人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体构建、鉴定及功能分析

目的 构建人乙酰肝素酶(HPSE)基因启动子驱动的肿瘤细胞特异性表达载体,并分析其活性.方法 PCR扩增人类基因组DNA HPSE启动子核心片段,并测序鉴定和分析转录因子结合位点(TFBS).双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点,构建肿瘤细胞表达载体pEGFP-Hp.将经酶切和测序鉴定的重组质粒pEGFP-Hp及质粒pEGFP-1(阴性对照)和pEGFP-N1(阳性对照)分别转染正常人脐静脉内皮细胞(ECV)和不同的肿瘤细胞(肝癌细胞HepG2、喉癌上皮细胞Hep2和慢性自血病K562细胞).荧光显微镜观察和流式细胞术分析其促转录活性.结果 扩增的HPSE启动子核心片段长度为561 bp,序列分析与GenBank收录一致,含有3个SP1、4个Ets相关元件、2个早期生长反应基因-1及E47、N-myc和NGFI-p300等TFBS各1个.重组质粒pEGFP-HP经酶切和测序鉴定与预期结果 一致.荧光显微镜观察显示,转染pEGFP-1细胞中均无荧光表达;转染pEGFP-N1细胞均有强荧光表达;转染pEGFP-Hp质粒的ECV几乎无荧光表达,HepG2和Hep2细胞有较强荧光,K562细胞仅有较弱荧光.流式细胞术检测表明,pEGFP-Hp在ECV、HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3.9%、21.3%、10.8%和6.5%,pEGFP-N1转染率分别为17.1%、24.0%、14.0%和11.0%,二者比值均小于1.结论 成功构建了由HPSE核心启动子驱动的真核细胞表达载体.该载体可在肿瘤细胞特异性表达,但其活性需进一步加强.     

人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体构建、鉴定及功能分析

目的构建人乙酰肝素酶（HPSE）基因启动子驱动的肿瘤细胞特异性表达载体，并分析其活性。方法PCR扩增人类基因组DNAHPSE启动子核心片段，并测序鉴定和分析转录因子结合位点（TFBS）。双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点，构建肿瘤细胞表达载体pEGFP-Hp。将经酶切和测序鉴定的重组质粒pEGFP—Hp及质粒pEGFP-1（阴性对照）和pEGFP—N1（阳性对照）分别转染正常人脐静脉内皮细胞（ECV）和不同的肿瘤细胞（肝癌细胞HepG2、喉癌上皮细胞Hep2和慢性白血病K562细胞）。荧光显微镜观察和流式细胞术分析其促转录活性。结果扩增的HPSE启动子核心片段长度为561bp，序列分析与GenBank收录一致，含有3个SPI、4个Ets相关元件、2个早期生长反应基因-1及E47、N—mye和NGFI—p300等TFBS各1个。重组质粒pEGFP—Hp经酶切和测序鉴定与预期结果一致。荧光显微镜观察显示，转染pEGFP-1细胞中均无荧光表达；转染pEGFP—N1细胞均有强荧光表达；转染pEGFP—Hp质粒的ECV几乎无荧光表达，HepG2和Hep2细胞有较强荧光，K562细胞仅有较弱荧光。流式细胞术检测表明，pEGFP—Hp在ECV、HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3．9％、21．3％、10．8％和6．5％，pEGFP-N1转染率分别为17．1％、24．0％、14．0％和11．0％，二者比值均小于1。结论成功构建了由HPSE核心启动子驱动的真核细胞表达载体，该载体可在肿瘤细胞特异性表达，但其活性需进一步加强。     

人乙酰肝素酶基因增强子的初步筛选与鉴定

目的：初步筛选并鉴定出人乙酰肝素酶（ HPSE ）基因内具有增强子（ enhancer , enh ）活性的DNA片段。方法：增加Kpn I、Sal I酶切位点,将含有报告基因增强型绿色荧光蛋白（pEGFP）质粒载体pEGFP-N1改造为pEGFP-MU。选取HPSE基因5′端启动子上、下游的DNA序列并分为10个片段,分别命名为enhx （ x分别等于1、2、3……10）,每段长1200 bp,相邻两段间重复200 bp。分别扩增上述10个片段和猿猴病毒40（SV40）增强子序列,分别插入pEGFP-MU,以构建重组质粒pEGFP-MU-enhx和pEGFP-MU-SV40e,并用脂质体2000转染肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞SGC-7901,荧光显微镜和流式细胞仪分析上述候选序列对启动子（ CMV）转录活性的影响。结果：琼脂糖凝胶电泳和DNA测序结果显示,PCR克隆序列与GeneBank中序列完全一致。酶切电泳和测序结果显示,重组质粒pEGFP-MU-enhx和pEGFP-MU-SV40 e构建符合要求。瞬时细胞转染、荧光显微镜和流式细胞仪分析发现,重组质粒pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8在人BEL-7402、SGC-7901细胞中表达增强,与阳性对照质粒pEGFP-MU-SV40e相似,其余重组质粒表达较弱。结论：成功克隆人HPSE基因10个增强子候选序列片段,并正确构建重组质粒pEGFP-MU-enhx;其中第6、7和8候选片段可能具有增强子活性。本研究为后续进一步筛选和鉴定有活性的增强子序列缩小了搜寻范围,并为将来利用HPSE增强子进行肿瘤基因治疗提供了实验依据。     

