IL-6下调血管内皮细胞组织因子抑制物表达

目的:观察IL-6对脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达组织因子途径抑制物(TFPI)的影响.方法:应用胰酶消化HUVECs并进行传代培养,用生长良好的第2、3代细胞进行试验.同时应用CCK-8测定不同浓度的IL-6(0.125～2.0 ng/ml,实验组)刺激后细胞活性变化,对照组给予培养液;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞内TFPI mRNA水平.结果:与对照组相比,IL-6(0.125～0.5 ng/ml)对细胞活性没有显著影响(P>0.05);IL-6增加到1 ng/ml后,作用12 h后细胞活力开始下降.IL-6(0.5 ng/ml)作用6～24 h显著下调细胞TFPI mRNA表达(P<0.05),6 h时抑制效果最强(TFPI mRNA/GAPDH mRNA均值仅为0.191),以后抑制效应渐减弱,48 h达到正常水平(TFPI mRNA/GAPDH mRNA均值为0.399).结论:提示IL-6(0.5 ng/ml)对HUVECs的活性不造成直接的影响,同时IL-6(0.5 ng/ml)在6～24 h内可抑制HUVECs的TFPI mRNA表达而诱发凝血系统失衡,这可能与急性炎性反应时相的血液凝固和血栓形成有关.     

益母草对人脐静脉内皮细胞组织因子转录及表达的影响

目的 探讨益母草(Leonurus Heterophyllus Sweet,LHS)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)组织因子(TF)表达和转录的影响.方法 HUVECs的培养按Jaffe法,选用第2代细胞进行试验.测定不同浓度LHS处理前后组织因子表达,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TF mRNA水平.结果 LHS对HUVECs TF活性及TFmRNA转录的影响与正常对照组相比差异有明显统计学意义(P＜0.01).结论 LHS能下凋HUVECs TF的表达,干预HUVECsTFmRNA的转录.     

IL-6诱导血管内皮细胞纤溶相关蛋白的表达

目的:观察IL-6对脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)表达组织纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)的影响.方法:用生长良好的第2、3代HUVECs细胞进行实验,用CCK-8测定IL-6(0.125、0.25、0.5、1.2 ng/ml)作用前后细胞活性;用发色底物法测定0.5 ng/ml IL-6组和对照组(不加IL-6)培养上清液中tPA、PAI-1活性;进一步用RT-PCR检测细胞内tPA和PAI-1 mRNA水平.结果:与对照组相比, IL-6(≤0.5 ng/ml)对细胞增殖活性的影响无差异性.0.5 ng/ml IL-6组tPA活性在12～72 h显著升高(P<0.05),且显著上调tPA mRNA,12 h达到峰值,以后渐降,48 h mRNA达正常水平.而IL-6组PAI-1活性与PAI-1 mRNA表达与对照组无差异性.结论: IL-6可活化内皮细胞,显著上调HUVECs的tPA mRNA的转录和tPA分泌,诱发纤溶系统活化,而对PAI-1 mRNA或PAI-1活性无影响.IL-6的这种效应在炎症反应的病理生理过程中可能发挥重要作用.     

联胺对人脐静脉内皮细胞中IL-8表达及NF-kB蛋白活化的影响

目的 探讨联胺对培养的人脐静脉内皮细胞表达IL-8及核因子-κB活化的影响.方法 酶联免疫吸附法检测IL-8蛋白的表达,逆转录聚合酶链反应法检测IL-8mRNA的表达,细胞免疫化学法观察NF-κB的活化.结果 联胺(1、5和10μmol/L)可诱导IL-8在蛋白及mRNA水平表达,与对照组差异有显著性意义(P＜0.05),且与联胺呈浓度依赖性.联胺(5μmol/L)作用人脐静脉内皮细胞30 min后发现NF-κB从胞质向胞核转移,60 min达高峰,持续到120 min.结论 联胺能诱导IL-8在蛋白及mRNA水平表达,其机制可能是通过NF-κB活化实现的.     

