丹皮酚通过抑制p38 MAPK/N-SMase2通路减少脂多糖诱导的THP-1细胞外泌体分泌

目的探讨丹皮酚抑制脂多糖诱导后THP-1细胞分泌外泌体的作用及机制。方法超速离心法提取外泌体,透射电镜(TEM)观察外泌体形态,Western blot检测标志蛋白Alix、TSG101、CD9和CD63,动态光散射检测外泌体粒径。CCK-8检测细胞存活率,BCA法检测外泌体蛋白量,Western blot检测N-SMase2、p-p38 MAPK蛋白水平。结果超速离心法获得的微囊泡结构物具有完整清晰茶托样膜,直径众数为130 nm,含标志性蛋白Alix、TSG101、CD9和CD63,鉴定为外泌体。丹皮酚(120、60及30μmol/L)可降低脂多糖(1 mg/L)诱导的THP-1细胞分泌外泌体,减少N-SMase2蛋白表达,抑制p38 MAPK磷酸化。结论丹皮酚抑制THP-1细胞外泌体分泌,该作用与抑制p38 MAPK/N-SMase2通路有关。     

类风湿关节炎滑膜成纤维细胞来源外泌体提取方法的研究

目的从外泌体分离的常用方法中探索获取高质量人滑膜成纤维细胞外泌体的有效方法。方法分别用超速离心法、尺寸排阻法和改良的聚合物沉淀法3种方法提取人滑膜成纤维细胞外泌体, 采用透射电镜、蛋白质印迹法(Western Blot)、纳米颗粒追踪分析(NTA)鉴定并比较外泌体的形态特征、粒径分布、浓度以及标志蛋白的表达水平。3组差异比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验, 以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果 3种方法均能成功提取得到外泌体, 透射电镜下均能观察到典型的"茶托状"结构, 蛋白质印迹法均能检测到标志蛋白肿瘤易感基因101(TSG101)、多配体聚糖结合蛋白1(Syntenin-1)、CD63的表达, 粒径主峰均符合30～150 nm范围。外泌体纯度方面:超速离心法杂质最少, 尺寸排阻法杂质中等, 而改良的聚合物沉淀法可观察到大量的聚合物颗粒和蛋白杂质。外泌体得率方面:3种方法得到的外泌体颗粒浓度差异有统计学意义(F=9.61, P=0.049), 改良的聚合物沉淀法得到的外泌体颗粒浓度高于超速离心法[(98.0±17.0)×1010个/ml和(11.6±...     

人结直肠癌LoVo/HCT116细胞来源外泌体促肿瘤迁移能力及Wnt3a/Wnt5a蛋白鉴定

目的鉴定人结直肠癌LoVo/HCT116细胞上清外泌体中Wnt3a和Wnt5a蛋白的表达情况,探讨外泌体对人结直肠癌迁移的调节作用。方法培养人结直肠癌LoVo/HCT116细胞,提取上述两种细胞的上清液抽提外泌体,运用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)、蛋白印迹法(Western blot)对外泌体进行鉴定。结果透射电镜下观察到外泌体具有膜结构,NTA检测提示粒径大小主要分布在94 nm左右,可检测到外泌体膜标志蛋白HSP70、CD63、CD9以及Wnt3a、Wnt5a表达。人结直肠癌LoVo/HCT116细胞外泌体能被人结直肠癌细胞摄取,并对人结直肠癌细胞迁移有促进作用。结论人结直肠癌LoVo/HCT116细胞能抽提得到外泌体,外泌体表达膜标志蛋白HSP70、CD63、CD9以及Wnt3a、Wnt5a蛋白。外泌体能被结直肠癌细胞吸收,而吸收了外泌体的人结直肠癌细胞其迁移能力增强。     

