人乙酰肝素酶基因增强子的初步筛选与鉴定

目的：初步筛选并鉴定出人乙酰肝素酶（ HPSE ）基因内具有增强子（ enhancer , enh ）活性的DNA片段。方法：增加Kpn I、Sal I酶切位点,将含有报告基因增强型绿色荧光蛋白（pEGFP）质粒载体pEGFP-N1改造为pEGFP-MU。选取HPSE基因5′端启动子上、下游的DNA序列并分为10个片段,分别命名为enhx （ x分别等于1、2、3……10）,每段长1200 bp,相邻两段间重复200 bp。分别扩增上述10个片段和猿猴病毒40（SV40）增强子序列,分别插入pEGFP-MU,以构建重组质粒pEGFP-MU-enhx和pEGFP-MU-SV40e,并用脂质体2000转染肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞SGC-7901,荧光显微镜和流式细胞仪分析上述候选序列对启动子（ CMV）转录活性的影响。结果：琼脂糖凝胶电泳和DNA测序结果显示,PCR克隆序列与GeneBank中序列完全一致。酶切电泳和测序结果显示,重组质粒pEGFP-MU-enhx和pEGFP-MU-SV40 e构建符合要求。瞬时细胞转染、荧光显微镜和流式细胞仪分析发现,重组质粒pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8在人BEL-7402、SGC-7901细胞中表达增强,与阳性对照质粒pEGFP-MU-SV40e相似,其余重组质粒表达较弱。结论：成功克隆人HPSE基因10个增强子候选序列片段,并正确构建重组质粒pEGFP-MU-enhx;其中第6、7和8候选片段可能具有增强子活性。本研究为后续进一步筛选和鉴定有活性的增强子序列缩小了搜寻范围,并为将来利用HPSE增强子进行肿瘤基因治疗提供了实验依据。     

人乙酰肝素酶核心启动子的扩增及序列分析

目的:扩增乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)基因启动子核心片段,并进行序列分析。方法:提取人类基因组DNA,PCR扩增HPSE基因启动子,T-A克隆、酶切鉴定,然后进行测序比对,分析其中转录因子结合位点。结果:从人类基因组DNA中扩增出HPSE基因启动子片段,酶切鉴定与预期结果吻合,长度为561bp,该启动子碱基序列与数据库GenBank完全一致,并含有3个Sp1、4个ERE和2个ERG1转录因子结合位点。结论:成功克隆了HPSE核心启动子,并含有维持HPSE转录活性的转录因子结合位点,为后续研究奠定了基础。     

人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体构建、鉴定及功能分析

目的 构建人乙酰肝素酶(HPSE)基因启动子驱动的肿瘤细胞特异性表达载体,并分析其活性.方法 PCR扩增人类基因组DNA HPSE启动子核心片段,并测序鉴定和分析转录因子结合位点(TFBS).双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点,构建肿瘤细胞表达载体pEGFP-Hp.将经酶切和测序鉴定的重组质粒pEGFP-Hp及质粒pEGFP-1(阴性对照)和pEGFP-N1(阳性对照)分别转染正常人脐静脉内皮细胞(ECV)和不同的肿瘤细胞(肝癌细胞HepG2、喉癌上皮细胞Hep2和慢性自血病K562细胞).荧光显微镜观察和流式细胞术分析其促转录活性.结果 扩增的HPSE启动子核心片段长度为561 bp,序列分析与GenBank收录一致,含有3个SP1、4个Ets相关元件、2个早期生长反应基因-1及E47、N-myc和NGFI-p300等TFBS各1个.重组质粒pEGFP-HP经酶切和测序鉴定与预期结果 一致.荧光显微镜观察显示,转染pEGFP-1细胞中均无荧光表达;转染pEGFP-N1细胞均有强荧光表达;转染pEGFP-Hp质粒的ECV几乎无荧光表达,HepG2和Hep2细胞有较强荧光,K562细胞仅有较弱荧光.流式细胞术检测表明,pEGFP-Hp在ECV、HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3.9%、21.3%、10.8%和6.5%,pEGFP-N1转染率分别为17.1%、24.0%、14.0%和11.0%,二者比值均小于1.结论 成功构建了由HPSE核心启动子驱动的真核细胞表达载体.该载体可在肿瘤细胞特异性表达,但其活性需进一步加强.     