联胺对人脐静脉内皮细胞中IL-8表达及NF-κB蛋白活化的影响

目的探讨联胺对培养的人脐静脉内皮细胞表达IL-8及核因子-κB活化的影响。方法酶联免疫吸附法检测IL-8蛋白的表达,逆转录聚合酶链反应法检测IL-8mRNA的表达,细胞免疫化学法观察NF-κB的活化。结果联胺（1、5和10μmol/L）可诱导IL-8在蛋白及mRNA水平表达,与对照组差异有显著性意义（P〈0.05）,且与联胺呈浓度依赖性。联胺（5μmol／L）作用人脐静脉内皮细胞30min后发现NF-κB从胞质向胞核转移,60min达高峰,持续到120min。结论联胺能诱导IL-8在蛋白及mRNA水平表达,其机制可能是通过NF-κB活化实现的。     

健心颗粒对血管内皮细胞KLF4表达的影响

目的观察健心颗粒对人脐静脉血管内皮细胞炎症损伤的干预作用。方法通过炎症因子TNF—α诱导人脐静脉内皮细胞建立内皮细胞损伤模型,随机分为正常组、健心颗粒组、TNF-α组、TNF-α加健心颗粒组,用RT—PCR、Western—Blot、免疫组化法检测脐静脉内皮细胞Kruppel因子4（KLF4）表达的变化。结果与正常组比较,TNF-α刺激后,KLF4表达水平明显升高;健心颗粒干预后,KLF4表达水平下降。结论健心颗粒能够抑制激活的人脐静脉血管内皮细胞中KLF4的表达。     

细胞因子对内皮细胞蛋白C受体的调节及参附注射液的干预作用

目的观察肿瘤坏死因子-（TNF-）、白介素-1（IL-1）及白介素-6（IL-6）培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）内皮细胞蛋白C受体（EPCR）和磷酸化JNK（P-JNK）的表达,并探讨参附注射液对其的干预作用。方法分别采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白免疫印迹技术测定正常对照组、TNF-组、IL-1组、IL-6组、参附（TNF-）组、参附（IL-1）组及参附（IL-6）组培养的HUVECEPCRmRNA、蛋白及磷酸化JNK蛋白的表达。结果与正常对照组比较,TNF-组、IL-1组EPCRmRNA及EPCR蛋白含量均低（均〈0.05）,TNF-组、IL-1组磷酸化JNK蛋白含量均高（均〈0.01）。结论细胞因子TNF-、IL-1可以从基因、蛋白水平减少HUVEC上EPCR的表达,参附注射液可以调节细胞因子TNF-、IL-1对HUVEC上EPCR的表达的影响,其调节机制可能是通过JNKMAPK途径实现的。     

梓醇对内皮细胞炎症因子表达的影响

目的:研究梓醇(Catalpol)对高糖高脂诱导的人脐静脉血内皮细胞(HUVECs)炎症反应的影响。方法:体外培养人脐静脉血内皮细胞,用CCK-8法检测不同浓度梓醇溶液对HUVECs细胞增殖活性的影响。将细胞分为空白对照组、高糖高脂组(给予33mmol/L葡萄糖+500μmol/L棕榈酸作用48h)、高糖高脂+1 000mg/L梓醇预处理组(梓醇1 000mg/L预处理24h后,给予33mmol/L葡萄糖+500μmol/L棕榈酸作用48h,以下简称梓醇预处理组),收集细胞上清液,用ELISA检测上清液中的炎症因子TNF-α、IL-6的浓度。结果:梓醇作用于HUVECs细胞的最佳浓度为1 000mg/L。高糖高脂组中TNF-α和IL-6浓度较空白对照组均明显增高(t=7.03、6.68,P均<0.01)。与高糖高脂组比较,梓醇预处理组上清液中炎症因子TNF-α及IL-6浓度均下降(t=-2.87、-3.76,P均<0.05)。结论:高糖高脂可诱导血管内皮细胞炎症反应,而梓醇对高糖高脂诱导的炎症反应有一定的改善作用。     

半定量RT-PCR检测少量兔血管内皮细胞中特异mRNA的表达

目的：半定量检测体外培养的少量兔血管内皮细胞中特异ｍＲＮＡ的表达。方法：用Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ公司的快速微量ｍＲＮＡ提纯试剂盒从兔内皮细胞中直接提取出ｍＲＮＡ,并以此为模板,用半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术检测培养的兔血管内皮细胞中内皮素（ＥＴ－１）ｍＲＮＡ的相对含量。结果：从１０＾５个兔血管内皮细胞中提取出未降解的ｍＲＮＡ,Ａ２６０／Ａ２８０〉１．８;用半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术,测定出ＥＴ－     

不同浓度尿酸盐对血管内皮细胞炎症因子表达影响

目的观察不同浓度尿酸盐作用不同时间对血管内皮细胞炎症因子表达的影响,从而明确尿酸盐对心血管系统的损伤机制。方法取脐带静脉内皮细胞,分别用0、40、60、80、100mg/L的尿酸盐溶液刺激12、24、48、72h,ELISA方法测定细胞上清液中白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)和血小板活化因子(PAF)的水平。结果 40、60、80、100mg/L尿酸盐刺激细胞24、48、72h,其细胞上清液中IL-1、IL-6和PAF浓度均高于空白对照组,且随尿酸浓度增加及作用时间延长,三者浓度亦增加,差异有显著性(F=7.601～213.883,P<0.05);48～72h浓度呈递减趋势,但差异无显著性(P>0.05)。结论高尿酸血症为心血管疾病的危险因素之一,血管内皮细胞释放炎症因子的浓度与尿酸盐浓度及其作用时间有相关性。     

