肺炎衣原体荧光PCR检测方法的建立和应用

目的采用Taqman探针技术,组建肺炎支原体荧光PCR基因检测方法。方法对GenBank登录的肺炎衣原体的基因序列进行生物信息学分析,针对保守区域设计引物和探针,组建实时荧光PCR检测方法。对来自本院的560份临床咽拭子样本和肺泡冲洗液样本进行检测。采用流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒进行特异性评价。结果本实时荧光PCR方法对甲型流感病毒(甲型、乙型)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒无特异性反应。本院的临床样本检出26份,其中咽拭子9份,肺泡冲洗液17份。结论肺炎支原体荧光PCR检测方法可用于肺炎衣原体感染的辅助诊断。     

检测肺炎支原体的实时荧光PCR方法的建立

目的 采用Taqman探针技术,组建肺炎支原体荧光PCR基因检测方法.方法 对GenBank登录的肺炎支原体的基因序列进行生物信息学分析.针对16s核糖体蛋白基因的保守区域设计引物和探针,组建实时荧光PCR方法检测.采用流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒进行特异性评价.采用倍数稀释的方法进行灵敏度的评价.对来自南方医院的522份临床咽拭子样本进行检测.结果 用实时荧光PCR方法检测甲型流感病毒(甲型、乙型)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒均无特异性反应.该方法可以检测出稀释浓度约为103/mL的肺炎支原体样本.对本院的临床样本检出39份.结论 实时荧光PCR检测肺炎支原体具有较高的特异性和灵敏度,可用于肺炎支原体感染的诊断.     

肺炎衣原体ELISA抗原检测方法的建立和应用

目的 采用ELISA技术,建立肺炎衣原体抗原检测方法.方法 建立酶联免疫吸附法,检测标本中的肺炎衣原体.采用常见的呼吸道病原体进行特异检测.对来自本院的560份临床咽拭子样本和肺泡冲洗液样本进行检测.采用流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒进行特异性评价.结果 本方法对流感病毒(甲型、乙型)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒无特异性反应.对本院的临床样本检出13份,其中咽拭子4份,肺泡冲洗液9份.结论 本肺炎支原体抗原检测方法可用于肺炎衣原体感染的辅助诊断.     

肺炎支原体抗原酶联免疫检测方法的建立

目的采用ELISA技术,建立肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)抗原检测方法。方法制备肺炎支原体的多克隆抗体,建立酶联免疫吸附法,检测标本中的肺炎支原体,对其敏感性和特异性进行检测。结果本方法可以检测毒株的1/212的稀释样品,对甲型流感病毒(H3N2亚型、H1N1亚型)、乙型流感病毒、副流感病毒(Ⅰ型、Ⅲ型)、呼吸道腺病毒(Ⅲ型、Ⅶ型)、肺炎衣原体无特异性反应。结论本肺炎支原体抗原检测方法可用于疑似肺炎支原体感染样品的临床诊断和鉴别诊断。     

荧光偏振和多重聚合酶链技术在肺炎支原体、肺炎衣原体检测中的应用

目的:应用多重聚合酶链反应和荧光偏振检测技术建立一种方便可靠、简单经济的肺炎支原体、肺炎衣原体DNA同步检测方法.方法:以与肺炎衣原体、肺炎支原体16SRNA序列互补的特异、无交叉反应的两对引物在同一反应体系中行多重聚合酶链反应扩增阴阳性对照及521例患儿咽喉分泌物,将荧光偏振检测技术与模板指导的DNA末端延伸反应(TDI -FP)结合,对样本PCR扩增产物进行进一步检测,并与测序方法结果比较.结果:应用多重聚合酶链反应和TDI -FP技术检测患者521例,肺炎衣原体感染阳性121例,肺炎支原体感染阳性113例,与测序检测方法符合率100%,其中肺炎衣原体、肺炎支原体双重感染阳性10例.结论:建立了基于荧光偏振技术检测肺炎衣原体、肺炎支原体的新方法,具有良好的特异性,方便简单,无需标记探针,可用于临床检测.     