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活SV40病毒早期启动子／增强子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒核心蛋白的反式激活作用。方法：以重组质粒pcDNA3-core（含有HCV核心蛋白编码基因）转染HepG2细胞,从转录和翻译水平鉴定核心蛋白的瞬时表达;与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞,检测β－半乳糖苷酶表达活性,酶的活性反映了表达的核心蛋白对SV40病毒早期启动子／增强子功能的影响。结果：质粒pcDNA3-core在HepG2 细胞瞬时表达核心蛋白,共转染实验中pcDNA3-core组β－半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的5．4倍。结论：HepG2细胞中表达的核心蛋白具有反式激活SV40早期启动子／增强子的特性,为进一步以差异显示逆转聚合酶链反应技术克隆相关基因提供实验基础。     

含HSV-TK基因的真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的　构建AFP增强子CMV启动子调控下的HSV -TK真核表达质粒用于肝细胞癌的靶向基因治疗。方法　采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增AFP基因增强子最小的功能片断 ,插入pcDNA3.1-LUC质粒的BglII位点 ,从而构建重组表达质粒 pAFP -LUC。HSV -TKcDNA全长序列替换pAFP -LUC质粒中EcoRI位点的LuciferasecDNA全序列构建重组表达质粒 pAFP -TK。质粒 pAFP -LUC采用脂质体法转染AFP阳性的肝癌细胞系HepG2及AFP阴性的非肝癌细胞系HeLa ,用Luciferase分析试剂盒分析Luciferase的表达情况。结果　PCR扩增所得AFP增强子片段的长度和序列通过琼脂糖凝胶电泳、DNA测序得到证实。采用限制性内切酶酶切及PCR方法证实质粒pAFP -LUC中插入的AFP增强子大小、位置及方向均正确。酶切后凝胶电泳分析证实HSV -TK已成功地定向克隆入真核表达载体中。Luciferase报道基因的表达受AFP增强子的调控 ,在AFP阳性肝癌细胞HepG2中高效表达 ,而在AFP阴性的HeLa细胞中表达很低 ,这种差异具有显著性 ,P <0 .0 5。结论　AFP增强子CMV启动子调控的HSV -TK真核表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的特异性表达为肝细胞癌的靶向基因治疗提供了实验基础。     

电穿孔转染法与脂质体转染法对K562和HepG2细胞转染效率的影响

目的通过对电穿孔转染法和脂质体转染法在K562、HepG2细胞中的转染效率比较,探索最佳的细胞转染方法和条件。方法以K562、Hep G2细胞为研究对象,采用电穿孔转染法和脂质体转染法分别转染带有绿色荧光的质粒PEGFP-N1和无荧光的质粒p CDNA3.1、p CDNA3.1-EOS基因,荧光显微镜下观察PEGFP-N1转染效果,计算转染效率;收集各培养组细胞,裂解后提取蛋白,采用Western blot方法检测基因转染后的蛋白表达。结果当脉冲20 ms、电阻90Ω、电压150 V时进行电穿孔,转染质粒PEGFP-N1,K562细胞可以得到较高的转染率;当脉冲20 ms、电阻90Ω、电压250 V时,转染质粒PEGFP-N1,Hep G2细胞可以得到较高的转染效率。在K562细胞和Hep G2细胞中,电穿孔转染法的转染效率均显著高于脂质体转染法(P<0.05)。电穿孔转染法转染PEGFP-N1后K562细胞和Hep G2细胞的存活率显著低于脂质体法(P<0.05)。Western blot结果显示电穿孔转染法蛋白表达量高于脂质体转染法(P<0.05)。结论最佳条件下电穿孔转染法是一种高效的基因转染方法,对比较难转染的悬浮细胞效果更佳。     