人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体构建、鉴定及功能分析

目的构建人乙酰肝素酶（HPSE）基因启动子驱动的肿瘤细胞特异性表达载体，并分析其活性。方法PCR扩增人类基因组DNAHPSE启动子核心片段，并测序鉴定和分析转录因子结合位点（TFBS）。双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点，构建肿瘤细胞表达载体pEGFP-Hp。将经酶切和测序鉴定的重组质粒pEGFP—Hp及质粒pEGFP-1（阴性对照）和pEGFP—N1（阳性对照）分别转染正常人脐静脉内皮细胞（ECV）和不同的肿瘤细胞（肝癌细胞HepG2、喉癌上皮细胞Hep2和慢性白血病K562细胞）。荧光显微镜观察和流式细胞术分析其促转录活性。结果扩增的HPSE启动子核心片段长度为561bp，序列分析与GenBank收录一致，含有3个SPI、4个Ets相关元件、2个早期生长反应基因-1及E47、N—mye和NGFI—p300等TFBS各1个。重组质粒pEGFP—Hp经酶切和测序鉴定与预期结果一致。荧光显微镜观察显示，转染pEGFP-1细胞中均无荧光表达；转染pEGFP—N1细胞均有强荧光表达；转染pEGFP—Hp质粒的ECV几乎无荧光表达，HepG2和Hep2细胞有较强荧光，K562细胞仅有较弱荧光。流式细胞术检测表明，pEGFP—Hp在ECV、HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3．9％、21．3％、10．8％和6．5％，pEGFP-N1转染率分别为17．1％、24．0％、14．0％和11．0％，二者比值均小于1。结论成功构建了由HPSE核心启动子驱动的真核细胞表达载体，该载体可在肿瘤细胞特异性表达，但其活性需进一步加强。     

人肝癌组织中乙酰肝素酶基因的克隆与序列分析

目的: 研究乙酰肝素酶在人肝癌细胞生长和转移中的作用,并自人肝癌组织中克隆该酶cDNA全长编码片段. 方法: 提取人肝癌细胞总RNA,以RT-PCR方法获取了乙酰肝素酶cDNA片段,将其与pGEM-T Easy载体连接,进行克隆及酶切鉴定. 结果: 序列分析表明,与GenBank中的人乙酰肝素酶全长cDNA序列比较,仅16个碱基不同,同源性为0.991. 结论: 自人肝癌组织中成功克隆了乙酰肝素酶cDNA全长编码片段.     

乙酰肝素酶研究进展

乙酰肝素酶是目前发现的哺乳动物细胞中唯一能切割细胞外基质中硫酸肝素蛋白多糖侧链的内源性糖苷酶。本文介绍了乙酰肝素酶的分子结构、功能、分子特性、基因定位和酶的活性调控,并对该酶促进血管生成、肿瘤浸润、参与胚胎和组织发育等机制进行了综述。     

人卵巢癌组织乙酰肝素酶基因的全长扩增及真核载体的构建

目的通过基因工程技术,扩增出乙酰肝素酶基因全长,构建其真核载体。为进一步研究乙酰肝素酶与卵巢癌浸润转移的关系打下基础。方法选取浆液性卵巢癌组织作为模板提取人卵巢癌组织总mRNA,RT-PCR技术扩增cDNA,利用PCR技术进行乙酰肝素酶基因全长的扩增。将其与真核表达载体pcDNA3.1连接,进行克隆及酶切和测序鉴定。结果成功扩增出目的基因全长,并经测序验证其同源性达100%。结论采用基因工程技术成功从恶性卵巢癌组织中扩增出HPSE全长并构建了其真核表达载体。     

