转染组.突变型pEGFP-VEGFA转染组VEGFA mRNA表达明显低于野生型pEGFP-VEGFA转染组(P＜0.01).结论:在HEK293T细胞中,初步表明VEGFA突变体导致VEGFA mRNA和蛋白的表达水平均下调,为进一步研究VEGFA c.454C＞T突变体在先天性左心室流出道病变发生中的作用奠定了基础.     

胃肠道间质瘤中C-kit原癌基因突变体的构建及功能研究

目的:构建含突变C-kit基因cDNA的真核表达质粒并行进一步的功能分析.方法:用RT-PCR方法从人胎脑组织克隆野生型C-kit基因蛋白编码区cDNA.根据胃肠道间质瘤中检测出的C-kit基因突变序列,体外突变野生型C-kit cDNA得到突变型C-kit cDNA,与pcDNA3重组成真核表达质粒,并用脂质体法稳定转染人胚胎肾细胞(human embryonic kidney cell,HEK)293细胞系,G418加压筛选出阳性克隆;用Western印迹法检测转染细胞KIT蛋白表达,绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测转染HEK 细胞后细胞周期改变,并观察稳定转染突变型重组质粒人胚肾细胞在裸鼠内的成瘤性.分别设转染pcDNA3空白质粒和野生型的C-kit cDNA真核表达质粒的HEK细胞做为对照.结果:构建了突变型C-kit cDNA与pcDNA3的真核表达质粒; 功能检测分析表明:细胞生长曲线显示与对照组相比,实验组的生长速度明显增快;MTT比色显示,与对照组相比实验组细胞增殖活性显著增强;细胞周期检测结果显示,处于增殖期细胞(S G2-M)比例显著高于对照组;体内结果显示转染突变型C-kit基因的HEK细胞在裸鼠体内成瘤.结论:C-kit原癌基因突变体可促使人类细胞生长加快,增殖活性明显增强,并可以使更多的细胞由静止期进入增殖期, 并可使人胚胎肾细胞发生恶性转化,提示C-kit基因突变有可能是引起胃肠道间质瘤恶性转化的关键机制之一.     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …