结核亚单位疫苗AEC／BC—C02诱导小鼠长期的抗原特异性细胞应答

目的动态评价结核亚单位候选疫苗AEC/BC-C02在小鼠中的细胞免疫应答水平。方法6～8周龄SPF级BALB/c雌鼠48只,按数字表法随机分成两组,一组免疫AEC/BC-C02,另一组免疫PBS。末次免疫后第1、2、4、8周分别取两组小鼠（6只/组）分离脾淋巴细胞,ELISPOT检测分泌抗原特异性IFN-γ的T细胞频率;在第2、4、8周ELISA检测抗原特异性IFN-γ的分泌量;在第4、8周,Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测脾淋巴细胞增殖。结果(1)末次免疫后第1、2、4、8周,对疫苗组小鼠脾淋巴细胞,Ag85B特异性的IFN-γ斑点形成细胞（spot forming cells,SFC）分别为168.8±103.5、205.2±51.0、206.8±65.3和160.0±67.9,与PBS对照组的8.9±6.0、16.1±18.8、9.3±4.9和7.7±6.6比较,差异均有统计学意义（成组t检验,t值分别为3.779、8.525、7.424、5.473;P值均<0.01）;EC特异性的IFN-γ SFC分别为45.1±18.6、75.6±39.3、86.2±50.4和54.3±26.3,与PBS对照组的4.5±3.5、11.7±10.5、3.8±5.8和5.2±4.3比较,差异均有统计学意义（成组t检验,t值分别为5.258、3.850、3.977、4.521;P值均<0.01）。(2)末次免疫后第2、4、8周,对疫苗组小鼠脾淋巴细胞,Ag85B多肽刺激的IFN-γ分泌量分别是(1.27±0.13)ng/ml,(1.76±0.55)ng/ml和(1.44±0.44)ng/ml;EC多肽刺激的IFN-γ分泌量分别是(0.81±0.33)ng/ml,(0.81±0.69)ng/ml和(0.54±0.29)ng/ml,两者间差异有统计学意义（配对t检验,分别为：t=3.008,P<0.05;t=2.631,P<0.05;t=10.02,P<0.01）。(3) 末次免疫后第4、8周,Ag85B多肽对疫苗组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数（SI）分别为1.756±0.339和1.936±0.287,均分别高于PBS组的1.287±0.0581和1.382±0.114,差异有统计学意义（成组t检验,分别为：t=3.030,P<0.05;t=4.387,P<0.01）;EC多肽对疫苗组SI分别为1.599±0.154和1.581±0.156,均分别高于PBS组的1.380±0.126和1.314±0.170,差异有统计学意义（成组t检验,t值分别为2.540、2.844;P值均<0.05）。结论新型结核亚单位疫苗AEC/BC-C02免疫小鼠可诱导长期稳定存在的抗原特异性记忆T细胞,为后期抗Mtb保护力研究提供药理学基础。     

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT-6融合蛋白重组耻垢分枝杆菌对小鼠的免疫原性研究

目的 评价表达Mtb Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌（Ag85B-ESAT-6-rM.s）在小鼠中的免疫原性。 方法 6周龄BALB/c小鼠经背部皮下注射1×10⁶ CFU（colony-forming unit,菌落形成单位）的Ag85B-ESAT-6-rM.s,同时设M.s免疫组（10只）、BCG免疫组（10只）、Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫组（10只）和生理盐水组（10只）。接种免疫后1～6周,尾静脉采血,检测小鼠外周血CD4⁺和CD8⁺ T细胞所占百分比;免疫后6周,MTS［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt］法检测小鼠脾淋巴细胞增殖和酶联免疫斑点检测（enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT）检测脾淋巴细胞分泌γ干扰素（interferon γ,IFN-γ）、白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）和白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）等细胞因子的水平。 结果 Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠后能够明显刺激小鼠外周血CD4⁺和CD8⁺ T细胞的产生,其所占百分比［（59.6±1.5）%］明显高于BCG免疫组［(48.8±2.3)%］（t=12.252,P<0.05）和原始M.s免疫组［(45.7±1.6)%］（t=20.166,P<0.05）。Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖指数（3.23±0.31）与BCG免疫刺激的增殖指数（2.95±0.36）相当（t=1.864,P>0.05）,但其诱生IFN-γ的能力［斑点形成细胞(spot forming cells,SFC) ］［(167.5±36.6)SFC/10.6］明显高于BCG［(98.5±26.9)SFC/10⁶ ］（t=4.804,P<0.05）。 结论 Ag85B-ESAT-6融合蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达能够明显提高M.s的免疫原性,并能够刺激小鼠机体产生有利于抗Mtb感染的免疫反应,作为TB新型候选疫苗具有一定的研究前景。     

中试生产的结核DNA疫苗免疫效能研究

目的 以300 L发酵罐中试规模生产的冻干Mtb Ag85A质粒DNA疫苗为基础免疫小鼠,对该疫苗的免疫效能进行研究。 方法 将4~6周龄的BALB/c小鼠20只通过数字表法随机分为2组,一组免疫Mtb Ag85A质粒DNA疫苗（结核DNA疫苗免疫组）,另一组免疫PBS作为阴性对照（PBS对照组）;于免疫前采血,肌内注射免疫3次。在第3次免疫后3周摘眼球处死小鼠,收集血清,进行血清特异性抗体检测和细胞因子(IFN-γ、IL-4)检测;同时对每只小鼠取脾细胞进行特异性γ干扰素 (IFN-γ) 分泌检测和脾细胞CD4⁺、CD8⁺百分率检测。 结果 （1）免疫前后免疫组与对照组抗体水平吸光度A值均小于0.2。（2）结核DNA疫苗免疫组血清细胞因子IL-4水平［（146.2±34.3）pg/ml］低于PBS对照组［（177.7±28.1）pg/ml］,差异有统计学意义（t=2.244,P=0.038）,而IFN-γ水平［（129.6±159.0）pg/ml］虽然高于PBS对照组［（76.5±21.5）pg/ml］,但差异无统计学意义（t=－1.047,P=0.309）。（3）酶联免疫斑点检测结果表明结核DNA疫苗免疫组脾细胞特异性IFN-γ分泌水平（分泌IFN-γ细胞个数）（103.60±112.14）高于PBS对照组（5.78±5.83）,差异有统计学意义（t=36.538,P=0.018）。（4）结核DNA疫苗免疫组CD4⁺细胞百分率均值（21.57%）高于PBS对照组（12.17%）,差异有统计学意义（t=3.043,P=0.038）;CD8⁺细胞百分率均值（13.70%）与PBS对照组（10.57%）相比,差异无统计学意义（t=0.847,P=0.445）。 结论 Mtb Ag85A质粒DNA疫苗主要刺激机体Th1型细胞免疫,而对诱导机体产生Th2型细胞免疫应答没有显著的促进作用。     

结核分枝杆菌休眠相关抗原Rvl733cDNA疫苗的构建及免疫学特性研究

目的 构建结核分枝杆菌（Mtb）休眠相关抗原Rv1733c的真核表达载体,并评价其作为DNA疫苗的免疫学特性。 方法 利用限制性酶切的方法从本室前期保存的pMD-18T-Rv1733c质粒中构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c。将pcDNA-Rv1733c重组质粒稳定转染P815细胞,并用间接免疫荧光法检测Rv1733c的表达。采用数字表法随机将BALB/c小鼠分为3组,每组10只,即pcDNA-Rv1733c质粒DNA组、生理盐水组和BCG组。pcDNA-Rv1733c质粒DNA组和生理盐水组采用肌内注射方式免疫,间隔2周免疫1次,共免疫3次。BCG组采用皮下免疫一次。各组小鼠每2周采血,ELISA检测血清中特异性抗体水平和IgG2a/IgG1抗体亚类比率与比值。初次免疫8周后,MTS［3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium,inner salt］（四氮唑蓝盐化合物）法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖、ELISPOT检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平。流式细胞法检测脾淋巴细胞中CD4⁺和CD8⁺ T细胞所占比率;LDH法检测CTL（cytotoxic T lymphocytes;细胞毒性T淋巴细胞）活性。 结果 成功构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c。间接免疫荧光实验表明pcDNA-Rv1733c质粒稳定转染的P815细胞中能够稳定表达Rv1733c蛋白。pcDNA-Rv1733c质粒DNA免疫小鼠后能诱导小鼠产生特异性抗体,抗体亚类以IgG2a为主,随着免疫时间的延长,IgG2a/IgG1的比值趋于平衡;脾淋巴细胞增殖指数（2.00±0.36）高于BCG组（1.1±0.06）（t=3.096,P<0.05）;特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数(41.48±5.30) SFC/10⁶高于生理盐水组（2.75±1.37）SFC/10⁶（t=4.752,P<0.05）;然而脾淋巴细胞中CD4⁺、CD8⁺ T细胞所占比率［分别为(18.15±2.30)%、(7.68±1.34)%］、CTL杀伤活性［(29.52±1.96)%］都与生理盐水组相当［(16.43±2.02)% (t=0.571,P>0.05)、(7.32±0.42)% (t=0.234,P>0.05)、（25.28±2.51）%（t=0.726,P>0.05）］。 结论 成功构建Rv1733c真核表达载体pcDNA-Rv1733c;并能够诱导小鼠机体产生特异性的体液和细胞免疫应答,提示用于结核病新型疫苗的研究具有一定的意义。     

复苏促生长因子结构域及其突变体重组蛋白诱导小鼠免疫应答的研究

目的 评价复苏促生长因子结构域蛋白（Rpfd）及其突变体蛋白（Rpfd1、Rpfd2）等3种重组蛋白的免疫效能。 方法 2011年11月至2012年2月间,分别以本实验前期制备的重组蛋白Rpfd（A组）、Rpfd1（A1组）、Rpfd2（A2组）分别于0、2、4周免疫无特定病原体（SPF）级BALB/c小鼠,每组14只,并分别以BCG（B组）和生理盐水（C组）同期免疫同种小鼠各14只作为对照。第5周,每组取7只小鼠摘眼球取血,ELISA法检测血清特异性抗体、血清IFN-γ和IL-2表达水平;第8周,每组剩余7只小鼠用1×10⁵ CFU结核分枝杆菌标准株H37Rv感染小鼠,第9周检测感染后小鼠血清细胞因子IFN-γ和IL-2水平。 结果 （1）抗体水平：①Rpfd抗原包被。A1组刺激小鼠产生抗体A₄₅₀的检测值（0.990±0.272）高于B组（0.631±0.180）（t=4.635,P<0.05）;A2组（1.470±0.455）高于B组（t=6.634,P<0.05）。②Rpfd1抗原包被。A组刺激小鼠产生抗体A₄₅₀的检测值（1.030±0.304）高于B组（0.573±0.004）（t=5.276,P<0.05）;A1组（1.368±0.171）高于B组（t=17.20,P<0.05）;A2组（2.766±0.245）高于B组（t=31.643,P<0.05）;③Rpfd2抗原包被。A1组刺激小鼠产生抗体A₄₅₀的检测值（1.055±0.202）高于B组（0.538±0.100）（t=8.009,P<0.05）;A2组（1.605±0.544）高于B组（t=8.192,P<0.05）。（2） IFN-γ水平：①感染前。A组刺激小鼠产生IFN-γ水平［（553.47±132.00）pg/ml］高于B组［（385.28±129.07）pg/ml］（t=3.150,P<0.05）;②感染后。A1蛋白组刺激小鼠产生IFN-γ水平［（492.41±211.74）pg/ml］高于B组［（335.36±207.72）pg/ml］（t=2.874,P<0.05）;A2组［（543.09±223.07）pg/ml］高于B组（t=3.15,P<0.05）。（3）IL-2水平：①感染前。A组刺激小鼠产生IL-2水平［（1490.05±215.35）pg/ml］高于B组［（718.70±269.29）pg/ml］（t=7.763,P<0.05）;A1组［（1738.91±358.40）pg/ml］高于B组（t=7.903,P<0.05）;A2组［（2270.74±193.40）pg/ml］高于B组（t=16.308,P<0.05）;②感染后。A组刺激小鼠产生IL-2水平［（806.81±306.39）pg/ml］高于B组［（335.26±176.81）pg/ml］（t=4.627,P<0.05）;A1组［（1373.22±143.75）pg/ml］高于B组（t=15.90,P<0.05）。 结论 Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白具有启动宿主体液免疫功能及增强宿主细胞免疫功能的双重作用,可能成为预防及治疗Mtb感染的免疫新策略。     

结核分枝杆菌Rpf-DNA疫苗对Mtb感染小鼠免疫保护作用的研究

目的 评价Mtb复苏因子DNA疫苗（resuscitation-promoting factor DNA,Rpf-DNA）对Mtb感染宿主的免疫保护作用。 方法 构建复苏因子D(Rpf D-DNA)和复苏因子E(Rpf E-DNA)质粒疫苗,180只BALB/c小鼠（4周龄）分为6组,每组30只,分别用空质粒、Rpf D-DNA质粒、Rpf E-DNA质粒、BCG、生理盐水免疫,H37Rv标准株气溶胶感染。检测血清复苏因子（Rpf）抗体、IFN-γ;RpfD、E刺激淋巴细胞后进行淋巴细胞增殖、细胞杀伤实验;检测细胞上清IFN-γ、IL-12、IL-2;对肺组织进行病理学检测和细菌负荷（CFU）计数。 结果 （1）疫苗免疫组血清Rpf D、Rpf E抗体水平：Rpf D组0.32±0.1,Rpf E组0.39±0.1,BCG组0.02±0.01,空质粒组0.01±0.0,生理盐水组0.09±0.04,空白对照组0.03±0.01,RpfD组与RpfE组抗体水平与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义,F值分别为Rpf D：45.6,43.2,45.1,45.7;Rpf E：51.6,53.6,51.0,52.2;P值均<0.01。血清IFN-γ：Rpf D组（43.9±24.8）pg/ml,Rpf E组（45.9±21.0）pg/ml,BCG组（21.0±11.0）pg/ml,空质粒组（7.9±4.9）pg/ml,生理盐水组（4.7±2.1）pg/ml,空白对照组（5.8±4.7）pg/ml,Rpf D、Rpf E质粒组与BCG组比较差异有统计学意义（F值分别为Rpf D：10.2;Rpf E：12.4;P值均<0.05）, 与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义,F值分别为Rpf D：15.6,17.8,17.3;Rpf E：17.5,21.1,20.7;P值均<0.01。（2）淋巴细胞增殖实验CCK-8：Rpf D组176.0±4.2,Rpf E组183.0±4.3,BCG组101.0±1.1,空质粒组100.0±6.8,生理盐水组104.0±8.4,空白对照组116.0±2.2,RpfD、RpfE质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D：9.5,10.1,10.0,9.0;Rpf E：11.2,12.9,11.7,10.3;P值均<0.05。细胞杀伤实验：Rpf D组32.0±3.2,Rpf E组30.0±4.2,BCG组16.0±5.9,空质粒组3.3±1.5,生理盐水组6.7±0.5,空白对照组7.3±3.5,Rpf D、Rpf E质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D：8.8,14.5,13.7,11.9;Rpf E：8.1,12.5,11.6,11.1;P值均<0.05。（3）Rpf D、Rpf E蛋白各自刺激淋巴细胞后上清细胞因子检测：IL-2：Rpf D组9.5±2.4,Rpf E组9.2±1.2,BCG组2.4±2.1,空质粒组1.2±0.3,生理盐水组1.8±1.0,空白对照组1.5±0.7,Rpf D、Rpf E质粒组与其他各组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D：12.5,14.6,13.5,13.9;Rpf E：12.0,13.6,13.1,13.2;P值均<0.05。IFN-γ：Rpf D组22.2±5.7,Rpf E组28.7±14.4,BCG组16.1±10.1,空质粒组9.8±1.6,生理盐水组13.2±2.1,空白对照组15.7±2.9,RpfD、RpfE质粒组与其他各组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D：7.8,12.6,8.7,8.3;Rpf E：11.3,16.4,14.7,14.2;P值均<0.05。 结论 实验表明复苏因子疫苗能诱导Mtb感染小鼠产生体液免疫和细胞免疫,有希望成为结核病候选疫苗之一。     

结核病新疫苗的免疫毒理学评价方法研究

目的 建立疫苗评价用豚鼠免疫毒理学评价方法,并应用建立的评价指标对结核病新疫苗（耻垢疫苗）的免疫毒性进行初步评价。 方法 制备豚鼠过敏模型30只,阴性对照15只。建立豚鼠血清总IgG1抗体检测和外周血嗜碱粒细胞体外刺激培养上清、支气管肺泡灌洗液上清,以及腹腔灌洗液中肥大细胞体外刺激培养上清中的过敏性介质（组胺和白三烯）含量的检测方法。将豚鼠分成3组,分别为过敏模型组、耻垢疫苗组和阴性对照组,每组6只,应用已建立的以上几种评价指标初步进行了结核病新疫苗（耻垢疫苗）的免疫毒性评价。结果 以6 μg/ml羊抗豚鼠IgG1抗体包被,待测血清稀释1:10⁵,以及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗豚鼠IgG1抗体稀释1:20 000的实验条件为豚鼠血清总IgG1抗体的最佳检测方法。外周血嗜碱粒细胞体外刺激培养上清中,豚鼠过敏模型组和对照组中组胺含量分别为（99.37±15.34）nmol/L和（29.94±5.86）nmol/L;白三烯含量分别为（13.09±3.87）pg/ml和（2.22±0.53）pg/ml。支气管肺泡灌洗液上清组胺含量分别为（73.42±18.60）nmol/L和（31.00±12.09）nmol/L,白三烯含量分别为（123.20±16.57）pg/ml和（39.05±16.94）pg/ml。腹腔灌洗液中肥大细胞体外刺激培养上清中组胺含量分别为（39.59±12.94）nmol/L和（14.35±5.85）nmol/L,白三烯含量分别为（6.79±2.58）pg/ml和（3.09±1.18）pg/ml。以上3种不同组织来源的样本中,过敏模型组的组胺和白三烯含量与对照组相比差异均有统计学意义（组胺：t=12.60, t=5.41, t=5.20,P＜0.05;白三烯：t=8.46, t=9.15, t=3.85,P＜0.05）。应用以上方法评价结核病新疫苗未见免疫学毒理学异常反应。结论 实验初步建立了免疫毒理学评价方法,以该方法评价耻垢疫苗未见免疫毒理学异常反应。     