带GFP的启动子鉴定质粒的构建及在HCV启动子鉴定中的应用

目的:利用已有质粒构建带GFP报告基因的启动子鉴定质粒,并用此质粒鉴定丙型肝炎病毒5非翻译区(HCV5'-UTR)启动基因表达的活性.方法:用限制性内切酶将质粒pEGFP-N1上的EGFP基因片断切下,与用相同酶切去除荧光素酶基因片断的PGL3 enhancer质粒大片断连接,得到带GFP的启动子鉴定质粒pEGFP enhancer.HCV 5'-UTR片断用PCR方法获得,插入pEGFP enhancer的多克隆区,构建HCV 5'-UTR驱动GFP表达质粒.应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察荧光.结果:成功构建带GFP报告基因的启动子鉴定质粒,并在此基础上构建了HCV 5'-UTR启动GFP表达的质粒.前者转染HepG2细胞后,几乎无GFP表达,而后者观察到较强的绿色荧光.结论:该实验构建的带GFP报告基因的启动子鉴定质粒本底表达低,可用于真核启动子的鉴定.HCV 5'-UTR可以启动报告基因的表达,具有启动子活性.     

应用逆转录病毒载体构建荧光标记的K562细胞模型

目的:采用逆转录病毒载体系统构建荧光标记的K562细胞模型.方法:将增强绿色荧光蛋白(EGFP)cDNA插入载体pCMV-hyg,构建重组质粒pCMV-EGFP-hyg,并与逆转录病毒载体质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞生产重组逆转录病毒,感染K562细胞;通过Hyg筛选建立EGFP自身标记的K562细胞模型.应用流式细胞仪及荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达.比较EGFP-K562细胞与K562细胞生长曲线.通过外周血淋巴细胞的NK活性试验观察EGFP-K562能否用于有关实验研究.结果:应用EGFP cDNA成功构建pCMV-EGFP-hyg,与逆转录病毒载体系统质粒共转染293T细胞后产生含EGFP的重组逆转录病毒,48 h收集的病毒滴度达1.5×106 CFU/ml.重组逆转录病毒感染K562细胞后,经Hyg筛选,98%以上稳定表达EGFP.长期培养20代,EGFP表达稳定,对K562细胞生长无影响.以EGFP-K562为靶细胞的NK活性试验显示40:1效靶比,孵育4 h最敏感.结论:应用逆转录病毒载体系统成功构建稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP-K562细胞模型,NK活性试验提示EGFP-K562可用作实验研究的新型靶细胞模型.     

细胞分裂调控基因MAD2与GFP融合的真核表达质粒的构建及表达

目的：构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中表达.方法：通过RT-PCR扩增,获得MAD2基因的完整序列.将此片断插入pEGFP-N1载体多克隆位点区,构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒.应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察表达的绿色荧光.结果：成功构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达.结论：该载体的成功构建,为研究MAD2基因在细胞分裂中的功能及定位建立了有效的观察体系.     

反向前列腺特异性膜抗原增强子启动子调控重组质粒的构建及增强子调控活性的比较

目的 探讨前列腺特异性膜抗原（PSMA）启动子和增强子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性,了解增强子增强转录效率的能力。方法 采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中分别扩增PSMA增强子序列．将其按不同方向亚克隆到含有报告基因——绿色荧光蛋白（GFP）的重组质粒载体pEGFP—PSMAPPro脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察GFP在所转染的细胞的表达情况。结果 成功构建质粒pEGFP—PSMAE-P和pEGFP-PSMAE（r）-P,质粒转染结果显示PSMA表达阳性的LNCaP细胞中存在GFP的特异有效表达,增强子序列能使基因转录效率提高30倍,不同方向的增强子序列在增强转录效率方面具有同样效应。结论 反向PSMA增强子启动子调控GFP表达的重组质粒的构建证明该调控序列具有前列腺细胞特异性,增强子具有增强启动子转录效率的功能且没有方向性。     

