汉防己甲素抑制翼状胬肉成纤维细胞增殖的研究

目的:观察汉防己甲素对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞增殖抑制作用并探讨其机制,寻找治疗翼状胬肉和预防其复发的有效药物.方法:(1)倒置相差显微镜下观察不同浓度的Tet作用下,体外培养的翼状胬肉成纤维细胞形态的变化,并与丝裂霉素(Mitomycin,MMC)进行比较.(2)MTT比色法测定不同浓度的Tet作用48h对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞增殖的抑制作用,并与MMC进行比较.(3)流式细胞仪检测不同浓度的Tet作用48h,体外培养的翼状胬肉成纤维细胞细胞周期的变化.结果:(1) Tet作用下,细胞胞体收缩,变圆,间隙增宽,药物浓度高时,细胞碎裂,浮起.0.1,0.2g/L MMC作用下大量细胞碎裂,溶解.(2)不同浓度的Tet作用48h对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞的增殖均有明显的抑制作用(P＜0.01);0.1g/L与0.2g/L MMC、4×10-5 mol/L Tet与0.2g/L MMC对翼状胬肉成纤维细胞活性的影响无显著性差异(P＞0.05).Tet的IC50接近10-5mol/L(为0.848×10-5mol/L).(3)Tet作用下,翼状胬肉成纤维细胞周期中S期细胞增多,浓度越高,作用越明显.结论:汉防己甲素对翼状胬肉成纤维细胞的增殖具有明显的抑制作用,呈剂量依赖性,细胞分裂被阻止在S期(DNA合成期).可望用于对翼状胬肉的治疗.     

汉防己甲素及地塞米松对兔结膜成纤维细胞增殖的抑制作用

目的　观察汉防己甲素 (tetrandrine,Tet)对体外培养的兔结膜成纤维细胞 (rab-bit conjunctival fibroblasts,RCF)增殖的抑制作用 ,探讨其与地塞米松 (dexamethasone,Dex)联合应用的价值 ,并对二者的抑制作用进行比较。方法　应用 MTT法 ,测定不同浓度的 Tet、Dex及 Tet联合 Dex对 RCF增殖的抑制作用。结果　浓度为 1 0 0、80、2 0、5、1 .2 5、0 .3 1 2 5mg· L-1的 Tet对 RCF的增殖均有抑制作用 ,其抑制率分别为 86.0 0 %、78.1 5%、62 .89%、3 0 .1 9%、1 8.0 4%、9.2 1 %,与对照组相比有显著性差异。半数抑制量(ID50 ) 2 0 0 mg·L-1的 Dex在联合 5mg· L-1的 Tet后 ,对细胞生长的抑制率为 49.2 5%.结论　 Tet对 RCF的增殖有抑制作用 ,且与药物浓度成正相关。 Dex联合 Tet有协同抑制作用。 Tet可能成为一种新型的抗眼部增殖性疾病的药物     

汉防己甲素对体外培养的兔结膜成纤维细胞抑制作用的实验研究

目的：观察汉防己甲素（Tet)对体外培养的兔结膜成纤维细胞（RCF）生长的抑制作用，探讨其作用的可能机制，为防治与成纤维细胞增殖相关的多种眼病提供一种有效的药物。方法：应用MTT法测定不同浓度的Tet对RCF的抑制作用；用细胞计数法观察不同浓度的Tet在不同时间下对RCF的生长抑制作用；用流式细胞仪检测Tet对RCF细胞周期的影响。结果：给药48小时后，终浓度为0．16、0．8、4、20、100μg/ml的Tet对RCF的生长均明显抑制作用；且在上述不同浓度的Tet作用下，于1、3、5、7天计数细胞，发现Tet对RCF的抑制具有时间、剂量关系。流式细胞仪显示，RCF经2μ/mlTet处理48h后，G1期细胞增加了13．3％，S期细胞下降了9．55％，G2期细胞下降了4．23％。结论：汉防己甲素可抑制RCF生长，有时间剂量效应。Tet影响RCF细胞周期各时相群体，抑制G1期向S期的过渡，进而阻止细胞向G2期的过渡，从而抑制细胞增殖。     

兔结膜成纤维细胞培养的体会

兔结膜成纤维细胞培养的体会河北省人民医院张坤丽，张淑惠，杨树立，张渤海近年来，抗眼部增生性疾病的研究已进入抑制细胞增殖的药物研究领域，其中，体外抗成纤维细胞药物测试则成为一种重要的研究工具［１，２］。本文就我们培养兔结膜成纤维细胞的体会介绍如下。材料...     