结核分枝杆菌ESAT6-RpfE亚单位疫苗的构建与免疫原性研究

目的 构建Mtb ESAT6-RpfE（早期分泌抗原靶6-复活促进因子E）的原核表达载体,表达和纯化融合蛋白,并对其免疫原性进行研究。方法 分别以Mtb H37Rv及临床株的基因组为模板,PCR扩增esat6、rpfE基因,依次插入pET30a质粒并在大肠埃希菌BL21中表达纯化ESAT6-RpfE蛋白。采用完全随机的方法将C57BL/6小鼠分组,每组6只,共进行了两次实验,第一次实验分为ESAT6、RpfE、ESAT6 RpfE、PBS、BCG五组,佐剂为二甲基三十六烷基胺（dimethyl dioctyldecyl ammonium bromide,DDA）;第二次实验有ESAT6-RpfE、PBS、BCG三组,佐剂为DPG［DDA+poly(I:C)+明胶］。分别于0、3、6周皮下免疫C57BL/6小鼠。末次免疫8周后,用特异性抗原ESAT6及RpfE刺激,检测其分泌IFN-γ的水平;ELISA检测血清特异性抗体IgG2b、IgG1。结果 PCR扩增的esat6、rpfE基因序列与GenBank报道一致;融合蛋白主要以包涵体形式表达;亚单位疫苗免疫动物能够分泌RpfE特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量［(427.13±100.46)］显著高于PBS组(26.13±22.34;q=7.924,P＜0.001); 分泌ESAT6刺激特异性IFN-γ的脾淋巴细胞数量［(506.50±140.40)］明显高于PBS组(19.25±14.75;q=11.36,P＜0.001)和 BCG组(125.5±46.41;q=8.882, P＜0.001)。ESAT6-RpfE免疫组能诱导产生特异性抗体。结论 成功构建并表达ESAT6-RpfE融合蛋白。此融合蛋白可在C57BL/6小鼠中诱导抗原特异性的免疫应答,可作为新型结核亚单位疫苗的候选疫苗予以进一步研究。     

卡介苗对支气管哮喘大鼠气道炎症的预防治疗作用及机制研究

目的 探讨卡介苗（BCG）对支气管哮喘气道炎症发生的预防治疗作用及机制.方法 Wistar雄性大鼠40只随机分为对照组、哮喘组、卡介苗治疗组（BCG组）、地塞米松治疗组（地米组）、卡介苗接种组（BCG接种组）,每组8只.除对照组外余各组每只大鼠于实验第1、8天腹腔注射10％卵白蛋白抗原混悬液致敏,第15天始超声雾化吸入1％卵白蛋白,20 min/d,共2周,制备哮喘气道炎症模型,各治疗组每次雾化前0.5h分别给予BCG、地米;卡介苗接种组在OVA致敏前7、3、1d,每只大鼠分别皮内注射BCG,余治疗同对照组用蒸馏水替代.各组于末次激发24 h后收集标本,检测大鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞总数及嗜酸性粒细胞（EOS）计数;HE染色观察气道重塑情况,计算机图像分析气道形态学参数,衡量气道重塑程度;ELISA法检测肺泡灌洗液及血清中转化生长因子-β1（TGF-β1）含量;免疫组织化学（SABC）法检测E钙黏蛋白（E-cadherin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤维连接蛋白（Fibronectin）的表达.结果 哮喘大鼠支气管肺泡灌洗液细胞总数及嗜酸性粒细胞计数明显增多;HE染色光镜下可见哮喘组支气管管壁变厚、气道变窄,气道上皮受损肿胀,部分可见脱落;哮喘组BALF及血清中TGF-β1含量增加,上皮标志物E-cadherin表达下降,间质的标志物Fibronectin、α-SMA表达增加;BCG和地米治疗组及BCG接种组,BALF细胞总数、EOS计数及气道改变程度等较哮喘组明显减轻,BALF及血清TGF-β1含量较哮喘组下降,E-cadherin表达升高,Fibronectin、α-SMA的表达下降,与哮喘组、对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.01）.结论 ①变应原刺激导致TGF-β1分泌增加,进而引起上皮细胞损伤间质转化是导致哮喘性气道炎症形成的重要机制之一;②卡介苗通过免疫调节作用减轻TGF-β1所致的气道上皮细胞损伤及间质转化对哮喘性气道炎症和气道阻?     

多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗诱导小鼠脾细胞凋亡的研究

目的探讨多房棘球绦虫（Em）重组卡介苗（BCG—EmⅡ／3）疫苗免疫对Em原头节攻击小鼠脾细胞凋亡的影响。方法Balb／c小鼠随机分为疫苗皮下注射组、鼻腔接种组、空载体对照组、卡介苗（BCG）对照组和PBS对照组。免疫8周时用Em原头节攻击感染，感染后18周剖杀小鼠，计算减蚴率；取脾分离脾细胞，流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率。结果与PBS对照组相比，疫苗皮下注射组和鼻腔内接种组小鼠检获泡球蚴质量均降低（q=2．65、3．68，P〈0．05或P〈0．01），疫苗鼻腔内接种组与皮下注射组比较，检获泡球蚴质量明显降低（q=2．78，P〈0．05），疫苗接种组的减蚴率为63．23％-74．70％；疫苗接种组的脾细胞凋亡发生率明显低于PBS对照组（P〈0．01）；皮下注射组的脾细胞凋亡发生率明显低于鼻腔内接种组（P〈0．01）。结论泡球蚴感染可引起小鼠脾细胞发生凋亡，多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ／3疫苗接种可抑制感染鼠脾细胞凋亡。     

冠状动脉粥样硬化患者外周血蛋白激酶C受体蛋白表达与冠状动脉狭窄的关系

目的探讨冠状动脉粥样硬化患者外周血蛋白激酶C受体蛋白(RACK1)的表达变化及与冠状动脉狭窄程度的关系。方法入选初诊为冠状动脉粥样硬化性心脏病的患者83例,根据冠状动脉造影结果,采用冠状动脉狭窄程度积分评价其狭窄程度。患者被分为4组:Ⅰ组(0分)即为对照组;Ⅱ组(1～10分);Ⅲ组(11～20分);Ⅳ组(>20分)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测所有患者外周血RACK1 mRNA的表达情况。结果Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的RACK1 mRNA表达水平均显著高于Ⅰ组(t分别为10.62,12.90,14.00,均为P<0.05),而Ⅲ组和Ⅳ组又显著高于Ⅱ组(t分别为9.40和10.74,均为P<0.05),Ⅲ组、Ⅳ组两组间比较差异无统计学意义(t=1.43,P>0.05)。相关分析显示,冠状动脉粥样硬化患者外周血RACK1 mRNA表达水平与冠状动脉狭窄程度存在相关性,相关系数rs=0.59(P<0.01)。结论 RACK1在冠状动脉粥样硬化患者外周血中表达上调,且与冠状动脉狭窄程度相关。     

