仙茅及其有效成分对不同状态L02细胞PXR-CYP3A的影响研究

目的: 明确仙茅水提液及其有效成分苔黑酚葡萄糖苷对正常、虚寒状态L02细胞中PXR-CYP3A的影响,为探讨仙茅在不同状态下药效表达差异的机制奠定基础. 方法: 分别用正常、虚寒大鼠血清培养L02细胞,诱导正常、虚寒2种状态细胞.仙茅水提液及其有效成分苔黑酚葡萄糖苷作用于不同状态细胞后,检测不同状态L02细胞PXR蛋白表达和CYP3A活性. 结果: MTT法结果显示,仙茅水提液和苔黑酚葡萄糖苷能使L02细胞活力明显增强;仙茅水提液能使正常组L02细胞PXR蛋白表达水平显著降低,苔黑酚葡萄糖苷能使正常组L02细胞CYP3A活性和PXR蛋白表达水平均显著降低;而仙茅水提液能使虚寒组L02细胞CYP3A活性和PXR蛋白表达升高,苔黑酚葡萄糖苷能使虚寒组L02细胞CYP3A活性水平显著降低,使虚寒组细胞PXR蛋白表达水平升高. 结论: 仙茅作用于虚寒状态L02细胞,能激活PXR诱导CYP3A活性,但对正常L02细胞的PXR及其介导的CYP3A活性没影响或作用相反.     

何首乌中THSG和蒽醌类成分对人孕烷X受体介导的CYP3A4的调控作用

该文探讨何首乌主要化学成分2,3,5,4'-四羟基芪-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-Dglucopyranoside,THSG)、蒽醌类(大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚)对人孕烷X受体(human pregnant X receptor,PXR)介导的CYP3 A4的转录调控作用。利用前期建立的PXR介导的CYP3 A4药物诱导快速筛选技术,采用MTS细胞检测方法考察何首乌中主要化学成分对细胞活性的影响,计算IC50;利用双荧光素酶报告基因系统,将PXR表达载体和含CYP3 A4转录调控区的报告基因载体共转染Hep G2细胞,10μmol·L~(-1)利福平(RIF)为阳性对照,10μmol·L–1酮康唑(TKZ)为阴性对照,用THSG(2.5,5,10μmol·L~(-1))和蒽醌类成分(2.5,5,10μmol·L~(-1))分别处理24 h,进行双荧光素酶活性检测。结果表明,空载质粒pc DNA3.1与p GL4.17-CYP3A4共转染时,THSG、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素对CYP3A4的调控多为抑制效应,大黄素对CYP3A4产生诱导作用;pc DNA3.14-PXR与p GL4.17-CYP3A4共转染时,THSG、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素均产生诱导效应。综上,THSG和蒽醌类成分均可对CYP3A4产生抑制或激活效应,PXR参与后,上述成分对CYP3A4均产生诱导效应,提示何首乌中主要成分对CYP3A4的诱导作用是通过PXR实现的。以上结果提示在与何首乌联合用药时应注意潜在的药物相互作用,提高中药的安全性和有效性。     

仙茅体内代谢过程与药物代谢酶CYP3A的相关性研究

目的:探讨仙茅体内代谢过程与药物代谢酶细胞色素P4503A(CYP3A)的相关性,为进一步研究机体CYP3A活性变化对仙茅性-效表达的影响奠定基础。方法:SD雄性大鼠随机分为2组,即正常组和利福平组。利福平组每天灌胃给予200mg/kg药物混悬液,正常组给予等体积蒸馏水,连续7d,第8天每组各取6只大鼠一次性灌胃仙茅水煎液(20g/kg)后,分别于20、50、90、180min时眼眶取血测仙茅入血成分苔黑酚葡萄糖苷血药浓度,其他大鼠断头处死,取肝、小肠、肾测定CYP3A活性。结果:利福平组大鼠肝微粒体CYP3A活性明显升高(P0.05),小肠、肾微粒体CYP3A活性有升高趋势;利福平组大鼠各时间点血药浓度均低于正常组,且在20、50、90时差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论:利福平诱导后大鼠肝微粒体CYP3A活性升高,而苔黑酚葡萄糖苷血药浓度明显降低,说明仙茅体内代谢过程与药物代谢酶CYP3A相关。     