CD137信号通过外泌体传递活化T细胞核因子c1介导小鼠血管平滑肌细胞钙化

目的探讨外泌体在CD137信号诱导的小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)钙化中的作用。方法组织贴壁法提取小鼠胸主动脉VSMC,将细胞分为2组,即对照组和CD137激动组,用试剂盒提取外泌体,并用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析法及Western blot鉴定和分析,荧光显微镜观察VSMC摄取外泌体。构建活化T细胞核因子c1(sh-NFATc1)慢病毒载体并感染VSMC。实验分为3组:对照组外泌体处理组、CD137激动组外泌体处理组、沉默NFATc1+CD137激动组外泌体处理组。采用Western blot检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、骨形成蛋白2(BMP-2)、Runt相关转录因子2(Runx-2)蛋白表达量。Von Kossa染色检测VSMC内钙盐沉积情况。结果 Western blot结果显示,2组微囊泡均表达外泌体表面标记蛋白CD9、CD81;电镜下外泌体成圆形和杯托状,直径在30～100 nm;CD137激动组外泌体中NFATc1蛋白表达显著增多。与对照组外泌体处理组比较,CD137激动组外泌体处理组钙化相关指标BMP-2、Runx-2蛋白表达显著增高,同时α-SMA表达显著下降;与CD137激动组外泌体处理组比较,沉默NFATc1+CD137激动组外泌体处理组BMP-2、Runx-2蛋白表达显著减少,α-SMA表达显著增高。Von Kossa染色结果显示,CD137激动组外泌体处理组VSMC钙盐沉积多于对照组外泌体处理组,而沉默NFATc1+CD137激动组外泌体处理组钙盐沉积比CD137激动组外泌体处理组显著降低。结论 CD137信号通路通过外泌体转运NFATc1介导VSMC钙化。     

至真方调控M2巨噬细胞来源外泌体逆转大肠癌细胞耐药的机制研究

目的:探讨至真方通过调控M2巨噬细胞来源的外泌体逆转大肠癌细胞耐药的机制.方法:采取差异超速离心法分别提取M2巨噬细胞来源的外泌体以及100 μg/mL至真方醇提物预处理的M2型巨噬细胞来源的外泌体;用透射电子显微镜观察外泌体的形态,Western blot鉴定外泌体的标志蛋白;通过共培养体系将HCT116细胞分为3组...     

乙型肝炎病毒L蛋白颗粒的真核表达与纯化

目的:真核细胞中表达和纯化乙肝病毒L蛋白颗粒,并初步分析其物理特性与抗原性.方法:真核表达质粒pSVsigLM~ S~-瞬时转染COS-7细胞,收集48h后的培养上清采用CsCl等密度平衡离心、蔗糖密度梯度超速离心和酶联免疫吸附试验(ELISA)3者结合的方法纯化L蛋白,获得的纯化产物行Western blotting鉴定和透射电镜(TEM)观察.结果:采用超速离心结合ELISA法可以纯化L蛋白,CsCl等密度平衡离心显示在密度约1.21 g/cm~3处富含S抗原性.SDS-PAGE证实产物主要由一种42 kDa的蛋白分子组成,Western blotting证实这种蛋白为同时具有S与PreSl抗原性的L蛋白.透射电镜显示分泌的L蛋白自行组装成约23 nm的球形颗粒.结论:融合外源性信号肽能有效的引导L蛋白的组装和分泌.CsCl和蔗糖超速离心能高效纯化L颗粒并保持其完整的抗原性及颗粒形态.     

血清饥饿对结肠癌HCT116细胞外泌体分泌的影响

目的:本研究尝试使用添加无外泌体血清(E x o s o m e-d e p l e t e d F B S)的培养基培养细胞并提取外泌体,比较无外泌体血清和传统的无血清两种不同的培养条件对结肠癌H C T116细胞外泌体分泌的影响,旨在优化外泌体提取条件,使之有利于后续功能研究.方法:采用提取前24 h无血清和添加无外泌体血清培养基培养结肠癌细胞,普通光学显微镜下观察两种培养条件下细胞的生长和形态,用超速离心法分步提取分泌到细胞培养上清中的外泌体,透射电子显微镜下观察外泌体的形态,蛋白免疫印迹法分析外泌体标志蛋白,以及纳米颗粒追踪计数分析外泌体大小和含量.结果:与无血清培养条件相比,添加无外泌体血清培养的HCT116细胞生长状态良好,细胞无明显死亡现象.两种培养条件分泌的外泌体形态相近,均呈圆形或椭圆形,由脂质双分子层包裹的小囊泡,直径为40-100 nm.无外泌体血清培养条件分泌的外泌体大约是无血清培养的6倍,二种培养条件下提取的外泌体直径均为90 nm左右,与电镜结果一致.两种培养条件提取的外泌体中均检测到HSP70和CD63外泌体标志蛋白.结论:添加无外泌体血清培养HCT116细胞分泌的外泌体与无血清培养相比无明显差异,但添加无外泌体血清培养的细胞状态比无血清培养的细胞状态好,外泌体的分泌可能更接近生理条件下的生长环境,分泌的外泌体数量更多,因此无外泌体血清培养条件较无血清培养更适合结肠癌来源外泌体的提取和研究.     