兔结膜成纤维细胞的体外培养

目的：探索兔眼结膜成纤维细胞体外培养的方法。方法：分别采用组织块培养法、机械分离法、消化培养法、细胞悬液法和混合消化组织块培养法培养兔结膜成纤维细胞,观察细胞形态和生长特性。结果：单纯机械分离和消化培养法都可以得到单层贴壁细胞,细胞消化后再培养可缩短生长周期。结论：混合酶充分消化的组织块连同细胞悬液一同培养的方法,步骤简便且周期短。通过差别消化法和多次传代可以得到较纯的成纤维细胞。     

几丁糖膜在兔实验性小梁切除术后抗瘢痕作用研究

目的几丁糖制成膜状对兔实验性小梁切除术滤过泡作用。方法兔30只，双眼均行常规小梁切除术，每只兔随机选取1只眼为实验眼，植入几丁糖膜，另1只眼为对照眼，行常规小梁切除术不植入几丁糖膜。术后观察眼压，成纤维细胞计数，Kaplan—Meier分析法统计术后滤过泡情况。结果（1）眼压：实验组术后1、2、4周眼压与术前相比差异有统计学意义，第5周开始眼压与术前相比差异无统计学意义。对照组术后1周与术前相比差异有统计学意义，第2周开始眼压与术前相比差异无统计学意义。术后1～4周，6周，8周，12周实验驵与对照组眼压相比差异有统计学意义，实验组低于对照组，第5周差异无统计学意义。（2）实验组滤过泡存留时间与对照组相比差异有统计学意义。（3）成纤维细胞计数：1、2、6、12周实验组与对照组差异有统计学意义（t=-5．541，-5．713，-5．499，-3．063，P〈0．05），3周差异无统计学意义。（4）光镜下实验组1～3周均可见滤过道通畅，几丁糖膜呈均质状，6周滤过道部分阻塞，12周时闭合。对照组第3周开始滤过道消失。结论兔小梁切除术后应用几丁糖膜能抑制成纤维细胞生长，降低眼压，延长滤过泡存留时间。     

小檗胺抑制兔Tenon囊和滤过道内成纤维细胞增殖的实验研究

目的:研究钙调素拮抗剂小檗胺(berbamine,BER)对兔Tenon囊成纤维细胞和兔小梁切除术后滤过道内成纤维细胞增殖的抑制作用。方法:体外培养兔Tenon囊成纤维细胞,经不同浓度BER处理不同时间后,细胞计数Kit8(CCK8)法检测BER对兔Tenon囊成纤维细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪检测其凋亡率及细胞周期的变化。HE染色检测BER对兔小梁切除术后滤过道内成纤维细胞增殖的抑制作用。结果:兔Tenon囊成纤维细胞经不同浓度BER处理不同时间后细胞增殖受到抑制,并呈时间剂量依赖性。流式细胞仪检测发现BER处理后兔Tenon囊成纤维细胞呈现G1期阻滞,细胞凋亡率明显增加,20mg/LBER处理9h,细胞凋亡率从0.64%增加到31.86%。HE染色显示BER显著抑制兔小梁切除术后滤过道内成纤维细胞的增殖。结论:小檗胺在体内外均能抑制成纤维细胞的增殖,其可能是通过诱导细胞凋亡方式抑制兔Tenon囊和滤过道内成纤维细胞的增殖。     

CTGF在兔眼小梁切除术后滤过泡瘢痕形成中的表达

目的:以兔为动物模型,观察结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)在兔眼小梁切除术后滤过泡瘢痕形成过程中的表达,初步探讨CTGF在滤过泡瘢痕形成机制中的作用。方法:健康成年家兔28只,随机选取1眼行小梁切除术,另1眼不手术作为对照,分别于术后第1,3,5,7,10,14,21d分批处死,另取2只兔不手术作为正常对照,于术前处死。摘除眼球,剪取滤过泡区域组织,制成病理切片,行常规HE染色及免疫组织化学检测(SABC法),光镜下观察并行图像定量分析。结果:CTGF在对照组织标本中几乎无阳性表达,手术后表达上调,主要表达于成纤维细胞胞浆中,手术后第5d达高峰。结论:在滤过泡瘢痕形成过程中,CTGF发挥了重要的作用,阻断CTGF的基因表达或抑制其活性,可能为防止青光眼滤过手术的失败提供一个新的治疗途径。     