苦参碱对人孕烷X受体介导的CYP3A4调节及药物相互作用分析

目的:研究苦参碱(Matrine)对CYP3A4转录激活、mRNA诱导作用的影响,并对其在联合用药中药物的相互作用进行评价。方法:利用CCK-8方法检测苦参碱对人结直肠癌LS174T细胞、人肝癌Hep G2细胞增殖的影响;瞬时共转染报告基因方法检测苦参碱对人孕烷X受体(PXR)介导的CYP3A4荧光素酶活性影响;Real-time PCR检测苦参碱对人孕烷X受体、CYP3A4 mRNA诱导作用影响。结果:在一定的浓度范围内,苦参碱对Hep G2和LS174T细胞的增殖均具有抑制作用;在Hep G2细胞中,苦参碱可通过激活PXR而诱导CYP3A4转录,并通过诱导PXR mRNA表达进而上调CYP3A4 mRNA表达。在LS174T细胞中,苦参碱可通过激活PXR诱导CYP3A4转录,并通过诱导PXR mRNA表达进而上调CYP3A4 mRNA表达,且其作用呈浓度依赖性。结论:苦参碱对CYP3A4的诱导可能与人孕烷X受体通路有关,与其他药物联合使用时有可能干扰其他药物的代谢。     

何首乌6种成分对人孕烷X受体介导的CYP3A4的调控作用

该文探讨何首乌中6种化学成分(没食子酸、槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素)对人孕烷X受体(humanpregnant X receptor,PXR)介导的CYP3A4的转录调控作用。利用前期建立的PXR介导的CYP3A4药物诱导快速筛选技术,采用MTS细胞检测方法考察化学成分对细胞活性的影响,计算IC50;利用双荧光素酶报告基因系统,将PXR表达载体和含CYP3A4转录调控区的报告基因载体共转染HepG2细胞,10μmol·L~(-1)利福平为阳性对照,10μmol·L~(-1)酮康唑为阴性对照,用何首乌中6种成分——没食子酸、槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素(5,10,20μmol·L~(-1))分别处理24 h,进行双荧光素酶活性检测。结果表明,空载质粒pc DNA3. 1与p GL4. 17-CYP3A4共转染时没食子酸、白藜芦醇对CYP3A4的调控为抑制效应,槲皮素、山柰酚、木犀草素对CYP3A4产生诱导作用; pc DNA3. 14-PXR与p GL4. 17-CYP3A4共转染时,槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素均产生诱导效应。综上所述,6种成分对CYP3A4产生抑制或激活效应,PXR参与后,5种成分对CYP3A4产生诱导效应,其中3种成分的诱导效应具有显著性差异。该研究提示,在与何首乌联合用药时应注意潜在的药物相互作用,提高安全性和有效性。     

何首乌6种成分对人孕烷X受体介导的CYP3A4的调控作用北大核心CSCD

该文探讨何首乌中6种化学成分(没食子酸、槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素)对人孕烷X受体(humanpregnant X receptor,PXR)介导的CYP3A4的转录调控作用。利用前期建立的PXR介导的CYP3A4药物诱导快速筛选技术,采用MTS细胞检测方法考察化学成分对细胞活性的影响,计算IC50;利用双荧光素酶报告基因系统,将PXR表达载体和含CYP3A4转录调控区的报告基因载体共转染HepG2细胞,10μmol·L-1利福平为阳性对照,10μmol·L-1酮康唑为阴性对照,用何首乌中6种成分--没食子酸、槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素(5,10,20μmol·L-1)分别处理24 h,进行双荧光素酶活性检测。结果表明,空载质粒pc DNA3. 1与p GL4. 17-CYP3A4共转染时没食子酸、白藜芦醇对CYP3A4的调控为抑制效应,槲皮素、山柰酚、木犀草素对CYP3A4产生诱导作用;pc DNA3. 14-PXR与p GL4. 17-CYP3A4共转染时,槲皮素、山柰酚、木犀草素、白藜芦醇、芹黄素均产生诱导效应。综上所述,6种成分对CYP3A4产生抑制或激活效应,PXR参与后,5种成分对CYP3A4产生诱导效应,其中3种成分的诱导效应具有显著性差异。该研究提示,在与何首乌联合用药时应注意潜在的药物相互作用,提高安全性和有效性。     