儿童肺炎支原体感染三种实验诊断方法评价

目的:探讨儿童肺炎支原体感染的快速、简便、有效的临床实验室诊断方法。方法:对2016年12月收集的200例临床呼吸道感染患儿的咽拭子和静脉血样本进行肺炎支原体快速鉴定培养镜检、抗体检测、抗原检测及荧光定量PCR(Polymerase chain reaction)分析。以快速培养鉴定镜检法为诊断肺炎支原体感染金标准,比较抗体检测、抗原检测及荧光定量PCR三种诊断方法的灵敏度、特异度和Youden指数(正确诊断指数)。结果:抗体检测的灵敏度、特异度和Youden指数分别为76.3%、77.9%、54.2%;抗原检测为37.7%、89.5%、27.2%;荧光定量PCR为93.0%、96.5%、89.5%。荧光定量PCR法的灵敏度、特异度和Youden指数均高于抗体检测和抗原检测法(P0.05),三者Youden指数两两比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:荧光定量PCR具有较高的灵敏度、特异度和Youden指数,可以在未来替代快速鉴定培养镜检、抗体检测和抗原检测法,作为临床诊断儿童肺炎支原体感染的快速、简便而有效的实验室诊断方法。     

实时荧光定量PCR检测沙眼衣原体的研究

目的 采用TaqMan探针建立检测沙眼衣原体的实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法.方法 根据沙眼衣原体外膜蛋白A的基因(ompA)序列设计引物和探针,以克隆的ompA部分基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量检测方法.结果 建立的荧光定量PCR检测方法的最低检出限为5 copies/反应,检测线性范围100107线性关系良好(r2=0.997),比巢式PCR敏感100倍;且与鹦鹉热衣原体、淋球菌、解脲脲原体、大肠杆菌等病原菌DNA以及人基因组DNA均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性.以巢式PCR作参比,建立的荧光定量PCR法检测沙眼衣原体的阳性符合率为100.00％,阴性符合率为95.09％,总符合率为96.81％.结论 建立的检测沙眼衣原体实时荧光定量PCR具有特异性强和敏感性高的特点,可快速检测样本中微量沙眼衣原体DNA,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.     

TaqMan 探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的： 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法：选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果：支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg/L,A260/Ａ280 (Ratio)为1
.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝/ μL。10 μmol/L的引物浓度和10 μmol/L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101 拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式：Ct= －2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论：支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。     

血清肺炎支原体 DNA 定量对肺炎支原体感染的诊断价值

目的：探讨实时荧光定量PCR法诊断肺炎支原体感染的可行性。方法收集肺炎支原体感染患者60例（支原体感染组）,健康体检正常的个体34例（健康对照组）。用凝集法检测血清肺炎支原体IgG抗体,用实时荧光定量PCR法检测血清肺炎支原体DNA,用免疫比浊法检测C反应蛋白,用染色后激光扫描法检测全血白细胞及中性粒细胞。结果与健康对照组相比,治疗前支原体感染组的血清肺炎支原体DNA定量、肺炎支原体IgG抗体滴度、C反应蛋白浓度、全血白细胞及中性粒细胞计数均显著升高;与治疗前相比,支原体感染组治疗后的血清肺炎支原体DNA定量、全血白细胞及中性粒细胞计数均比治疗前显著下降;与治疗前相比,支原体感染组治疗后的肺炎支原体IgG抗体滴度显著升高,C反应蛋白浓度差异无统计学意义。结论实时荧光定量PCR法对肺炎支原体感染的诊断与治疗后监测比肺炎支原体抗体血清学检测更优。     

Comparison of Several Methods for Detection of FEPAS Beef Listeria Monocytogenes

目的:探讨在食品检验中单核细胞增生性李斯特菌的检验方法.方法:采用常规培养法、全自动酶联免疫荧光分析仪筛选法、基因探针化学发光检测法、实时荧光定量PCR检测法对英国食品检验能力评价体系(FEPAS)牛肉单核细胞增生性李斯特菌水平测试提供的二份盲样(M164d02A和M164d02B)进行检测.结果；4种检测方法检测结果一致,样本M164d02A检出单核细胞增生性李斯特菌、样本M164d02B未检出单核细胞增生性李斯特菌,而实时荧光定量PCR检测法灵敏度较高,检测周期较短、特异性较高.结论:实时荧光定量PCR检测法在单核细胞增生性李斯特菌的检测中具有灵敏度高、检测时间短、特异性高等特点.     