几丁聚糖对兔结膜上皮细胞和结膜成纤维细胞增殖的影响

目的　研究几丁聚糖对兔结膜上皮细胞和结膜成纤维细胞增殖的影响。方法　采用消化法培养结膜上皮细胞 ,组织块法培养结膜成纤维细胞。通过MTT比色法和细胞计数法测定几丁聚糖对两种细胞增殖的影响。结果　几丁聚糖在浓度 >0 0 3 %时能促进结膜上皮细胞的增殖 ,浓度为 0 12 %时促进作用最明显。结膜成纤维细胞在几丁聚糖浓度 >0 0 3 %时其增殖即受到抑制 ,抑制作用呈浓度依赖性。结论　几丁聚糖有望用于预防睑球粘连     

He-Ne激光对兔眼小梁切除术后滤过道成纤维细胞增殖的影响

目的 研究兔眼小粱切除术前辅助使用He-Ne激光照射滤过区对滤过道成纤维细胞增殖情况的影响.方法 随机选取健康新西兰大白兔29只(58眼)用于实验.实验一:将健康新西兰大白兔8只(16眼)随机分为4组,即100 mW·cm-2、150 mW·cm-2、200 mW·cm-2激光手术组及空白对照组,每组各2只(4眼),激光手术组兔眼使用不同功率密度的He-Ne激光照射,空白对照组兔眼不行激光照射.照射部位选择兔眼鼻上象限角膜缘紧邻上直肌处,照射距离10cm,光斑直径4 mm,照射时间10 min,每天1次,连续照射3d.最后一次照射24h后处死动物,取照射区组织采用病理学和免疫组织化学技术.检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA),并使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminaldeoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)观察照射区成纤维细胞增殖和凋亡的病理改变.实验二:将另外21只兔(42眼),采用200 mW·cm-2 He-Ne激光同上法预处理每只兔右眼手术区,最后一次照射24h后实施小梁切除术(即激光联合小粱切除术组),左眼行单纯小粱切除术为单纯手术对照组,分别于手术后7d、14d、28d检测滤过区组织上述指标.结果 实验一:各He-Ne激光联合小梁切除术组与空白对照组均仅检测到少量PCNA阳性细胞,未见明显TUNEL凋亡细胞,差异均无统计学意义(均为P>0.05).实验二:200 mW·cm-2 He-Ne激光联合小梁切除术组与单纯手术对照组PCNA阳性细胞率术后7d最高,14d显著降低,28d降至最低.术后7d、14d,200 mW·cm-2 He-Ne激光联合小梁切除术组PCNA阳性细胞率分别为(19.34±2.35)%、(10.48±3.29)%,均明显低于单纯手术对照组(22.88±3.29)%、(14.35±2.56)%(均为P<0.05);术后28 d,2组PCNA阳性细胞率均较低,差异无统计学意义(p>0.05).2组各时间点亦未检测到明显TUNEL凋亡细胞.结论 He-Ne激光照射对正常兔眼结膜下及巩膜成纤维细胞活性无明显影响,小粱切除术前辅助使用200 mW·cm-2 He-Ne激光照射可以抑制术后早期成纤维细胞增殖,可能有助于抑制滤过泡的瘢痕化而提高手术成功率.     