基于UHPLC-MS-MS大通量分析的蜂胶影响PXR/CYP3A4调控血脂质量标志物筛选和评价

目的采用精准、可量化的方法筛选蜂胶影响PXR/CYP3A4通路调控血脂的质量标志物。方法采用人结肠癌LS174T细胞给予一定浓度的咪达唑仑注射液,同时给予不同浓度的蜂胶已知成分对照品溶液,孵育后提取样品,采用UHPLC-MS法测定生成的1′-羟基咪达唑仑含量,根据测定结果筛选出对PXR/CYP3A4通路有显著调控作用的成分,以这些成分为指标,建立同时定量方法,根据结果初步确定蜂胶中影响PXR/CYP3A4通路调控血脂代谢的质量标志物。结果所评价的蜂胶成分中,白杨素、高良姜素、异绿原酸A、槲皮素、咖啡酸苯乙酯均能够显著提高或降低1′-羟基咪达唑仑的量(与对照组和阳性对照组比较),提示上述成分能够显著影响PXR/CYP3A4表达;UHPLC-MS-MS含量测定结果显示,蜂胶中上述成分除异绿原酸A和乔松素外,均具有适宜的含量以达到显效。结论白杨素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯和槲皮素可能是蜂胶影响PXR/CYP3A4通路调控血脂的质量标志物,且均具有抑制相关靶标表达,进而调节血脂水平的活性;同时,本研究所用质量标志物筛选、评价方法快速、高效、可量化,能够适应基于PXR/CYP3A4的大通量活性成分筛选研究。     

cAMP-PKA信号通路参与电针调控兔退变椎间盘AQP1、AQP3表达的机制研究

目的:探讨cAMP-PKA信号通路参与电针调控兔退变椎间盘AQP1、AQP3表达的作用机制。方法:选取成年雄性新西兰大白兔50只,按照随机数字表法分为空白组(A组)、假模型组(B组)、模型组(C组)、模型+电针组(D组)和模型+电针+阻断组(E组),每组10只。建立椎体间压力诱导椎间盘退变模型后,A组、B组和C组不进行任何干预,D组行电针夹脊穴治疗,E组行电针夹脊穴治疗和PKA抑制剂H-89(10μmol/L)皮下注射,电针治疗6 d为1疗程,疗程间隔1 d,共治疗4个疗程。分别在造模成功后第1天和治疗后28 d两个时间点各取5只,进行椎间盘矢状位MRI T2扫描,采用Western-blot技术检测各组椎间盘组织内AQP1、AQP3的表达水平,ELISA方法检测椎间盘组织内cAMP水平及PKA活性。结果:造模成功后第1天,C组、D组、E组AQP1、AQP3表达及cAMP、PKA活性浓度明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。治疗后第28天D组中AQP1、3的表达及cAMP、PKA活性浓度明显高于同期C组(P0.05);E组中AQP1、AQP3表达及PKA活性浓度显著低于同期D组(P0.05)。结论:cAMP-PKA信号通路对电针上调兔退变椎间盘中AQP1、AQP3的表达起调控作用。     