反义寡脱氧核苷酸对内皮细胞缺氧再复氧损伤组织因子表达的影响

目的研究反义寡脱氧核苷酸对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧再复氧损伤后组织因子(TF)基因转录和表达的影响。方法培养的HUVEC随机等分成为正常对照组、缺氧再复氧组、反义寡脱氧核苷酸转染组(AS/TF组)、正义寡脱氧核苷酸转染组(S/TF组)和错配寡脱氧核苷酸转染组(Sc/TF组)。设计合成针对人TF的反义寡脱氧核苷酸(AS/TF),同时设计TF的正义寡脱氧核苷酸(S/TF)的错配寡脱氧核苷酸(Sc/TF)作为对照。用SuperFectTransfectionReagent(SF)作载体,将AS/TF、S/TF和Sc/TF分别转染AS/TF组、S/TF组和Sc/TF组HUVEC,正常对照组和缺氧再复氧组HUVEC只加SF,不转染任何寡核苷酸。将缺氧再复氧组、AS/TF组、S/TF组和Sc/TF组HUVEC培养24h后,充入氮气,缺氧条件下培养2h,正常条件下培养1h,完成缺氧再复氧模型的制作。收集各组HUVEC,用发色底物法检测HUVEC表面TF的活性,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测HUVEC中的TF抗原(TF:Ag)。并用膨胀裂解法分离细胞核,进行细胞核连缀反应(Run-onreaction)后,Bio-dot狭线印迹杂交检测HUVEC中的TFmRNA。结果与未经缺氧再复氧的正常对照组HUVEC相比,经过缺氧再复氧的HUVEC表面TF活性明显增强(P<0.001),细胞裂解液中的TF:Ag也显著增多(P<0.001),AS/TF组HUVEC的TF活性和TF:Ag的增加幅度低于缺氧再复氧组、S/TF组以及Sc/TF组(P<0.05-0.01)。体外细胞核连缀反应后,Bio-dot狭线印迹杂交显示,HUVEC缺氧再复氧后TF基因的转录增强,AS/TF组HUVECTFmRNA的转录弱于缺氧再复氧组、S/TF组和Sc/TF组。结论HUVEC缺氧再复氧后,TF基因的转录和表达均显著增强,针对TF的反义寡脱氧核苷酸能够明显抑制HUVEC缺氧再复氧损伤后TF基因的转录和表达。提示TF反义寡脱氧核苷酸对于因TF水平升高所致的血栓性疾病可能有潜在的治疗作用。     

地塞米松对内毒素作用下人脐静脉内皮细胞表达组织因子、凝血酶调节蛋白和蛋白S的影响

目的观察地塞米松(DEX)对内毒素(LPS)作用于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后表达组织因子(TF)、凝血酶调节蛋白(TM)和蛋白S(PS)的影响.方法24孔板培养的第1～5代HUVEC,在含不同浓度LPS和DEX的无血清培养基中培养一定时间后裂解细胞,应用酶联免疫吸附法(ELISA)测定裂解液中的TF、TM和PS含量.结果在LPS刺激下,HUVEC表达TF的量呈剂量依赖性升高,在LPS0.1μg/ml下TF的表达量为对照组的4倍(P＜0.01),同时加入0.5 μg/ml和1.0 μg/ml DEX则可使TF的表达量由128.3±25.7 pg/105细胞分别降至94.9±19.4 pg/105细胞和98.8±7.8 pg/105细胞(P＜0.05);LPS(0.01～10μg/ml)可抑制HUVEC表达TM,在LPS 10 μg/ml下,TM表达量降至对照组的60%(P＜0.05).DEX可拮抗LPS抑制HUVEC表达TM的效应,0.1 μg/ml、0.5 μg/ml和1.0 μg/ml DEX可使LPS(10 μg/ml)作用下TM的表达量由0.282±0.014 ng/105细胞分别增至0.409±0.009、0.462±0.017和0.362±0.019 ng/105细胞(P＜0.05);LPS(0～10 μg/ml)可抑制HUVEC表达PS,在LPS浓度1.0 μg/ml及10 μg/ml时,PS的表达量分别为对照组的43%和38%(P＜0.01).DEX则拮抗LPS抑制HUVEC表达PS的效应,0.5 μg/ml DEX可使LPS刺激下PS的表达量由13.1±4.8%/2×105细胞增至48.5±10.2%/2×105细胞(P＜0.01).结论LPS促进HUVEC表达TF,抑制HUVEC表达TM和PS.DEX能部分拮抗上述作用,提示DEX可能纠正内毒素血症时的高凝状态.     