日本呼吸学会评分系统和GAP分期标准与特发性肺纤维化患者预后的相关性分析

目的比较现行日本呼吸学会(Japanese respiratory society,JRS)评分系统和GAP(gender,age and physiologic variables)分期标准在评估特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)患者疾病严重程度上的一致性及临床应用价值。方法回顾性收集2011年1月至2016年1月在上海市肺科医院住院期间确诊IPF的155例患者,其中男149例,女6例,年龄40~80岁,平均(63±7)岁。分别使用JRS评分系统及GAP分期标准对患者进行疾病严重度分期,JRS评分Ⅰ期91例(91/155,58.7%),Ⅱ期29例(29/155,18.7%),Ⅲ期24例(24/155,15.5%),Ⅳ期11例(11/155,7.1%);GAP分期Ⅰ期89例(89/155,57.4%),Ⅱ期52例(52/155,33.5%),Ⅲ期14例(14/155,9.0%)。所有患者均进行为期2年的随访,分析不同严重程度患者的预后及生存情况。结果按照GAP分期,各期患者的年龄、性别、体征、脉搏氧饱和度(SpO2)、超敏C反应蛋白、圣乔治评分(SGRQ)、二氧化碳分压(PaCO2)、6 min步行试验及6 min步行试验后SpO2差异无统计学意义(均P>0.05);吸烟史(各期分别为68、37、9例)、存在呼吸道症状(各期分别为70、48、14例)、合并肺动脉高压(各期分别为22、20、8例)、ESR[各期分别为(24±17)、(30±21)、(41±22)mm/1 h]、PaO2[各期分别为(92±24)、(81±20)、(74±15)mmHg,1 mmHg=0.133 kPa]、FVC[各期分别为(2.9±0.6)、(2.2±0.5)、(1.6±0.3)L]及FEV1[各期分别为(2.4±0.5)、(1.8±0.5)、(1.4±0.3)L]差异有统计学意义(P<0.05)。按照JRS评分,各期患者的年龄、性别、吸烟史、呼吸道症状及体征、超敏CRP、ESR、圣乔治评分、6 min步行试验及FEV1差异无统计学意义(P>0.05);PaO2[各期分别为(99±22)、(76±3)、(66±3)、(54±4)mmHg]、PaCO2[各期分别为(39±3)、(40±3)、(39±4)、(38±5)]、SpO2[各期分别为(97.2±1.2)%、(95.2±1.0)%、(93.2±1.3)%、(87.4±4.1)%]、6 min步行试验后SpO2[各期分别为(94.1±1.0)%、(93.2±1.2)%、(90.2±1.1)%、(87.4±4.1)%]、合并肺动脉高压(各期分别为21、13、11、5例)及FVC[各期分别为(2.6±0.7)、(2.6±0.7)、(2.2±0.6)、(2.2±0.7)L]差异有统计学意义(P<0.05)。两种评分方法结果存在一致性(P<0.05),但一致性不强(Kappa值<0.75)。按照GAP分期标准的各期患者1年生存率差异无统计学意义(P>0.05),2年生存率差异有统计学意义(P<0.05)。按照JRS评分系统的各期患者1年及2年生存率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论GAP分期标准和JRS评分系统在评估IPF患者疾病严重程度上准确性和一致性均不高,两种评分方法在评估生存率方面未能体现出价值。     

胸腔内注射不同药物治疗肺癌胸腔积液疗效对比观察

目的观察不同药物治疗恶性胸腔积液的疗效。方法肺癌恶性胸腔积液66人,随机分成四组:顺铂组50 mg/m2;第1～5天,注药前后充分止呕吐,3周后重复一次;IL-2组200 IU第1～7天,3周后重复一次;金葡素组200 ng(20 ml)1次/周,连用4周;顺铂+金葡素组:顺铂50 mg/m2+金葡素200 ng(20 ml)1次/周,连用4周。结果顺铂组疗效36.8%,IL-2组疗效41.6%,金葡素组疗效81.25%,顺铂+金葡素组疗效89.4%。金葡素组疗效高于顺铂组,有显著差异(P<0.01),也高于IL-2组(P<0.01)。顺铂+金葡素组疗效高于顺铂组,有显著差异(P<0.01),也高于IL-2组(P<0.01)。结论顺铂、IL-2、金葡素及顺铂+金葡素治疗肺癌胸腔积液均有效。顺铂+金葡素疗效并不高于单药金葡素。     

乙型肝炎自然病程中免疫逃逸期肝纤维化Ⅰ～Ⅳ期HBsAg水平的动力学研究

目的研究乙型肝炎自然病程中免疫逃逸期肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期血清HBsAg水平以及用相同肝实质细胞体积分摊的肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期血清HBsAg水平的动力学特点。方法应用电化学发光法检测和两两比较肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期血清HBsAg的水平;并且,进一步用相同肝实质细胞体积分摊并且两两比较肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期血清HBsAg的水平。结果 肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期的血清HBsAg水平分别为（6 482.86±2 725.05）COI/mL、（7 558.18±2 011.60）COI/mL、（6 212.00±2 483.61）COI/mL和（6 053.81±2 958.06）COI/mL,用相同肝实质细胞体积进行分摊,在肝纤维化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期的HBsAg水平分别为（9 812.11±4 124.49）COI/mL、（12 050.66±3 207.26）COI/mL、（10 528.81±4 209.51）COI/mL和（11 409.36±5 574.93）COI/mL,无论分摊前和分摊后4期之间无明显差异（F分摊前=1.244,P=0.307和F分摊后=0.862,P=0.465）。结论慢性乙型肝炎免疫逃逸期肝纤维化从Ⅰ期向Ⅳ期进展,即使在相同肝实质细胞体积分摊的前提下,HBsAg表达仍然保持稳定的水平。     