乙酰肝素酶在腹主动脉瘤发病中的作用

目的 了解乙酰肝素酶在腹主动脉瘤（AAA）发病中的作用,探讨AAA新的发病机制。方法 选取20例人体肾下AAA、5例正常腹主动脉（NA）及5例原发性肝细胞癌（HCC）组织标本,采用Northern杂交、免疫组织化学及计算机图像分析技术,检测乙酰肝素酶及其底物硫酸乙酰肝素酶蛋白多糖（HSPG）的表达以及微血管增生水平。结果 AAA组织乙酰肝素酶水平明显高于NA（P＜0．01）,而相当于HCC（P＞0．05）;HSPG表达则与之相反,与乙酰肝素酶水平及微血管密度均呈显著负相关。乙酰肝素酶与HSPG在腹主动脉（瘤）均以内外膜分布为主。结论 乙酰肝素酶在基质水平参与腹主动脉结构损伤与重构,促进AAA形成。     

乙酰肝素酶与细胞侵袭

侵袭性细胞主要包括肿瘤细胞和免疫细胞 ,肿瘤细胞实现扩散、转移以及免疫细胞趋向炎症反应区都必须首先穿越由细胞外基质 (ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ ,ＥＣＭ)和基底膜组成的屏障。该屏障主要由两种成分构成 :一是结构蛋白 ,包括胶原、层粘素、纤维结合素和玻璃体结合素等 ;二是糖氨聚糖 ,其主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖 (ｈｅｐａｒａｎｓｕｌｆａｔｅｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ,ＨＳＰＧ)。ＨＳＰＧ主要由一个蛋白核心和数个与之共价连接的线性硫酸乙酰肝素 (ｈｅｐａｒａｎｓｕｌｆａｔｅ ,ＨＳ)侧链组成[1] 。起初认…     

乙酰肝素酶三质粒重组慢病毒系统的构建

目的：成功构建了HPSE基因的慢病毒表达载体。方法：用PCR法扩增HPSE cDNA与慢病毒载体pWPI连接后测序并经BLAST检索，证实后转染293T细胞，48h后提取mRNA，RT—PCR检验HPSE基因表达情况。结果：重组慢病毒质粒HPSEpWPI测序结果经BLAST证实与HPSE基因的同源性达99％且转染293T后有HPSE基因的表达。结论：成功的构建了HPSE基因的重组慢病毒系统，为今后的HPSE靶向治疗奠定了基础。     

小鼠Alb e／p序列与肝癌细胞核蛋白之间的相互作用

目的：研究肝癌组织特异性基因治疗的机理。方法：从小鼠肝细胞、肝癌细胞和黑色素瘤细胞中分别提取核蛋白组分和胞浆蛋白，分别与小鼠白蛋白增强子／启动子（Ａｌｂｅ／ｐ）、白蛋白增强子（Ａｌｂｅ）和白蛋白启动子（Ａｌｂｐ）结合。结果：Ｂａｎｄ－Ｓｈｉｆｔ试验和竞争试验发现某些肝癌细胞核蛋白组分能与Ａｌｂｅ／ｐ特异结合，其中与Ａｌｂｅ和Ａｌｂｐ特异结合的核蛋白在不同的组分中，而肝癌细胞胞浆蛋白和黑色素瘤细胞核蛋白不能与Ａｌｂｅ／ｐ结合。结论：提示肝癌细胞核中能与Ａｌｂｅ和Ａｌｂｐ作用的核蛋白是应用Ａｌｂｅ／ｐ调控目的基因于肝癌细胞中特异表达的基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活SV40病毒早期启动子／增强子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒核心蛋白的反式激活作用。方法：以重组质粒pcDNA3-core（含有HCV核心蛋白编码基因）转染HepG2细胞,从转录和翻译水平鉴定核心蛋白的瞬时表达;与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞,检测β－半乳糖苷酶表达活性,酶的活性反映了表达的核心蛋白对SV40病毒早期启动子／增强子功能的影响。结果：质粒pcDNA3-core在HepG2 细胞瞬时表达核心蛋白,共转染实验中pcDNA3-core组β－半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的5．4倍。结论：HepG2细胞中表达的核心蛋白具有反式激活SV40早期启动子／增强子的特性,为进一步以差异显示逆转聚合酶链反应技术克隆相关基因提供实验基础。     