水飞蓟宾对硫代乙酰胺所致肝损伤状态下CYP3A的调节作用及机制

目的：水飞蓟宾（sB）是植物奶蓟的主要成分,长期以来被用于治疗各种肝脏疾病。由于肝病往往伴随有CYP450酶的功能失调,因此本文以硫代乙酰胺（TAA）引起的大鼠肝损伤为模型,研究水飞蓟宾的肝保护作用和对CYP3A的调控作用之间的关系。方法：血清生化指标检测和肝脏病理切片实验评价水飞蓟宾的保肝作用。免疫组化实验测定0【一SMA的表达,ELISA试剂盒测定大鼠肝脏炎症因子的表达。实时定量PCR和westernblot实验考察CYP3A和PXR的mRNA和蛋白表达水平变化,咪达唑仑4一羟基化反应测定CYP3A的活性。siRNA转染实验沉默PXR后考察PXR在硫代乙酰胺细胞毒和CYP3A调节中的作用。结果：水飞蓟宾表现出明显的保肝、抗炎、抗纤维化作用,并能有效逆转硫代乙酰胺导致的大鼠肝脏CYP3A和PXR表达减少以及PXR的入核减少。PXR沉默实验显示PXR参与了水飞蓟宾的细胞保护和CYP3A调控过程。结论：PXR是参与CYP3A调控的重要因子,很可能是水飞蓟宾在硫代乙酰胺导致的大鼠肝损伤模型中的作用靶点,同时也提示在治疗肝脏疾病时要注意与水飞蓟宾合用的药物可能与水飞蓟宾之间存在潜在的药物相互作用。     

灯盏细辛和赤芍配伍组方对小鼠部分肝细胞色素P450亚型活性的影响及其机制分析

目的:探讨灯盏细辛和赤芍配伍组方(辛芍组方)对小鼠细胞色素P450酶(CYP450s)主要亚型CYP1a2,CYP2d22,CYP2e1和CYP3a11代谢活性的影响以及相关机制。方法:小鼠分为5组,分别为正常组、苯巴比妥组(70 mg·kg-1)和辛芍组方低、中、高剂量组(0.31,0.62,1.25 g·kg-1)。给药结束后,取各组小鼠肝脏制备微粒体,考察CYP1a2,CYP2d22,CYP2e1和CYP3a11的代谢活性;并提取肝组织总RNA和蛋白,实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)考察辛芍组方对CYP1a2,CYP2d22,CYP2e1,CYP3a11和孕烷X受体(PXR)mRNA及蛋白表达的影响;利用报告基因法考察辛芍组方对PXR的激活作用。结果:与正常组比较,辛芍组方可诱导CYP3a11酶活性,上调CYP3a11,PXR mRNA和蛋白水平,并具有PXR激活作用(P0.05,P0.01);与模型组比较,辛芍中、高剂量组方能抑制CYP1a2酶活性(P0.05),但对CYP1a2的mRNA水平和蛋白水平无明显影响;而辛芍组方对CYP2e1,CYP2d22的酶活性,mRNA水平和蛋白水平无明显影响。结论:辛芍组方具有CYP3a11活性诱导作用,该作用很可能与辛芍组方上调PXR表达并激活PXR从而促进CYP3a11表达有关;而其CYP1a2活性抑制作用机制与CYP1a2的表达调控无关,需要进一步研究。     

Effect of panaxytriol on cytochrome P450 3A4 via the pregnane X receptor regulatory pathway

Panaxytriol (PXT) is one of the major effective components of red ginseng and Shenmai injection. The present study aimed to explore the effect of PXT on cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) based on the pregnane X receptor (PXR)–CYP3A4 regulatory pathway in HepG2 cells and hPXR‐overexpressing HepG2 cells treated with PXT for different time periods using quantitative polymerase chain reaction, Western blot, and dual‐luciferase reporter gene assays. PXT could upregulate the levels of PXR and CYP3A4 mRNA in HepG2 cells treated with PXT for 1 hr, with no impact on the expression of their protein levels. The expression levels of both PXR and CYP3A4 mRNA and protein in HepG2 cells treated with PXT for 24 hr increased in a concentration‐dependent manner. The effects of PXT on the expression of PXR and CYP3A4 mRNA and protein in hPXR‐overexpressing HepG2 cells were similar to those in HepG2 cells. Moreover, the influence trend of PXT on CYP3A4 was consistent with that of PXR in HepG2 cells and hPXR‐overexpressing HepG2 cells. The dual‐luciferase reporter gene assay in HepG2 cells further demonstrated that PXT treatment for specific time periods could significantly induce the expression of CYP3A4 mediated by the PXR regulatory pathway.     

