转基因何首乌毛状根生物转化瑞香素的研究

目的:利用转基因何首乌毛状根对瑞香素(Ⅰ)进行生物转化研究,对其生物转化产物进行分离、鉴定,并建立其产物的时效曲线图.方法:将瑞香素投入何首乌毛状根悬浮培养体系中,共培养36h后,利用TLC和HPLC进行产物检测,硅胶柱层析法分离纯化,核磁共振技术进行结构鉴定,利用HPLC考察共培养时间对转化产物(Ⅱ)、降解产物含量的影响及分析转化产物降解的原因.结果:瑞香素在何首乌毛状根悬浮培养体系中发生了生物转化反应.分离鉴定出一个产物:瑞香素-8-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅱ).何首乌毛状根悬浮培养体系转化生成Ⅱ的最佳共培养时间为36h,总摩尔转化率为32.11%.蔗糖-水培养基(仅含有蔗糖和水)可以使何首乌毛状根悬浮培养体系转化产率大幅增加,总摩尔转化率达72.44%.初步推断产物(Ⅱ)的降解与MS培养基中金属离子有关.结论:使用何首乌毛状根悬浮培养体系可大量生物合成天然药材中含量极低的活性化合物--瑞香素-8-O-β-D-葡萄糖苷.     

转基因何首乌毛状根生物转化熊果苷的初步研究

应用悬浮培养的转基因何首乌毛状根,获得目标产物熊果苷,具有较大的应用价值.     

何首乌毛状根生物转化对苯二酚生产熊果苷的研究

目的:利用何首乌毛状根悬浮培养体系生物合成熊果苷,并对转化条件进行考察。方法:利用何首乌毛状根培养体系对底物对苯二酚进行生物转化,通过HPLC制定熊果苷标准曲线,以转化产物熊果苷的产量和转化率为指标,研究了共培养时间、底物加入浓度、培养瓶体积对生物合成熊果苷的影响。同时考察了产物在培养基中的分泌情况。结果:产物在培养物和培养基中同时存在。熊果苷标准曲线Y=440 740X?1.473(r=0.999 7)。当底物加入质量浓度为1 100 mg.L-1,共培养72 h时,熊果苷的产量(2.22 g.L-1)和转化率(81.45%)达到最优。3 L大瓶培养获得成功。结论:本研究大大提高了以生物转化方法生产熊果苷的产量和转化率,并达到了3 L大瓶培养规模。此外,本研究也为利用生物技术方法大规模生产熊果苷提供了有价值的参考资料。     

转基因何首乌毛状根化学成分的研究

目的研究转基因何首乌毛状根中的化学成分。方法采用硅胶、Sephadex LH-20、ODS柱色谱等方法分离何首乌毛状根中的化学成分，并根据理化性质和波谱数据鉴定其化学结构。结果从何首乌毛状根60％乙醇提取物中分离得到了12个化合物。利用理化性质及波谱技术确定其结构分别为：2，3，5，4’-四羟基反式二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（1）、没食子酸（2）、没食子酸甲酯（3）、3，5-二羟基苯甲酸（4）、丁香酸（5）、对羟基苯甲酸（6）、胡萝卜苷（7）、β-谷甾醇（8）、豆甾醇（9）、烟酸（10）、碳直链十七酸（11）、碳直链三十一酸（12）。结论上述12个化合物均为首次从转基因何首乌毛状根中分离得到；化合物3，4，5，6为首次从该种植物中分离得到。     

转基因何首乌毛状根生物转化4-甲基-7-烯丙基氧香豆素的研究

目的:以4-甲基-7-羟基香豆素(Ⅰ)为原料通过Williamson醚法合成4-甲基-7-烯丙基氧香豆素(Ⅱ),对其进行生物转化研究,进一步探讨转基因何首乌毛状根体内酶系统的多样性。方法:Ⅰ在碳酸钾、碘化钾催化剂作用下与3-溴丙烯反应生成烯丙氧基产物Ⅱ,核磁共振技术进行结构鉴定;将Ⅱ投入何首乌毛状根悬浮培养体系中,共培养7 d后,利用TLC和HPLC进行产物检测,硅胶柱层析法分离纯化,核磁共振技术进行结构确认。结果:通过Williamson醚合成法成功得到目标产物Ⅱ。Ⅱ在何首乌毛状根悬浮培养体系中发生了生物转化反应。分离纯化得到两个化合物:4-甲基-7-羟基香豆素(Ⅰ)及4-甲基香豆素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅲ)。结论:何首乌毛状根酶系统具有水解酶及糖基转移酶活性,是良好的生物转化体系。     