肝癌细胞来源外泌体对肿瘤相关M2型巨噬细胞极化的影响

目的 探讨来源于肝癌细胞的外泌体对肿瘤相关巨噬细胞极化的影响，揭示肝癌形成新机制。方法 通过超速离心法分离肝癌细胞来源外泌体，透射电子显微镜、动态光散射粒度分析仪、蛋白免疫印迹法对外泌体表征进行鉴定；诱导巨噬细胞极化模型，实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法验证其极化状态。符合正态分布的计量资料两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 透谢电子显微镜显示肝癌细胞来源外泌体为圆形或椭圆形囊泡结构，外泌体粒径大小为(172.65±2.34)nm,蛋白免疫印迹分析显示肝癌细胞来源的外泌体中标志蛋白TSG101和CD63呈高阳性表达。佛波酯15 ng诱导人源单核细胞巨噬细胞24 h贴壁后CD68表达显著增加(6.67±0.98 vs 1.00±0.25,t=11.20,P<0.001)。蛋白免疫印迹分析显示，相比对照组(L02来源外泌体组),HCC细胞来源外泌体(低、中、高3种剂量)诱导巨噬细胞表达M2型巨噬细胞标志物Arg-1、CD163均明显增加(P值均<0.05)。结论 肝癌细胞来源外泌体可促进巨噬细胞M2型极化。     

旋毛虫肌幼虫期外泌体的分离和小RNA鉴定

目的 分离纯化旋毛虫肌幼虫分泌的外泌体,并进行鉴定,为研究旋毛虫免疫逃逸机制提供新的线索。方法 采用超速离心法提取旋毛虫肌幼虫期外泌体,通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析、免疫印记和小RNA测序对其进行鉴定。结果 旋毛虫肌幼虫期外泌体为有膜的泡状物,直径约80～200 nm,表达外泌体特异性标记蛋白CD63和Enolase,含1 266个已知的miRNA。结论 经形态、粒径及标记蛋白分析证实成功分离旋毛虫肌幼虫期外泌体,同时构建旋毛虫肌幼虫期外泌体的小RNA文库,鉴定出多种功能性小RNA,为深入研究旋毛虫肌幼虫期外泌体内小RNA分子的应用提供数据。     

肝癌细胞低氧环境下分泌的外泌体对同源细胞活性的影响

目的 探讨肝癌细胞低氧环境下分泌的外泌体对同源细胞活性的影响.方法 采用差速超速离心法提取低氧环境下人肝癌细胞(HHCC)分泌的外泌体,通过投射电子显微镜观察外泌体的形态学特征,Western印迹检测外泌体特异性蛋白表达.采用CCK-8检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能...     

巨噬细胞来源外泌体促进肝星状细胞活化及对血小板衍生生长因子表达的影响

目的探究巨噬细胞来源的外泌体对肝星状细胞活化的作用及其可能的机制。方法采用差异超速离心法提取巨噬细胞外泌体, 将外泌体与小鼠肝星状细胞株JS1细胞共培养, 设立磷酸盐缓冲液(PBS)对照组。细胞免疫荧光观察F-actin表达情况, 细胞活力检测(CCK8)法检测两组JS1细胞的存活率, western blot和RT-PCR法检测两组JS1细胞的活化指标[Ⅰ胶型原蛋白(ColⅠ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)]及其关键信号通路激活指标[转化生长因子(TGF)-β1/Smads、血小板衍生生长因子(PDGF)]的表达水平。两组间数据比较采用独立样本t检验。结果透射电镜观察外泌体膜结构清晰, 外泌体标志蛋白CD63、CD81表达阳性, 提示外泌体提取成功。外泌体与JS1细胞共培养, 与PBS对照组比较, 外泌体组JS1细胞的增殖率差异无统计学意义(P>0.05);外泌体组细胞F-actin表达明显增多;外泌体组JS1细胞α-SMA和ColⅠ的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P值均<0.05), PBS组和外泌体组α-SMA的mRNA相对表达量分别为0.25±0.07、1.4...     

Src激酶在胃癌细胞来源的exosome促进肿瘤细胞增殖中的作用

目的:研究胃癌细胞来源的外泌体(exosome)对肿瘤细胞增殖的影响,初步探讨Src蛋白激酶在此过程中的作用.方法:采用离心超滤和蔗糖密度梯度超速离心的方法从胃癌SGC7901细胞的上清液中分离出胃癌细胞来源的exosome.透射电子显微镜下观察exosome形态.MTT法检测细胞增殖能力,Western blot检测...     