4种中药调节细胞色素P450 3A4转录表达的研究

目的从中药中筛选通过激活人孕烷x受体(PXR)诱导细胞色素P450 3A4(CYP3A4)转录表达的中药;研究其诱导能力与药物浓度和作用时间之间的关系.方法在HepG2细胞中,采用瞬时共转染报告基因试验筛选对CYP3A4转录表达有诱导作用的中药,研究其在不同浓度和不同作用时间下对PXR介导的CYP3A4的转录调节作用.结果中药莪术、苍术、白术和茯苓均能通过激活PXR诱导CYP3A4的转录表达,且具有浓度.效应关系和时间-效应关系.在浓度-效应关系中,500 mg·L-1的莪术、苍术、白术和茯苓,在作用时间24 h时,其诱导倍数分别为0.1%DMSO处理细胞的(6.82±0.09),(6.76±0.20),(5.49±0.13),(4.97±0.07)倍.在时间.效应关系研究中,500 mg·L-1的莪术、苍术、白术和茯苓,在作用时间为48 h时,其诱导倍数分别为0.1%DMSO作用细胞的 (7.74±0.54),(7.34±0.10),(5.54±0.11),(5.32±0.18)倍.结论中药莪术、苍术、白术和茯苓均能够通过激活PXR诱导CYP3A4的转录表达.     

复方中药白龙对G1期人胃癌细胞中抑癌基因的影响及与PKA信号通路的相关性

目的：探讨复方中药白龙对人胃癌ＢＧＣ８２－３Ｇ１期细胞周期蛋白激酶抑制因子（ＣＫＩ）ｐ１６＾ＩＮＫ４ａ，ｐ２１以及Ｒｂ，ｃ－ｍｙｃ等基因转录的影响和ｃＡＭＰ－ＰＫＡ信号通路的调节关系。方法：通过实验室常规分子生物学手段（细胞同步化，分子杂交－Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交，Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交等）检测相关基因的表达变化。     

Up-regulatation of CYP3A expression through pregnent X receptor by praeruptorin D isolated from Peucedanum praeruptorum Dunn

Ethnopharmacological relevance

Qianhu, the dried roots of Peucedanum praeruptorum DUNN (Umbelliferae), is a well-known traditional Chinese medicinal herb which was officially listed in the Chinese Pharmacopoeia. Praeruptorin D (PD) is one of the major active constituents of Peucedanum praeruptorum Dunn (Qianhu). The Pregnane X receptor (PXR) is an orphan nuclear receptor and plays a pivotal role in the activation of human cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) gene.

Aim of the study

The purpose of this study was to investigate the effect of PD on the PXR-mediated transactivation of CYP3A4, and thus to predict potential herb–drug interactions between PD, Qianhu, and the other co-administered drugs that metabolized by CYP3A4.

Materials and methods

The effect of PD on the Cyp3a11, mPXR mRNA expression in mice primary hepatocytes was measured using real-time PCR. The gene expression, protein expression, and catalytic activity of CYP3A4 in the LS174T cells after transfected with PXR expression plasmids were determined by real-time PCR, Western blot analysis, and LC–MS/MS based CYP3A4 substrate assay.

Results

The results revealed that the level of Cyp3a11 gene expression in mice primary hepatocytes was significantly increased by PD, but PD cannot induce the mPXR gene expression. On the other hand, CYP3A4 mRNA, protein expression and functional activity in PXR-over-expression LS174T cells were significantly increased by PD through PXR-mediated pathway; conversely, no significant change was found in the untransfected cells.

Conclusions

These findings suggest that PD can significantly up-regulate CYP3A4 expression and activity via the PXR-mediated pathway and this should be taken into consideration to predict any potential herb–drug interactions when PD and Peucedanum praeruptorum Dunn are co-administered with other drugs.     