转基因何首乌毛状根的二苯乙烯苷含量

以HPLC法比较研究何首乌转基因毛状根及何首乌植株中2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的含量,结果显示转基因何首乌毛状根含二苯乙烯苷量较高。     

何首乌毛状根对倍半萜类化合物Furannoligularenone的生物转化研究

目的：研究何首乌毛状根对倍半萜类化合物furannoligularenone（Ⅰ）的生物转化。方法：将外源底物Ⅰ的甲醇溶液投入到预培养9 d的何首乌毛状根,共培养后终止转化,利用各种色谱方法分离纯化产物,根据产物的理化性质和光谱数据进行结构鉴定。结果：分离得到两个转化产物3-oxo-eremophila-1,7（11）-dien-12,8-olide（Ⅱ）和3-oxo-8-hydroxy-eremophila-1,7（11）-dien-12,8-olide（Ⅲ）。转化的最佳共培养时间为3 d,总的摩尔转化率最高为27.2%。结论：利用何首乌毛状根系统生物转化倍半萜类化合物furannoligularenone获得成功。     

何首乌毛状根培养及大黄酚的含量测定

目的 测定何首乌毛状根中大黄酚的含量。方法 用发根农杆菌Ri 15834菌株感染何首乌茎、叶外植体,均可诱导出毛状根,并能合成大黄酚,采用薄层扫描法测定毛状根中大黄酚。结果 毛状根中大黄酚的含量为0．0164％。结论 该毛状根具有典型的毛状根形态特征,大黄酚含量低于何首乌药材。     

何首乌毛状根中蒽醌类成分的分离鉴定

目的:对转基因何首乌毛状根中的蒽醌类成分进行分离鉴定.方法:何首乌毛状根的60%乙醇提取物,经不同极性的溶剂萃取后,利用理化性质和现代谱学方法将其鉴定.结果:从乙酸乙酯和正丁醇萃取物中分离得到5个蒽醌类化合物,分别为大黄素(I)、大黄素甲醚(II)、大黄酚(III)、芦荟大黄素(IV)和大黄酸(V).结论:上述5个药理活性成分均为首次从转基因何首乌毛状根中分离得到.     

2,3-二氢环戊二烯香豆素类化合物对转基因何首乌毛状根生长及其二苯乙烯苷累积的影响

目的:考察2,3-二氢环戊二烯香豆素类化合物对何首乌毛状根生长的影响,并研究其对毛状根中有效成分二苯乙烯苷累积的刺激作用.方法:将2,3-二氢环戊二烯香豆素类化合物在不同的培养时间加入到毛状根中,共培养特定时间后测定其二苯乙烯苷的含量及生长量,并通过考察不同浓度和继代次数确定最佳实验条件.结果:加入香豆素类化合物的最佳时间为预培养第4天,最佳质量浓度为0.025 g·L-1,毛状根的生长量有较大提高,与对照组相比二苯乙烯苷的含量增加4倍左右.结论:2,3-二氢环戊二烯香豆素类化合物作为一类非生物诱导子能够促进何首乌毛状根的生长及有效成分二苯乙烯苷的累积.     

何首乌的提取工艺研究

目的研究不同提取工艺对何首乌浸膏中二苯乙烯苷和总糖的影响,优选制备何首乌浸膏的提取工艺。方法以蒸制何首乌为原料,何首乌中二苯乙烯苷和总糖的提取量为指标,采用旋转响应表面实验设计对何首乌浸膏制备过程中的水提取工艺进行研究。结果最佳的提取工艺为何首乌饮片与水比例1∶10.5,每次加热提取1.5h,提取3次,此条件下何首乌中二苯乙烯苷提取量达2.70%,总糖提取量达6.23%。结论该方法适用于何首乌的提取。     

中药何首乌总基因组DNA的提取

目的为获得高质量的何首乌总基因组DNA。方法采用CTAB法提取,对其提取方法进行改进。结果用改进的方法提取的样品DNA的OD260/OD280值在1.630~1.955之间,琼脂糖凝胶上主带清晰、降解较少,能完全被限制性内切酶EcoRⅠ和M seⅠ完全酶切,得到合适的AFLP指纹样式。结论改良的CTAB法提示提取何首乌DNA的理想方法,适合AFLP-PCR反应和其他分子生物学应用。     