一起流行性感冒疫情相关病原学调查

目的检测流行性感冒疫情相关病原,为呼吸道感染性疾病爆发疫情中病原体的确定提供实验依据.方法采用PCR、免疫荧光及混合细胞培养法,对类似肺炎的呼吸道感染爆发疫情中的患标本进行多种常见呼吸道病原体检测.结果8名患的含漱液中检出6株肺炎支原体及2株甲3型流感病毒;血清IgM抗体检测,3份肺炎支原体IgM抗体阳性、5份甲型流感IgM抗体阳性.结论呼吸道感染性疾病,可能由多病原体引起,在进行病原学分析时应尽可能进行分类检测,以求证病原体的检验证据,为疾病诊治提供依据.     

呼吸道感染病原体九联检与痰培养联合的临床应用

目的探讨临床中呼吸道感染病原体九联检与痰培养联合检测的应用价值。方法选取广东省普宁市人民医院2013年1月～2013年10月诊断为肺炎的172例患者为研究对象,对其痰标本进行呼吸道感染病原体九联检与痰培养两种检测的方法进行联合检测,分析两种方法的肺炎病原菌检测情况。结果痰培养法分离出其中152例肺炎患者痰标本160株病原菌,以革兰阴性杆菌为主,主要有5种主要病原菌,分别为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及金黄色葡萄球菌与真菌,构成比分别为25.0％、25．8％、22.5％、10.6％、8．1％;另40例未检测出致病病原菌的肺炎患者血清标本,对其进行九联检法检测,共检测9种病原菌,主要表现为肺炎支原体、嗜肺军团菌1型、肺炎衣原体、Q热立克次体、呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒甲型、流感病毒乙型、副流感病毒1、2、5型,构成比分别为20.0％、12.5％、12．5％、5.0％、5.0％、5．0％、12．5％、10.0％、17.5％。结论临床中对于肺炎患者采取呼吸道感染病原体九联检与痰培养联合检测能够有效地提高诊断效果,能够全面地对感染病原菌进行分析,敏感度高,对一些不是细菌引起的肺炎避免使用抗生素,给予患者合理的治疗,同时,呼吸道感染病原体九联检查法的操作曲。比较简单、适合在基层医院推广应用．     

维吾尔族肺炎衣原体肺炎108例临床分析

目的探讨肺炎衣原体感染的临床特点。方法采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定108例患儿血清肺炎衣原体（CP）抗体,并观察CP阳性者的临床症状、体征、X线、实验室检查和治疗结果。结果 108例维吾尔族患儿咳嗽以阵发性干咳为主,61%有发热,住院后发热平均持续1.9 d;68.5%C反应蛋白（CRP）正常,64.8%周围血白细胞计数正常。合并肺炎支原体、细菌、EB病毒感染者分别为22.2%,18.5%,14.8%。0岁~5岁患儿胸部X线以双侧病变为主,~14岁儿童以单侧病变为主;大环内酯类使用率为90.7%。结论肺炎衣原体是儿童期下呼吸道感染常见病原体之一,肺炎衣原体肺炎病程较长,中毒症状轻,以干咳为主;CRP、周围血白细胞计数大多正常;胸部X线改变有年龄差别;CP所导致的下呼吸道感染治疗以大环内酯类药物为首选药物。     

