C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎冷冻保种技术研究

目的 建立C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎的冷冻保种技术.方法 通过直接收集体内发育的2-细胞胚或者通过体外受精方法获得2-细胞胚,采用玻璃化冷冻法冷冻、复苏、移植,后代经PCR检测.结果 体内发育至2细胞期胚胎90枚,解冻后的平均复苏率是67.78％,移植产仔率是21.31％,后代的阳性率是23.08％;体外受精的2细胞期胚胎203枚,解冻复苏60枚,平均复苏率是63.33％,移植产仔率是15.78％,后代的阳性率是33.33％.结论 两种胚胎冷冻途径均获得了C57-ras癌症转基因动物模型阳性小鼠,建立了该模型动物的低温保存方法.     

绿色荧光蛋白转基因小鼠模型的建立及胚胎冷冻保种

目的建立绿色荧光蛋白转基因小鼠模型，并采取胚胎冷冻的方法进行保种。方法通过原核显微注射法，把线性化、纯化后的外源基因pEGFP注射入BDF1小鼠受精卵中，胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠，获得子代小鼠。经鉴定对有表达的转基因鼠进行胚胎冷冻保种。结果移植注射胚胎385枚给30只假孕小鼠共出生了306只后代鼠，经PCR和southern blot检测得到5只阳性小鼠。F2代转基因鼠胚胎冷冻240枚胚胎。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP在小鼠基因组中得到整合，建立了转pEGFP的转基因小鼠模型。     

HBV—C转基因小鼠快速胚胎冷冻方法的建立

目的 建立用于转基因小鼠种质保存的快速胚胎冷冻方法。方法 用乙二醇作为抗冻保护剂,对携带HBV—C基因的转基因小鼠模型进行了玻璃化胚胎冷冻保存的研究。结果 发现含体积分数30％乙二醇的冷冻液可达到最佳的冷冻效果,有81．54％的冷冻胚胎在体外可进一步发育,其中69．81％达到孵化阶段,比较不同发育阶段的胚胎的冷冻效果发现,致密桑椹胚解冻后的孵化率显著高于囊胚。不同的装管方法对胚胎的回改率也有影响,五段法的胚胎回收率显著高于二段法。将解冻后形态正常的胚胎82枚移植给8只假孕母鼠,5只怀孕,怀孕率为62．5％,产下28只小鼠,产仔率为54．9％。结论 一步法玻璃化冷冻方法可用于转基因小鼠的种质保存。     

C57-ras癌症转基因小鼠模型冷冻保种技术研究

目的 建立C57-ras癌症转基因小鼠模型的冷冻保种技术。 方法 通过直接收集体内发育的2-细胞胚或者通过体外受精方法获得2-细胞胚,采用玻璃化冷冻法冷冻、复苏、移植,后代经PCR检测。结果 冷冻体内发育至2细胞期胚胎90枚,解冻后的复苏率是67.78%?.08,移植产仔率是21.31%?.09,后代的阳性率是23.08%?.14;冷冻体外受精的2细胞期胚胎203枚,解冻复苏60枚,复苏率是63.33%?.03,移植产仔率是15.56%?.04,后代的阳性率是33.33%。 结论 两种胚胎冷冻途径均获得了C57-ras癌症转基因动物模型阳性小鼠,建立了该模型动物的低温保存方法。     

胚胎冷冻技术应用于抗菌肽转基因小鼠的保种传代

目的研究胚胎冷冻在抗菌肽转基因FVB小鼠保种传代中的应用。方法对6~8周正常雌性FVB小鼠进行超排分别与雄性杂合子抗菌肽转基因FVB小鼠交配，收集2-cell胚胎，进行胚胎冷冻。1周后进行胚胎复苏移植，通过PCR方法对仔代鉴定。结果冻存胚胎140枚，复苏获得存活胚胎98枚，移植85枚，产仔38只，获得阳性后代12只。结论通过胚胎冷冻技术保种及复苏移植技术可对抗菌肽转基因小鼠进行传代。     