Enhancement of DNA vaccine-induced immune responses by a 72-bp element from SV40 enhancer

Background Although DNA vaccine is considered as the next generation of vaccine, most DNA vaccine candidates are still suffering from the relatively weak immunogenicity despite the increased dosage of plasmid DNA administered. In order to enhance the immune responses elicited by a codon-optimized HIV gag DNA vaccine, a modified plasmid vector pDRVI1.0 and a booster immunization with replicating Tiantan vaccinia （RTV） strain expressing the same gene were employed. Methods Vector pDRVI1.0 was constructed through inserting the 72-bp element from the SV40 enhancer, which was reported promoting nuclear transport of plasmid DNA, to the upstream of cytomegalovirus enhancer/promoter region of the plasmid vector pVR1012. Gene expression levels from expression plasmids based on pDRVI1.0 and pVR1012 were tested. Humoral and cellular immune responses induced by DNA vaccine alone or DNA prime-RTV boost regimen were determined in mice. Results It was shown that the 72-bp element significantly enhanced the gene expression level in non-dividing cells. gag-specific humoral and cellular immune responses induced by DNA vaccination were both significantly improved, while the Thl/Th2 balance was not obviously affected by the 72-bp element. RTV boosting further significantly enhanced DNA vaccine-palmed antibody and T cell responses in a Thl-biased manner. Conclusions The 72-bp SV40 enhancer element should be included in the DNA vaccine vector and RTV strain is a very efficient live vector for boosting immunization.     

肝癌细胞核蛋白对白蛋白增强子／启动子序列的体外转录调控作用

目的：研究肝癌细胞核蛋白调控白蛋白＂持家基因＂转录调控序列对目的基因转录的作用。方法：分别从小鼠肝癌细胞、肝细胞和黑色素瘤细胞中提取核蛋白组分,用于体外启动白蛋白增强子／启动子的转录作用。结果：发现某些肝癌细胞和肝细胞核蛋白组分具有明显的转录作用,而细胞浆蛋白和其他肿瘤核蛋白组分没有转录作用,将同一肝癌细胞某些核蛋白组分合并可使转录活性增强。结论：本研究在基因转录调控水平部分解释了应用白蛋白增强子／启动子调控目的基因于肝癌细胞中特异表达的机理。     

乙酰肝素酶shRNA双基因共表达真核载体的构建和筛选

目的：构建并筛选有效的、编码2条shRNA的乙酰肝素酶（Hpa）特异性基因真核表达载体．方法：分别设计、化学合成6对寡核苷酸单链,经退火、连接和磷酸化后得到Hpa shRNA双链,将两两随机问隔4～8个碱基后定向克隆入带有各自的U6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白（green fluoreseent protein,EGFP）基因和Neo基因的pGenesil-1中,构建3条含两段Hpa基因shRNA的pGenesil-1-Hpa—shRNA真核表达载体,转染卵巢癌细胞株SKOV3,流式细胞仪和荧光显微镜下观察转染效率,免疫组化分析Hpa蛋白表达．结果：酶切与测序证实pGenesil-1-HPSE—shRNA构建成功,无任何碱基突变,3组质粒转染细胞均有Hpa表达的变化,3种不同shRNA质粒转染细胞后Hpa蛋白表达有明显差别．结论：构建并筛选了针对Hpa特异性的双基因shRNA真核表达载体pGenesil-1-Hpa-shRNA．     

携带HuIL-3基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

目的:构建携带人白细胞介素3（HuIL－3）cDNA的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：将HuIL－3cDNA克隆到逆转录病毒载体pMNSM的PL位点，构建SV40早期启动子驱动的载体pMNS－IL－3；从质粒pGEM．7Zf－AFPe中游离人甲胎蛋白（AFP）增强子核心序列，先克隆到pMNSM的PL位点上，再将HuIL－3cDNA片段克隆到PL位点上，构建出SV40早期启动子和AFP增强子驱动的人肝癌特异性表达载体PMNSA－IL－3。结论：该载体为肝癌特异性转基因治疗提供了一条途径。