社区获得性肺炎的病原学研究及耐药性分析

目的:了解我院南区社区获得性肺炎(CAP)的病原学特征及耐药情况,合理使用抗生素。方法:对205例符合CAP诊断标准的患者留取痰或血进行细菌培养,采用血清学方法检测血中肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌抗体等非典型病原体。结果:193例细菌培养显示,病原分离阳性79例(40.9%);200例血清学检查,在非典型病原体感染中以肺炎支原体感染最为常见。结论:CAP的病原谱及其对药物敏感性的差异为临床合理使用抗生素提供了理论依据。     

辽宁省锦州市首例输入性登革热病例的调查、快速检测方法与防控探讨

目的通过调查总结输入性登革热的防治经验,并建立Taqman MGB实时荧光PCR技术快速检测登革热病毒,更好地指导今后登革热防制工作。方法流行病学调查,利用Taqman MGB技术,根据登革病毒3’端非编码区一段序列,设计登革1~4型荧光PCR通用引物和探针,以DF病毒株作为标准,以乙脑毒株作阴性对照,建立荧光PCR检测DF的快速方法。同时给予1份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行荧光PCR扩增。结果采用PCR引物对登革1~4型病毒进行扩增,与设计相符;而乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果,1份疑似患者血标本RT-PCR扩增阳性率为83.3%(25/30),其核酸序列与登革1型病毒柬埔寨株以及中国1997、1999年流行株GD14/97、GD05/99同源性分别为97%。结论在今后的登革热防控工作中,我们应用RT-PCR检测方法时间短、灵敏性高、有较高的特异性,以此作为为DF的临床早期诊断方法;其次重点加强出国和归国人员的管理,开展登革热防治知识的宣传教育,建立和其他部门的登革热联防体制,加强基层医务人员登革热防治知识培训,提高基层医务人员登革热诊治水平,来达到控制登革热的目标。     

季节性流感病毒H1N1实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速定量检测季节性流感病毒H1N1核酸的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。方法选择季节性流感病毒H1N1的保守基因NP基因作为检测靶目标,应用Clustal W软件进行序列同源性比对分析,筛选出季节性流感病毒H1N1特异性的保守序列作为引物候选区域,然后应用Primer Express及PrimerPremier 5.0软件包对候选引物进行进一步配对及筛选,得到最优特异性检测引物。同时,由病毒全长cDNA扩增出NP基因,琼脂糖凝胶电泳检测NP基因的扩增情况并对目的条带进行切胶回收及纯化,对回收后的NP全长基因进行核酸浓度测定,并换算成拷贝数,作为定量标准品。结果应用ABI公司的Power SYBR Green PCR MasterMix及StepOne实时荧光定量PCR仪,该检测系统灵敏度可达102 copies/μL,不同梯度标准品间线性关系(R2)达0.999,斜率为-0.3433,扩增效率为95.572%,所有标准品均在83.2℃出现尖且窄的特异性熔解峰。结论利用该检测系统可以快速定量检测季节性流感病毒H1N1,灵敏度高,可用作基础及临床实验室对季节性流感病毒H1N1感染的辅助诊断方法和临床效果的监测手段,对实验操作者要求相对较低,具有实际的应用价值。     

肺炎支(衣)原体肺炎引起的多系统损伤290例临床分析

目的:总结肺炎支(衣)原体肺炎中有多系统损伤的临床表现及临床特点。方法:回顾性分析290例肺炎支(衣)原体肺炎多系统损伤的临床资料。结果:290例肺炎支(衣)原体肺炎肺外表现有心血管系统、神经系统、血液系统、消化系统、支气管哮喘、全身感染、肾脏、皮肤等损害。其中川崎病和传染性单核细胞增多症文献未见报道,值得重视。本组病例经抗支(衣)原体及相应的综合治疗均治愈/好转。结论:肺炎支(衣)原体肺炎可并发其它组织器官病变,提示临床工作者在治疗呼吸道感染合并其它脏器损害时,要考虑肺炎支(衣)原体感染的可能,同时MP-IgM/CP-IgM阳性患儿应该注意多系统损害,以避免漏诊、误诊。