胚胎发育期和冷冻保护剂剂量对Nakagata小鼠胚胎冷冻效果的影响

目的利用不同剂量的冷冻保护剂,对ICR和Km小鼠不同发育期的胚胎进行冷冻和解冻实验。探讨Nakagata小鼠胚胎玻璃化冷冻管方法,使用不同剂量的冷冻保护剂等因素对冷冻效果的影响。方法2细胞期胚胎在KSOM微滴培养液内分别培养到2细胞4、细胞和8细胞期胚胎,分别加入50μL,100μL,200μL的DAP213冷冻保护剂,利用Nakagata方法冷冻,解冻以及观测解冻后培养至囊胚期胚胎的冷冻效果。结果冷冻保护剂DAP213剂量和ICR,KM小鼠胚胎不同细胞发育期对冷冻效果具有显著的交互影响(P<0.01)。相对而言,冷冻保护剂剂量对结果的影响(P>0.05)低于胚胎细胞发育期对冷冻效果的影响(P<0.01)。结论冷冻保护剂的剂量和胚胎细胞发育期均会影响冷冻实验的结果。胚胎的细胞发育期对冷冻效果的影响更大。对2细胞期,4细胞期和8细胞期的胚胎进行冷冻。8细胞期胚胎的冷冻效果最好,4细胞期胚胎冷冻效果最差。利用Nakagata冷冻管方法建立小鼠胚胎冷冻库,100μL冷冻保护剂效果较好。不同小鼠的品系也可影响冷冻结果。     

The labeling of C57BL/6j derived embryonic stem cells with enhanced green fluorescent protein

Objective To labele MESPU35,a embryonic stem(ES)cell line derived from C57BL/6j mouse,with enhanced green fluorescent protein(EGFP)for further application.Methods The EGFP gene was controlled by the hybrid CA promoter/enhancer (CMV enhancer/chicken beta-actin promoter/beta-actin intron)to construct the vector of the transgene,pCA-EGFP.The vector was transfected into MESPU35 by electroporation.Results We generated EGFP expressing ES cells demonstrating normal properties.The green fluorescence of EGFP expressing cells was maintained in propagation of the ES cells for more than 30 passages as well as in differentiated cells.Cultured in suspension,the“green”ES cells aggregated,and formed embryoid bodies maintaining the green fluorescence at varying developmental stages.The“green” embryoid bodies could expand and differentiate into various types of cells,exhibiting ubiquitous green fluorescence.Concluslons The hybrid CA promoter/enhancer used to control the EGFP expressing ES cells,resulted in more intense and ubiquitous activity.The EGFP transfected cells yield bright green fluorescence,which can be visualized in real time and in situ.In addition,the ES cells,MESPU35,are derived from C57BL/6j mice,which are the most widely used in oncology,physiology and genetics.Compared to 129 substrains.C57BL/6j mice avoid a number of potential problems apparent in the other strains.     

采用CRISPR/Cas9技术构建新品系HBeAg转基因小鼠

目的培育一种HBeAg转基因小鼠新品系。方法克隆乙型肝炎病毒HBeAg基因;采用CRISPR/Cas9技术,通过同源重 组的方式分别在Rosa26基因位点定点插入pliver-HBeAg表达框,获得含有HBeAg基因的表达载体pliver-HBeAg,经酶切得到 含有HBeAg基因的线性DNA 片段,将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,再将其移植 入C57BL/6J雌性代孕小鼠子宫,获得F0代建系小鼠;采用长片段PCR对出生小鼠进行鉴定,共获得HBeAg基因正确同源重组 的F0代建系小鼠;F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配,繁育获得F1代小鼠,经PCR鉴定及测序确认阳性F1代小鼠;将 携带HBeAg基因的F1代转基因小鼠再次回交,对子代小鼠进行PCR基因型鉴定,直至获得纯合子子代转基因小鼠;采用全自 动化学发光免疫分析仪、胶体金法和免疫组织化学方法分别检测HBeAg转基因鼠血浆和肝组织中HBeAg和HBeAb的表达。 结果采用CRISPR/Cas9技术共获得56只F0代小鼠,其中2只为正确同源重组的F0代小鼠;F1代小鼠中6只阳性F1代小鼠。 截至目前,共获得22只F2代纯合子和29只杂合子HBeAg转基因小鼠。所有HBeAg转基因小鼠外周血中均可检出高浓度的 HBeAg蛋白,但未检出HBeAb的表达。而且免疫组化结果显示HBeAg转基因小鼠肝脏肝细胞中可特异性表达HBeAg蛋白。 结论采用CRISPR/Cas9技术成功构建了能在肝脏肝细胞中稳定表达HBeAg蛋白且对HBeAg免疫耐受的新品系HBeAg转基 因小鼠,为HBV的研究提供了新的实验动物模型。     

胚胎冷冻复苏移植技术的临床应用

目的:探讨冻融胚胎移植技术在治疗不育症患者的效果及影响因素.方法:采用慢速冷冻快速解冻的方法.结果:对51例患者进行60个周期的治疗,20例临床妊娠,妊娠率为33.3%,其中自然周期移植妊娠率为31.0%,激素替代周期移植妊娠率为35.5%,两者比较无显著性差别(P＞0.05),出生8例,流产5例,其余7例正在妊娠中.结论:采用慢速冷冻及快速解冻的方法,在自然周期和激素替代周期移植可获得满意的妊娠率.     