何首乌中二苯乙烯苷提取工艺优选及炮制对其含量的影响

目的 优选何首乌中二苯乙烯苷的提取工艺，比较何首乌炮制前后二苯乙烯苷的含量。方法 采用正交试验法，通过HPLC测定提取液中二苯乙烯苷的含量。结果 何首乌中二苯乙烯苷的最佳提取工艺为；用6.0倍药材量的50%乙醇加热回流30min，何首乌炮制前后二苯乙烯苷的含量相关2-3倍。结论 正交设计中的乙醇浓度因素影响显著，何首乌炮制前后二苯乙烯苷的含量差异显著。     

不同产地何首乌的ITS序列研究

目的研究不同产地何首乌的ITS片段遗传差异性,分析该片段在何首乌道地性的DNA分子鉴别和野生资源品种的鉴定及种质资源研究中的意义。方法从来自不同原产地的何首乌中提取总DNA,以核基因组ITS通用引物为引物进行扩增,扩增产物经纯化后,用PCR产物直接测序法进行测序。结果各样品rDNA的ITS及5.8S rDNA完全序列,18S和26S rDNA部分序列,共约648bp,其中ITS1长度为195bp,5.8S长度为164bp,ITS2长度为189bp。序列间共有17个变异位点。结论ITS序列可对何首乌的道地性做出鉴别,对野生资源品种的鉴定具有较好的分辨性。     

超临界CO2萃取去除何首乌中的有害元素

目的:采用超临界CO2配合萃取技术脱除何首乌中有害元素Cu、Pb、As。方法:以二乙基二硫代氨基甲酸钠(NaDDC)作配合剂,乙醇为改性剂,考察了配合萃取方式、时间、压力、温度、配合剂用量等因素对何首乌中有害元素萃取的影响。结果:建立了有害元素脱除工艺为:萃取压力28MPa,萃取温度60℃,m(药材)∶m(NaDDC)=5∶1,m(药材)∶m(乙醇)=1∶1,静态萃取1 h,动态萃取2 h。在此条件下,何首乌中Cu、Pb、As的脱除率均达60%以上,而生理活性成分2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量保持不变。结论:本研究成果为寻找中药材中有害元素一种非破坏性的脱除方法提供了参考。     

HPLC法同时测定何首乌中二苯乙烯苷和5种蒽醌类化合物的方法

目的:建立用高效液相色谱同时测定何首乌中已知有效成分二苯乙烯苷、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚和芦荟大黄素含量的方法。方法:采用高效液相色谱法,Agilent TC-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脱,1.0mL/min,254nm,30℃。结果:6种化合物呈现较好的回归方程和相关系数,相关系数达到0.9999。二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚的平均回收率分别为97.39%、98.65%和98.35%。结论:该方法快速准确,精密度高,稳定性好,大大缩短了测定时间,对现行药典方法有了很大的改进,为何首乌的质量控制与含量测定提供了重要的参考。     

不同产地何首乌药材质量及差异研究

目的:分析何首乌20个产地3种功效组分(二苯乙烯苷类、游离蒽醌类、结合蒽醌类)6种活性成分的含量与产地地理、气候因子的相关性,以期得到各类功效成分形成的关键影响因素,同时为研究何首乌在截疟解毒、润肠通便、补益肝肾3种功能活性上的潜在优势提供参考。方法:采用高效液相色谱法(HPLC)一测多评法对大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、顺式二苯乙烯苷、反式二苯乙烯苷进行含量测定,利用SPSS进行方差分析、简单相关分析和典型相关分析。结果:不同产地何首乌各成分含量差异有统计学意义(P<0.05),蒽醌类和二苯乙烯苷类含量最高分别在四川冕宁和湖北武当山;综合环境因子分析,经度与游离蒽醌成分密切相关,低温有利于结合蒽醌成分积累,温度与海拔对二苯乙烯苷成分含量影响较大。结论:结合不同成分的药理活性初步推断,低温、低湿的四川冕宁及其相似环境所产的何首乌,具有截疟解毒、润肠通便的潜在优势;高海拔、大温差的湖北武当山及其相似环境所产的何首乌,具有补益肝肾的潜在优势,该研究结果对何首乌精准药材生产具有一定的指导意义。