大鼠狭窄血管内皮细胞组织因子表达的检测

目的研究大鼠血管狭窄处内皮细胞组织因子(tissue factor,TF)的表达规律。方法将45只SD大鼠(重量320±18.5 g)随机分为对照组和颈动脉狭窄组,狭窄组又分为0.25、0.5、1、2、4、8、16、24 h,8个时相,套扎法建立左颈总动脉狭窄模型,应用数字减影血管造影和多普勒血流仪在体测定切应力及血流量。术后不同时相点用原位杂交和免疫组化法,检测TF的mRNA和蛋白表达。应用图像分析系统,测定内膜平均灰度,进行统计学分析。结果正常对照组内皮细胞TF的mRNA转录和蛋白合成微弱;狭窄15 min后,内皮细胞胞浆TF基因mRNA转录和蛋白合成升高,与对照组比较均有显著性差异(P0.01)。TF基因mRNA转录和蛋白合成,4 h达到峰值,与邻近组比较具有显著性差异(P0.01)。结论血管狭窄后,切应力能够早期诱导动脉狭窄处内皮细胞TF基因表达。     

肉桂酸对肿瘤坏死因子诱导血管内皮细胞组织因子表达的作用及其机制

目的:观察肉桂酸(CINN)对TNF-α诱导人脐静脉血管内皮细胞株ECV304表达组织因子(TF)的影响,并探讨其作用的细胞内信号传导机制。方法:内皮细胞培养采用RPMI-1640完全培养基;一期凝固法测总的细胞促凝活性(PCA):TFmRNA采用RT-PCR的方法检测;用免疫组织化学染色法观察NF-κB的变化;Western-blod方法检测胞浆中I-κB的变化。结果:(1)与对照组相比,TNF-α(1000u／ml)引起ECV304的PCA增加(P<0.01),但可以被TF单抗阻断,其阻滞作用随TF单抗的增加而增加(P<0.05),由此证明血管内皮细胞的PCA来自于TF。在给予TNF-α之前30min用不同浓度的CINN预处理ECV304细胞,可以明显抑制TNF-α(1000u／ml)刺激内皮细胞表达TF的作用,具有显著的量效关系(r=-0.953,P<0.05)。在500μg/ml时,CINN有轻度抑制TF基础表达的效应;但以CINN预处理ECV304,可使TNF-α刺激TF的活性下降90％(P<0.001);CINN也可显著降低受刺激的ECV304TFmRNA表达。(2)Western-blot发现TNF-α作用45min胞浆中I-κB减少最明显,CINN预处理后,I-κB的减少不明显;免疫组织化学染色发现TNFα作用1h可引起内皮细胞NF-κB从胞浆移入核内,CINN可抑制NF-κB的活化。结论:CINN抑制血管内皮细胞对TNFα诱导的TF表达,它是通过影响NF-κB的活化发挥作用的。     

β-氨基丙腈对VEGF诱导的体外培养HUVEC血管生成的影响

目的通过β-氨基丙腈（beta—aminopropionitrile,BAPN）来研究赖氨酰氧化酶（Lysyl Oxidase,LOX）对体外培养的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）血管生成的影响,并对其机制进行初步探讨。方法Northern Blot分析人脐静脉内皮细胞中LOX表达,纤维蛋白凝胶体外血管生成检测试剂盒检测血管内皮细胞生长因子和LOX抑制剂BAPN对人脐静脉内皮细胞血管生成的作用,Western Blot检测BAPN处理对MAPK、Akt和PLCγ1的影响。结果人脐静脉内皮细胞中有LOX表达;血管内皮细胞生长因子可促进血管生成,而BAPN可拮抗这种促进作用;BAPN处理后的人脐静脉内皮细胞磷酸化的MAKP表达减少。结论β-氨基丙腈可抑制由血管内皮细胞生长因子诱导的血管生成,提示LOX可能对血管生成有促进作用,其机制是影响信号传导通路中磷酸化的MAKP表达。     