转基因兔与克隆兔高效胚胎移植体系的建立

目的建立高效的转基因兔和克隆兔的胚胎移植实验技术平台。方法通过外科手术移植的方法将受精胚胎、转基因胚胎和体细胞核移植胚胎分别移植到同步发情或异步发情的受体兔输卵管。结果移植受精胚胎、转基因胚胎和体细胞核移植胚胎的受体兔怀孕率分别为100％、66．67％、36.36％,产仔数分别为19、24及17只,仔兔的成活率分别为90.48％、92．31％、17．65％。出生仔兔与移植胚胎数的比率分别为43．75％、21．31％、8．54％。结论成功建立了高效的转基因兔和克隆兔的胚胎移植的实验技术平台。     

建立转bcl-xL基因小鼠的研究

目的 建立转bcl—xL基因小鼠，继而传代建系，用于缺血性脑血管疾病的研究。方法 采用显微注射法，将人bcl—xL基因注入民明小白鼠受精卵获得子代鼠，然后作PCR、Southern—blot、mRNA、Western—blot检测以获得阳性鼠。结果 实验中注射受精卵1654枚，移植卵数1448枚，受体鼠49只，怀孕鼠7只，子代鼠13只，整合4只并均有表达。注射受精卵的存活率87．54％，受精卵的总存活率0．78％，受体鼠的怀孕率14．28％，整合效率30．77％，总有效率为0．24％。结论 获得了转bcl—xL基因小鼠，但转基因的效率较低，表达不稳定。     

心脏特异表达人源FAM55A转基因小鼠的建立

目的建立心脏特异表达的人源FAM55A转基因小鼠,为研究该基因在心肌病发病中的作用提供模型。方法 Western blot检测FAM55A在野生型小鼠与cTnTR141W转基因小鼠心脏组织中的表达变化及其在野生小鼠的组织表达谱。克隆人源FAM55A基因入α-MHC启动子下游构建a-MHC-FAM55A表达载体,显微注射法建立FAM55A转基因小鼠。PCR鉴定转基因首建鼠的基因型。Western blot鉴定人源FAM55A在转基因小鼠心脏中的表达,超声检测转基因小鼠心脏的几何构型和功能。HE染色检测转基因小鼠心脏的病理改变。结果 FAM55A在野生型小鼠心脏中有少量表达,在扩张型心肌病小鼠的心脏中表达增加。建立了1个心脏组织特异表达人源FAM55A转基因小鼠品系。与野生型小鼠相比,FAM55A转基因小鼠的心脏收缩期和舒张期左室前壁从1月龄到5月龄持续增厚,3月龄转基因小鼠心脏射血分数和短轴缩短率稍有增强,1月龄和5月龄转基因小鼠心脏功能则与同龄野生型小鼠相比无变化。组织学检测显示,转基因小鼠心脏左室心肌细胞不均匀肥大,但不发生紊乱。结论 FAM55A在扩张型心肌病小鼠的心脏中表达上调,建立了心脏特异表达的人源FAM55A转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具。     

hApoE7转基因小鼠纯合子的培育和鉴定

目的：载脂蛋白E(apoE)是血浆中参与脂质代谢的重要蛋白质，并且与迟发型早老性痴呆(AD)相关。为从整体水平研究人突变ApoE基因剂量与效应的关系，我们拟培育C57BL/6-hApoE7纯合子转基因小鼠。方法：将经Southern杂交鉴定为阳性的F1代小鼠进行互配，仔代经PCR初筛，再行Southern杂交鉴定，杂交结果经扫描定量分析以确定hApoE7基因整合的拷贝数，纯合子小鼠的拷贝数为杂合子的两倍。经此法鉴定的纯合子小鼠与正常C57 BL/6小鼠进行侧交以进行进一步的鉴定。结果：Southern杂交鉴定出F1代转基因小鼠6只，F2代转基因小鼠7只，其中纯合子3只。将所得到的纯合子小鼠与正常的C57 BL/6小鼠交配，仔代鼠经PCR鉴定结果全部为阳性。结论：通过培育C57 BL/6-hApoE7纯合子转基因小鼠，发现人ApoE7基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传，转基因的遗传特征符合常染色体单位点整合。     