基于纳米材料提取肝细胞癌患者血浆外泌体的研究

目的建立一种快速、高效提取肿瘤患者血浆外泌体的新方法。方法采用ExoQuick新型纳米材料分离外泌体,考马斯亮蓝染色进行蛋白定量,透射电子显微镜观察外泌体的形态。蛋白质印迹法分析外泌体标记和肝细胞癌相关蛋白。结果以纳米材料为基础的新提取方法分离出的胞外泌体直径为30～100 nm,与传统方法分离的外泌体直径相似;蛋白浓度是传统方法提取的外泌体蛋白浓度的19倍;鉴定到典型的外泌体蛋白:跨膜蛋白CD63和热休克蛋白70(HSP70)。肝细胞癌患者外泌体中含有TGM2,而无膜联蛋白A2表达。结论基于纳米材料提取外泌体方法快速有效。肝癌相关蛋白TGM2可以通过外泌体介导的非经典分泌途径分泌,可能是一种有价值的肿瘤标志物。     

结肠癌细胞源exosomes的分离鉴定及其表面蛋白CD44v6的表达

目的 探索结肠癌colo205细胞系对exosomes的分泌功能,并分析热休克作用对表面蛋白CD44v6表达量的影响.方法 采用超速离心法分离colo205细胞分泌的exosomes和热休克处理后colo205细胞分泌的exosomes(Heat shocked exosomes,HS-Exo),经220 nm微孔滤膜过滤纯化后,在透射电镜下观察其形态,并用SDS-PAGE方法分析细胞与exosomes的蛋白组成,Western Blot检测表面CD44v6的表达情况.结果 经透射电镜观察,正常exosomes与HS-Exo形态基本相似,均为圆形或椭圆形膜性囊泡,直径大多在30～100 nm之间,且经热休克处理的colo205细胞及其分泌的HS-Exo,在CD44v6表达量上较正常colo205细胞及exosomes显著上调(P＜0.05).结论 结肠癌colo205细胞系可分泌exosomes,且超速离心结合滤膜过滤的分离纯化方法切实可行;热休克作用可使CD44v6表达上调,说明HS-Exo较exosomes可能在肿瘤免疫治疗方面有更重要的应用价值.     

Hep2-exo负载树突细胞诱导抗喉癌免疫效应的机制

目的探讨人喉癌细胞Hep2细胞来源外泌体(Hep2-exo)负载树突细胞(DC)后体外刺激细胞毒T细胞对Hep2细胞的杀伤作用。方法利用蔗糖密度梯度超速离心法从Hep2细胞培养上清液中分离Hep2-exo。透射电子显微镜鉴定Hep2-exo形态,Western印迹分析Hep2-exo表面CD9分子表达。分离培养喉癌患者外周血单个核细胞诱导的DC,流式细胞术鉴定细胞表型。用MTT法检测负载Hep2-exo的DC刺激T淋巴细胞增殖情况及细胞毒T细胞对Hep2细胞的杀伤作用。结果透射电镜下见Hep2-exo呈典型的杯状,大小相对均一,平均直径30~100 nm。Hep2-exo表面有CD9CD63分子表达。单个核细胞DC有CD1a分子表达说明诱导成功,边缘有绒毛样突起,呈典型的PC形态。负载Hep2-exo的DC刺激T细胞增殖能力及T细胞对靶细胞的杀伤效应明显强于未负载Hep2-exo的DC(P<0.05)。结论负载Hep2-exo的DC能促进T细胞增殖,可体外诱导细胞毒T细胞应答抑制喉癌细胞生长。     

异甘草酸镁治疗慢性乙型肝炎前后血浆外泌体差异蛋白质组学筛选

目的:筛选慢性乙型肝炎患者经异甘草酸镁（MgIG）治疗前后血浆外泌体的差异蛋白质组。方法:分别采集36例MgIG治疗慢性乙型肝炎患者前后的血浆标本（2 ml/例）,利用超速离心方法提取血浆外泌体,利用Nanosight NS300颗粒粒度分析仪检测外泌体颗粒的浓度和内径。随机各抽取3例MgIG治疗前后组的血浆外泌体,裂...     