聚肌胞兔滤过术后结膜下注射对成纤维细胞的影响

目的研究聚肌胞注射液对兔滤过术后滤过道的组织病理学变化及毒性。方法对10只新西兰兔双眼小梁切除术,于术中、术后一组（每兔1眼）球结膜下注射聚肌胞,对照组（每兔另1眼）球结膜下注射生理盐水。术后3、5、10、15d行术眼眼压和裂隙灯显微镜检查。术后5、7、10、15d行术眼病理切片光镜观察。结果对照组的滤过泡于术后7d失败,聚肌胞组的滤过泡于术后14d失败,术后7～10d聚肌胞组巩膜瘘道阻塞率是40％,对照组巩膜瘘道全部阻塞。结论对兔眼滤过术中、术后应用聚肌胞可以抑制成纤维细胞增生,暂时提高兔眼滤过术的成功率,无副作用。     

Silibinin inhibits myofibroblast transdifferentiation in human tenon fibroblasts and reduces fibrosis in a rabbit trabeculectomy model

Purpose: To investigate the effect of silibinin in myofibroblast transdifferentiation and in animal trabeculectomy models. Methods: The effect of silibinin on the expression of α‐smooth muscle actin (α‐SMA) and vimentin in response to transforming growth factor‐β1 (TGF‐β1) was determined in human tenon fibroblasts (HTFs). Cell migration and collagen contraction arrays were used to demonstrate the functionality of silibinin‐modulated HTFs. ELISA analysis was used to determine the effect of silibinin on the release of type 1 collagen and connective tissue growth factor (CTGF). The effect of silibinin on the activation of the TGF‐β receptor–related pathway was evaluated by Western blotting. A rabbit model of trabeculectomy was established to assess the effect of silibinin in vivo. Results: TGF‐β1 elevated the expression of α‐SMA and vimentin in HTFs; this elevation was inhibited by silibinin. TGF‐β1 increased cell migration and collagen contraction of HTFs, which were also suppressed by silibinin. The production of both CTGF and type 1 collagen in TGF‐β1‐treated HTFs was inhibited by silibinin. The effects of silibinin on TGF‐β1‐stimulated HTFs were mediated via the down‐regulation of TGF‐β receptor–related SMAD signalling pathways. In the rabbit model of trabeculectomy, silibinin increased the period of decreasing intraocular pressure after trabeculectomy and reduced the production of collagen and α‐SMA at the site of blebs in vivo. Conclusion: Silibinin inhibited the TGF‐β receptor–related signalling pathway in TGF‐β‐treated HTFs and several of the downstream events associated with myofibroblast transdifferentiation. Silibinin also improved the outcome of trabeculectomies by reducing the fibrotic response in the bleb tissue in vivo.     

兔眼滤过术联合应用苏拉明后滤过道的组织病理学观察

目的研究小梁切除术联合应用苏拉明后滤过道的组织病理学变化。方法对20只健康家兔(40眼)均行青光眼滤过手术。随机分为两组,每组各10只(20眼)。第1组:随机选择一眼做单纯小梁切除术,另一眼做小梁切除术并辅助应用苏拉明;第2组:随机选择一眼做小梁切除术联合应用丝裂霉素(mitomycine,MMC),另一眼做小梁切除术并辅助应用苏拉明。对兔眼术后3d、7d、15d、30d、60d不同时期的滤过泡组织进行病理检查,采用HE染色和天狼星-苦味酸染色、Masson三色染色法、免疫组化方法,观察成纤维细胞、新生胶原纤维、新生血管的改变化。结果成纤维细胞:应用苏拉明组和MMC组术后滤过道成纤维细胞数目与单纯小梁切除组差异均有统计学意义(P<0.05),而该两组之间差异无统计学意义;新生胶原纤维:应用苏拉明组和MMC组术后滤过道新生胶原量与单纯小梁切除组差异均有统计学意义(P<0.05),而两组之间差异无统计学意义;新生血管:应用苏拉明组和MMC组术后滤过道成纤维细胞数目与单纯小梁切除组差异均有统计学意义(P<0.05),而两组之间差异无统计学意义。结论小梁切除术联合应用苏拉明可在术后抑制成纤维细胞增殖、新生胶原纤维的合...     