不同方案超排卵下小鼠子宫内膜种植窗期整合素β3的表达

目的 以超排卵下小鼠子宫内膜种植窗期整合素β3的表达为指标,比较不同超排卵方案对小鼠子宫内膜容受性的影响。方法 模拟人类超排卵长周期,对小鼠进行超促排卵。根据超排卵方案的不同,按随机表顺序将40只小鼠分为4组,分别为促性腺激素释放激素拮抗剂(GnRHant)组、促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)组、孕马血清促性腺激素(PMSG)组及对照组,每组10只小鼠。用免疫组织化学和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法分别检测小鼠子宫内膜种植窗期整合素β3蛋白和mRNA的表达。结果 免疫组织化学结果显示,与对照组相比GnRHa组小鼠整合素β3蛋白的表达明显下降(P=0．023),GnRHant组和PMSG组小鼠整合素β3蛋白的表达明显降低(P=0．001);与PMSG组小鼠相比,GnRHa组小鼠整合素β3的表达明显增高(P=0．001),而GnRHant组整合素β3的表达差异无显著意义(P=0．768);RT-PCR结果与免疫组化结果相符。结论 与小鼠自然周期相比,3种超排卵方案均使小鼠子宫内膜种植窗期整合素β3的表达明显下降,可能降低了子宫内膜容受性;与单一PMSG超排卵方案相比,GnRHa辅助超排卵方案能明显改善小鼠子宫内膜的容受性;而GnRHant辅助超排卵方案则对小鼠子宫内膜容受性的改善作用不明显。     

激肽释放酶转基因大鼠模型的建立

目的建立KLK1转基因大鼠模型。方法腹腔注射PMSG-HCG（150-150IU/kg）超排不同周龄（4-8周）SD大鼠比较超排效果的差异，以可用于注射胚胎数作为评判标准确定最佳超排周龄。构建pBC-klk1转基因构件，经酶切、纯化后通过显微注射方法导入SD大鼠受精卵原核并移植到同期受孕的SD受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型，通过RT-PCR和免疫组化方法检测klk1基因表达。结果4-8周SD大鼠超排后分别获得受精卵14±14.8、30±15.2、13.3±13.7、13±14.7、8±5.7，5周龄大鼠超排效果最好，与其他周龄大鼠相比有显差异，P〈0.05；显微注射1538枚卵，移植685（44.53%）枚卵于31只受体输卵管中，12（12/31，38.7%）只怀孕，共产仔62只，经PCR检测获得6只阳性鼠，Southern检测3只阳性。对Southern检测阳性转基因大鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明klk1基因在肾脏、胰腺和乳腺内表达。结论成功建立klk1基因表达的转基因大鼠模型，该模型是高血压病研究的理想动物模型。     

转人组织蛋白酶K基因鼠系的PCR检测

目的用PCR技术检测转人组织蛋白酶K基因鼠系,筛选携带目的基因的阳性小鼠。方法用PCR技术,对显微注射后出生的转人组织蛋白酶K基因小鼠、首建鼠的F1、F2、F3及F2代与野生型ICR小鼠的回交后代进行检测。结果共检测显微注射后出生的小鼠25只,阳性为1只,阳性率为4%;检测F1、F2、F3代小鼠分别为60、77和69只,阳性仔鼠数为35、56和63只,阳性率分别为550%、727%和913%;对回交后代进行检测,未见纯合的F2代小鼠。结论外源基因(人组织蛋白酶K基因)已经整合到小鼠的染色体上,并且按孟德尔遗传定律中的分离定律进行遗传。     

单细胞克隆小鼠胚胎干细胞系的建立

目的:建立胚胎干细胞的培养系统及培养方法.方法:用免疫溶解法(immunosurgery)分离3.5 d的129SvJ系小鼠囊胚内细胞团,在γ射线照射的胎鼠成纤维细胞饲养层上培养,胰酶消化传代.用组织化学法、免疫组织化学方法识别细胞表面标志,常规G带法行染色体核型分析,在体、离体分别观察细胞的多向分化能力.结果:得到一个单细胞克隆129系小鼠胚胎干细胞系G11能长期稳定增殖不分化,具有正常40XY核型,碱性磷酸酶阳性、SSEA-1阳性,在体和离体条件下可分化为多种细胞.结论:以小鼠为模型成功建立了哺乳动物胚胎干细胞的培养方法和培养系统.