增强型自杀基因载体治疗宫颈癌的体外实验研究

目的探讨运用增强子增强hTERT启动子转录活性后，调控双自杀融合基因CDTK载体对人宫颈癌HeLa细胞的体外杀伤作用。方法将SV40增强子、CMV增强子、CMV增强子／启动子及SV40-CMV双增强子分别与hTERT启动子组合构建成报告基因载体。转染HeLa细胞后用双荧光素酶系统分析其活性差异；然后构建pHr—SCT／CDTKG治疗载体转染HeLa细胞，用流式细胞仅检测转染效率，RT-PCR检测融合自杀基因mRNA表达，HPLC检测5-Fu浓度，MTT分析载体杀瘤的效果。结果HeLa细胞中增强子能使hTERT启动子活性提高6-13倍，其中SV40-CMV双增强子／hTERT启动子的活性最高，达到CMV增强子／启动子的近3倍；体外转染pHr—SCT／CDTKG后可检测到cDTK的mRNA的表达；细胞上清中5-Fu最高浓度为50．83ug／mL；当5-FC浓度为200ug／mL、GCV浓度为10ug／mL时，HeLa细胞的相对细胞存活率为48．7％。结论SV40-CMV双增强子联合hTERT启动子能高效靶向的调控CDTK融合自杀基因杀伤宫颈癌细胞，因而是一种很有前景的基因治疗宫颈癌的策略。     

携带HuIL-3基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

目的:构建携带人白细胞介素3（HuIL－3）cDNA的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：将HuIL－3cDNA克隆到逆转录病毒载体pMNSM的PL位点，构建SV40早期启动子驱动的载体pMNS－IL－3；从质粒pGEM．7Zf－AFPe中游离人甲胎蛋白（AFP）增强子核心序列，先克隆到pMNSM的PL位点上，再将HuIL－3cDNA片段克隆到PL位点上，构建出SV40早期启动子和AFP增强子驱动的人肝癌特异性表达载体PMNSA－IL－3。结论：该载体为肝癌特异性转基因治疗提供了一条途径。     

携带HuIL-3基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

应用HA方案（三尖杉酯硷联合阿糖胞苷）剂量个体化治疗23例老年人慢性粒细胞白血病（慢粒），完全缓解（CR）率为69．6％，CR平均所需15．4天，平均持续CR时间为34.3月，均显著高于单用马利兰／羟基脲组；骨髓抑制发生率为34.8％，但经间歇期后均恢复正常．bcr／ablmRNA阳性病例的CR率为85．7％（12／14）优于bcr／ablmRNA阴性病例（0／3）．本资料显示：HA方案剂量个体化治疗老年人慢粒缓解率高，CR所需时间短，维持CR时间长，副作用小，是老年人慢粒治疗较满意方案．     

Survivin启动子的克隆及其在膀胱癌细胞BIU87中的活性鉴定

目的克隆Survivin启动子的有效片段,并检测其在人膀胱癌细胞株BIU87和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的转录活性。方法用PCR扩增Survivin基因的启动子片段,克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic,构建pGL3BSurvivin重组质粒,用脂质体法瞬时转染BIU87及SV-HUC-1中,检测Survivin启动子在细胞中的转录活性。同时构建含CMV启动子的pGL3BCMV重组质粒作为阳性对照。48h后收集转染细胞与荧光素酶底物反应,检测荧光素酶活性。结果成功克隆440 bp的Survivin基因启动子,并构建了携带有Survivin基因启动子的pGL3Basic真核表达载体,转染BIU87细胞后的荧光素酶活性为2 286.98±440.21,而SV-HUC-1荧光素酶活性为12.32±1.16,两者差异有统计学意义（〈0.01）。结论本实验成功克隆的Survivin启动子在BIU87细胞中表现出较高的肿瘤特异性活性,其有可能作为调控元件用于膀胱癌的靶向性基因治疗。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法：扩增HCV NS5A基因，构建HCV NS5A基因真核表达载体pcDNA3．1(-)—NS5A；并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，免疫印迹方法检测转染细胞中HCV NS5A蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3--promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：质粒pcDNA3．1(-)—NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCV NS5A蛋白，共转染实验中pcDNA3．1(-)—NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的3．8倍。结论：构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS5A蛋白反式激活的靶基因，深入阐明HCV NS5A蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供依据。     

携带HSV－tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因（ｐｇｋ）启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ｐＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮｐ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ｐＧＥＭ．７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ｐＭＮｐ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建成人肝癌特异型ｐＭＮＡＰ－ｔｋ逆转录病毒载体。结论：该载体对肝癌特异性前药转换基因治疗有重要意义。     

TGF- β 1/SMAD SIGNALING PATHWAY MEDIATES p5 3 -DEPENDENT APOPTOSIS IN HEPATOMA CELL LINES

HEPATOCELLULARcarcinoma(HCC)isoneofthemostcommonanddevastatingmalignanttumors,withanestimatedannualincidenceofonemillioncases,mainlyinAfricanandAsianregions.Inrecentyears,importantadvanceshavebeenmadeinunder standingthemolecularpathogenesisofHCC,butonlyli…