大黄素对体外培养NRK细胞水通道蛋白2表达的影响

目的探讨大黄素对体外培养NRK细胞水通道蛋白2(AQP2)表达的调节效应及机制。方法体外培养NRK细胞,分为两步实验:第一步随机分为对照组和5、10、20mg/L大黄素处理组,采用间接免疫荧光法定性NRK细胞AQP2表达,Westen blot、半定量RT-PCR检测药物处理24h后AQP2蛋白及mRNA的表达;第二步随机分为对照组,20mg/L大黄素组,10mg/L8-Bromo-cAMP组、20mg/L大黄素加10mg/L8-Bromo-cAMP组,采用非放射性法检测药物处理24h后NRK细胞蛋白激酶A(PKA)活性水平。结果 AQP2表达于NRK细胞的细胞膜,进一步的Western blot及半定量RT-PCR结果显示,10、20mg/L大黄素培养液均可抑制NRK细胞的AQP2蛋白及mRNA的表达(P0.05)。PKA活性结果显示,20mg/L大黄素能降低NRK细胞的PKA磷酸化水平(P0.05)。结论大黄素可抑制NRK细胞AQP2基因转录与翻译,提示大黄的利尿作用可能与其调节AQP2表达有关,而且有可能是通过PKA通路调节AQP2的表达。     

Panax Notoginseng Saponins Increases the Blood Concentration of Nifedipine by Inhibiting CYP3A4 Enzyme through PXR-and CAR-Mediated Pathway

Objective:To explore the mechanism underlying the effect of Panax notoginseng saponins (PNS) on the pharmacokinetics of nifedipine (NF)in rats. Materials and Methods:Twenty-four rats were randomly divided into blank (BL) group, PNS group, NF group, and PNS+NF group,with six rats in each group. Noncompartmental analysis and t-test were carried out to determine the difference between the pharmacokinetic parameters of NF in different groups. CYP3A4 enzyme activity was calculated using the probe drug method. The mRNA and protein contents of CYP3A4, nuclear receptor CAR, and PXR in rat liver were quantitatively analyzed by qRT-PCR and Western blot. Results:After the rats were treated with the combination of PNS and NF, the plasma concentration, half-life, peak time, and area under the concentration-time curve of NF increased, whereas the clearance rate decreased. The inhibitory effect on CYP3A4 enzyme activity was in the following order:PNS+NF group (strongest) PNS group NF group, and BL group (weakest). Similar changes were observed for the inhibitory effect on CYP3A4, CAR, and PXR mRNA and protein content, and the order was as follows:PNS+NF group (weakest)PNS group NF group,and BL group (strongest). Conclusion:In combination with NF, PNS may inhibit the mRNA and protein expression of nuclear receptor CAR and PXR and the activity of CYP3A4 enzyme, slowing down the pharmacokinetics of NF in rats, increasing its blood concentration, and enhancing the therapeutic effect of NF.     

中药白龙与HMBA对人癌周期细胞CKI-P16的调控

目的：研究中药白龙与西药环六亚甲基二乙酰胺（HMBA）对人癌细胞中周期蛋白抑制因子P16的表达与调节。方法：采用Northern blot、Western blot等方法检测人癌细胞在白龙或HMBA作用下P16的表达调节。结果：在白龙或HMBA作用下癌细胞G1期P16的表达增加，这一作用与cAMP-PKA和DAC－PKC两套信号通路共调节作用密切相关。当以PKA抑制剂阻断PKA通路时，P16表达下降，相反当PKC通路被阻断时P16表达水平升高。结论：（1）癌细胞G1期P16的低表达（与其他时相比较）可能是P16不能有效抑制癌细胞恶性变化的重要原因。（2）白龙和HMBA对肿瘤细胞的增殖抑制机理与G1期细胞P16表达升高相关。（3）白龙和HMBA对人癌细胞内P16的表达调节表现了中西药对肿瘤细胞调节机理的共性。（4）首次阐明了P16上游调控与cAMP/PKC信号通路密切相关。