结缔组织生长因子在硬皮病患者皮损中的表达及其作用探讨

目的 探讨结缔组织生长因子(CTGF)在硬皮病(SD)发病机制中的作用及其与SD分型、分期的关系.方法 分别采用原位RT-PCR和免疫组化SABC法检测36例SDC其中系统性硬化疗(SSc)29例,局限性SD 7例;水肿硬化期28例,萎缩期8例]皮损中CTGF mRNA与蛋白的表达,并以20例正常皮肤组织作为对照.结果 SD组CTGF mRNA(阳性表达率:80.6%vs 40.0%,P=0.002;范围强度积分:2.67±1.33 vs 1.30±1.03,P<0.01与蛋白(阳性表达率,88.9 % vs 45.O%,P<0.001;范围强度积分:2.83 1.06 vs 1.40 1.10.P=0.001)表达阳性率和范围强度均高于正常对照组.SSc组发CTGFmRNA与蛋白表达阳性率和范围强度与局限性SD组间差异均无统计学意义.SD水肿硬化期皮损中CTGF mRNA(阳性表达率:89.3%vs 50.0%,P=0.030;范围强度积分:2.89±0.99 Vs 2.00±1.20,P=0.039)与蛋白(阳性表达率:96.4%vs 62.5%,P=0.028;范围强度积分:3.07士O.86 vs 2.00±1.31,P=0.009)表达阳性率和范围强度均高于萎缩期皮损.结论 CTGF在SD发病机制中起重要作用,与皮肤纤维化的发展密切相关,局限性SD和SSc发病机制可能相似.     

姜黄素对单个核细胞组织因子表达的影响

目的观察姜黄素(curcumin,CUR)对内毒素(lipopolysaccharide,LPS)诱导外周血单个核细胞(MNC)组织因子表达的影响。方法人外周血MNC的分离采用淋巴细胞分离液,MTT法检测细胞活性,细胞促凝活性的检测采用一期凝固法。结果 LPS可以剂量依赖性地诱导MNC组织因子的表达(20.1±5.1mU／10~6 cells vs 7.3±2.3 mU／10~6cells,P＜0.01),CUR可以显著抑制LPS诱导的细胞冻融液组织因子活性(14.6±3.6 mu／10~6 cells vs 24.5±6.4 mU／10~6cells,P＜0.01)。且CUR提前60 min加入MNC,其抑制作用最强。AngⅡ(10~(-7)M)可加强LPS诱导MNC细胞冻融液TF活性(50.7±12.3 mU／10~6ceHs,vs 24.1±7.2 mU／10~6cells,P＜0.01),CUR对该作用也有显著的抑制作用。结论姜黄素可显著抑制LPS以及Ang Ⅱ+LPS诱导的MNC组织因子的表达。     

川芎嗪对凝血酶诱导血管内皮细胞释放vWF组织因子途径抑制物及表达组织因子的影响

目的 :探讨川芎嗪对凝血酶诱导的血管内皮细胞释放vWF、组织因子途径抑制物及表达组织因子的影响。方法 :传代培养的新生牛主动脉内皮细胞取上清液测vWF、组织因子途径抑制物 ;细胞冻融液测组织因子的活性。结果 :①与对照相比凝血酶能明显促进内皮细胞表达组织因子 ( 1 2 .8± 2 .43,P <0 .0 0 1 )和释放vWF( 1 8.43± 3.2 0 ,P <0 .0 0 1 ) ,川芎嗪则抑制组织因子表达 ( 0 .52± 0 .1 3,P <0 .0 0 1 )抑制vWF释放 ( 1 3.3± 5.6,P <0 .0 1 ) ;②与对照相比 ( 2 .64± 0 .93) ,凝血酶明显抑制内皮细胞释放组织因子途径抑制物 ( 0 .81± 0 .52 ,P <0 .0 0 1 ) ,但川芎嗪无明显作用 ,也不能抑制凝血酶的效应。结论 :川芎嗪可以抑制内皮细胞表达组织因子和释放vWF。     

血管内皮生长因子基因在正常造血细胞中的表达

目的　探讨正常造血细胞中血管内皮生长因子 (VEGF)基因的表达水平。方法　TRIzol一步法提取正常外周血和非恶性骨髓标本单个核细胞及正常血小板的总RNA ;以 β2 -微球蛋白基因为内对照 ,逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)半定量分析VEGF基因的表达。结果　 2 2份外周血标本有 18份表达VEGF基因 ,表达率为81.8% ,其中 8份为中度表达 ;18份骨髓标本VEGF基因的表达率高达 94.4% (17/ 18) ,其中高度表达和中度表达分别为 5份与 6份 ;血小板有VEGF基因的低度表达。结论　正常造血细胞可表达VEGF基因 ,提示体内血管生成受到多种效应细胞的共同调节