血小板源性生长因子BB对体外培养兔角膜成纤维细胞增殖和细胞周期的影响

目的探讨重组人血小板源性生长因子BB(recombinant human platelet-derived growth factor-BB,rhPDGF-BB)对体外培养的兔角膜成纤维细胞增殖和细胞周期的影响。方法体外培养兔角膜成纤维细胞,分实验组和对照组,对照组弃原培养液,加无血清培养液继续培养,实验组用不同浓度的rhPDGF-BB1μg·L-1、10μg·L-1、100μg·L-1、1000μg·L-1分别作用于兔角膜成纤维细胞24h、48h、72h,用MTT比色法检测rhPDGFBB对兔角膜成纤维细胞生长的影响,流式细胞仪检测rhPDGFBB对兔角膜成纤维细胞细胞周期的影响。结果rhPDGFBB在1～100μg·L-1浓度范围内与兔角膜成纤维细胞增殖呈剂量效应关系,当浓度增大到1000μg·L-1,促增殖作用减弱。流式细胞术对细胞周期时项分析结果显示,经rhPDGFBB作用后,兔角膜成纤维细胞的DNA合成量(S%)显著升高,G1%降低,反映细胞增殖活力的增殖指数PI值增高。结论rhPDGFBB能促进兔角膜成纤维细胞的增殖和DNA合成,这一作用可能是通过促使处于G1期的兔角膜成纤维细胞进入S期来实现的。     

青光眼常规小梁切除术结膜瓣大小对手术效果的影响

目的:探讨青光眼常规小梁切除术中结膜瓣大小对降压效果及术后并发症的影响。方法:对10例已确诊双眼慢性闭角型青光眼的患者行常规小梁切除术+虹膜周切术,均做以穹窿为基底的结膜瓣,术中不用抗代谢药物。1眼做底边长10mm,高6mm等边三角形结膜瓣,另1眼做边长10mm,高6mm矩形结膜瓣(实际面积相当于前眼的两倍),其余手术步骤一致。于术后2d开始,每日测量眼压(非接触式眼压计),裂隙灯检查前房至术后7d拆线。分别于术后0.5,1,3mo复查。结果:患者10例扩大结膜瓣眼于术后全部发生浅前房,对侧无1例发生。其中1级浅前房5例,2级浅前房4例,3级浅前房1例。染色:2级浅前房中1例结膜瓣伤口漏。3级浅前房患眼下方结膜囊见滤过泡隆起。无1例发生睫状体脉络膜脱离。眼压测量:手术眼眼压均位于4～8mmHg,双眼相差<2mmHg。1,2级浅前房眼行滤枕加压、绷带包扎,3级浅前房眼行美多丽每日散瞳、滤枕加压、绷带包扎,均未口服及静脉使用降眼压药物。术后7d拆线时,术眼前房均正常,1例双眼眼压为14mmHg,9例眼压<10mmHg,双眼相差<2mmHg,双眼滤过泡大小一致。术后0.5,1,3mo复查双眼滤过泡无差别,眼压无差别。结论:扩大的结膜瓣并不能更有效的降低眼压,增大有效滤过泡的容积,反而会在术后早期增加滤过过强,眼压低,滤过泡大而弥散的并发症。     

结膜松弛症球结膜成纤维细胞的原代培养及形态学观察

目的:观察原代培养的结膜松弛症(CCH)球结膜成纤维细胞生长状况及形态变化,确定最佳传代时间以获得稳定、一致的CCH球结膜成纤维细胞。方法:采用组织块贴壁法获得CCH原代球结膜成纤维细胞,胰蛋白酶差速消化法进行成纤维细胞纯化,倒置显微镜下观察并记录不同时期成纤维细胞的生长状况及形态变化,免疫荧光细胞化学染色行成纤维细胞鉴定。结果:CCH结膜组织贴壁24h即可见少量细胞从组织块周围爬出,第2～7d为细胞生长对数期,细胞生长快、增殖旺盛,轮廓清晰,分布均匀,数目增多,细胞核清晰;第9～15d细胞生长进入平台期,组织块逐渐老化失去活性,细胞增长缓慢,排列疏松,体积变大,形状扁平,细胞浆内见大量颗粒状物质和小泡产生,部分细胞从培养瓶底脱落,细胞之间出现较大空隙。传代纯化后细胞的大小、形态基本一致,经鉴定为成纤维细胞,呈长梭形、扁平星状或多突的纺锤形,中间宽大,有卵圆形细胞核,两头相对细小,伴向外伸出2～3个长短不一的细长突起。结论:采用组织块贴壁法可成功获得原代CCH球结膜成纤维细胞,当细胞生长至第8d时行消化、传代可获得稳定、一致的CCH球结膜成纤维细胞。