特发性膜性肾病尿液外泌体表达及临床意义

目的探讨特发性膜性肾病(IMN)患者尿液外泌体的表达及临床意义。方法对2016年9月至2018年1月盛京医院肾病科住院的49例IMN患者(IMN组)及同期21例健康志愿者(对照组)通过差速离心方法提取尿液外泌体,通过Westernblot检测外泌体标记蛋白(Alix,CD63和TSG101)的表达,将其与24h尿蛋白定量,估计肾小球滤过率和肾组织病变等临床病理指标做统计分析。结果 IMN患者尿液外泌体较对照组显著增加[Alix(t=12.74,P 0.0001),CD63(t=13.98,P 0.0001),TSG101(t=15.68,P0.0001)],外泌体标记蛋白与蛋白尿呈正相关[Alix(r=0.451,P=0.002),CD6(r=0.408,P=0.002),TSG101(r=0.417,P0.001)];尿液外泌体蛋白浓度与蛋白尿呈正相关(r=0.635,P0.001)。肾组织补体C3和PLA2R荧光染色增强组较染色较弱组尿液外泌体表达均显著增加[分别为Alix(t=3.071,P=0.004; t=2.07,P=0.046),CD63(t=2.69,P=0.01; t=3.43,P=0.002),TSG101(t=3.493,P=0.001; t=2.202,P=0.036)];尿外泌体标记蛋白(Alix,CD63和TSG101)诊断IMN的ROC曲线下面积分别是0.922[95%CI(0.843～1.002),P0.001],0.936[95%CI(0.868～1.003),P0.001]和0.944[95%CI(0.893～0.996),P0.001]。随访研究表明尿外泌体在保守治疗无效组以及免疫制剂有效或无效组中表达均增加。结论尿液外泌体可反映IMN活动性肾组织病理改变,有希望成为IMN疾病诊断、病情评估和预后判断的非侵入性生物标志物。     

细粒棘球蚴原头节源外泌体体外刺激髓源抑制性细胞极化的研究

目的 探究细粒棘球蚴原头节源外泌体体外刺激髓源抑制性细胞(MDSC)向M2型巨噬细胞极化的动态变化,并探讨二者协同发挥免疫抑制作用的生物学意义。方法体外培养细粒棘球蚴原头节并收集培养上清,超速离心上清获得外泌体。透射电镜观察外泌体形态,蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测外泌体蛋白CD9和烯醇化酶的表达。取3只健康BALB/c小鼠,制备股骨髓系细胞,刺激分化为MDSC后,分为实验组、阳性对照组和阴性对照组。于6孔板中每孔加入1×10~6个MDSC细胞,实验组、阳性对照组和阴性对照组分别加入20μl外泌体(5μg)、白细胞介素-4 (IL-4)(40 ng)和RPMI 1640培养基进行刺激。于刺激24、 48和72 h后,分别收集3组MDSC,采用流式细胞术分析单核型MDSC (M-MDSC)的细胞比例变化及其M2型巨噬细胞分子标志F4/80和CD206的表达情况。采用GraphPad Prism 8.0.2统计学软件进行统计学分析。结果透射电镜下可见细粒棘球蚴原头节源外泌体为圆形的膜状结构,直径集中在60～90 nm。Western blotting分析结果显示,外...     

骨肉瘤细胞来源的exosomes制备和鉴定

目的探讨从骨肉瘤细胞培养上清提取exosomes及鉴定其表面标志。方法采用超滤离心联合蔗糖密度梯度超速离心的方法从骨肉瘤细胞培养上清液中分离exosomes,用透射电子显微镜观察exosomes的形态,Western印迹鉴定其表面CD81及组织相溶性复合体(MHC)-I类分子的表达。结果透射电镜下见骨肉瘤细胞分泌的exosomes为圆形或类圆形小体,直径约60¹00 nm,聚集成团或散在分布;Exosomes表达CD81及MHC-Ⅰ类分子,exosomes CD81及MHC-I类分子的表达水平较骨肉瘤细胞高。结论从骨肉瘤细胞培养上清液中成功分离出exosomes,其表达抗原提呈相关的免疫分子。     

肿瘤相关成纤维细胞外泌体调控PI3K/AKT/mTOR信号通路影响肺癌细胞的生长和转移

目的探究肿瘤相关成纤维细胞外泌体对肺癌细胞生长和转移的影响及机制。方法取肺癌患者的癌组织和癌旁组织分离肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)和成纤维细胞(Normal Fibroblasts,NFs),免疫荧光和Western blot鉴定CAFs和NFs中α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin表达,差速离心法提取CAFs和NFs细胞外泌体,利用透射电镜和Western blot鉴定外泌体,将外泌体与肺癌细胞A549共孵育后检测细胞增殖、迁移、侵袭、细胞凋亡水平,Western blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路激活水平。结果α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin高表达于CAFs;透射电镜和Western blot鉴定外泌体符合其特征;与PBS组相比,与CAFs外泌体共孵育组A549细胞增殖、迁移、侵袭能力显著增加(P<0.001),细胞凋亡水平显著降低(P<0.001),PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平显著增加,而与NFs外泌体共孵育后细胞增殖、迁移、侵袭以及凋亡水平无显著变化,PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平无显著变化。结论肿瘤相关成纤维细胞外泌体能够通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,而促进肺癌细胞的生长和转移。