CA19-9、CA125和碱性磷酸酶对胆囊癌临床分期的意义

背景：近年原发性胆囊癌的发病率明显上升,提高胆囊癌的早期诊断是改善治疗和预后、提高生存率和生活质量的关键。目的：探讨检测CA19-9、CA125和碱性磷酸酶（AKP）对胆囊癌的临床分期以及术前评估的意义。方法：收集2003年1月~2010年5月华中科技大学同济医学院附属协和医院经病理检查确诊为原发性胆囊癌的159例患者,对不同TNM分期胆囊癌患者的血清CA19-9、CA125和AKP进行比较分析。结果：Ⅰ＋Ⅱ＋ⅢA期、ⅢB期、Ⅳ期胆囊癌患者血清CA19-9、CA125和AKP水平相比差异有统计学意义（P〈0.01）;Ⅰ＋Ⅱ＋ⅢA期血清CA19-9阳性率和AKP异常率显著低于ⅢB期、Ⅳ期（P〈0.01）,而血清CA125阳性率显著低于Ⅳ期（P〈0.01）。Ⅰ＋Ⅱ＋ⅢA期血清CA19-9水平和阳性率以及AKP水平和异常率均显著低于ⅢB＋Ⅳ期（P〈0.01）,而血清CA125水平和阳性率均无明显差异。联合检测的阳性率明显高于单个指标的阳性率（P〈0.01）。结论：CA19-9、CA125、AKP可作为胆囊癌的辅助诊断手段,对胆囊癌的临床分期和术前评估具有较好的临床价值。联合检测可提高诊断效率。     

口服Ⅱ型胶原肽—霍乱毒素B亚单位复合物对胶原诱导性关节炎的影响

目的 关节炎急性期胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠口服Ⅱ型胶原免疫活性肽段(250-270))[CⅡ（250-270）]和霍乱毒素B亚单位(CTB)的共价复合物,观察其是否能产生免疫耐受。方法 DBA/1小鼠分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组,Ⅰ组为健康对照,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组小鼠制成CIA。Ⅲ组小鼠于关节炎发病率达到100％后,灌胃CⅡ(250-270 )-CTB共价复合物,Ⅳ组小鼠于初次免疫后第14日灌胃CⅡ(250-270)与CTB的混合物。记录小鼠关节炎症评分及病理评分。关节炎发生率比较采用Fisher精确概率法,关节炎累计评分及组织病理累计评分采用方差分析。结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组的关节炎发生率分别为0、100％、100％和25％;关节炎累计评分均值分别为0、5.0±1.7、10.8±2.8和1.0±2.0;关节炎病理累计评分均值分别为0、16±8、32±13和7±6。结论 CIA小鼠于免疫后的关节炎临床前期口服CⅡ( 250-270)与CTB的混合物能抑制关节炎的发生及严重程度,关节炎急性炎症期口服CⅡ(250-270)-CTB共价复合物后可能使关节炎症加重。     

不同水温下不同时间对福寿螺体内广州管圆线虫的杀灭作用

目的观察不同水温下不同作用时间福寿螺体内广州管圆线虫死亡率的变化规律,为福寿螺的加工提供参考。方法将感染广州管圆线虫的福寿螺随机分为4组,记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组。Ⅰ组5只,作为阴性对照;Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组再分别分为4小组,分别为Ⅱ30、Ⅱ60、Ⅱ90、Ⅱ120,Ⅲ30、Ⅲ60、Ⅲ90、Ⅲ120,Ⅳ10、Ⅳ30、Ⅳ45、Ⅳ60,每小组5只。Ⅱ、Ⅲ组各小组分别在80±1℃、90±1℃的水中煮30s、60s、90s、120s,Ⅳ组各小组分别在100±1℃沸水中煮10s、30s、45s、60s。将所有螺壳消化后,观察福寿螺体内广州管圆线虫的死亡情况。结果80℃、90℃、100℃时福寿螺体内广州管圆线虫死亡率达100%的最短时间分别为90s、90s、45s。运用Spearman等级相关,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组作用时间与加权平均死亡率(WM)呈显著正相关(P<0.01)。运用3次模型分析Ⅱ、Ⅲ组作用时间与WM的曲线方程分别为Y=0.274+0.016x+2.01E-007x3(R=1,P<0.05);Y=0.274+0.016x-9.46E-005x2+1.30E-007x3(R=1,P<0.05)。显微镜下观察高温作用后的广州管圆线虫第Ⅲ期幼虫(L3)结构破坏严重。结论温度相同时,L3死亡率与时间呈正相关;作用时间过短,80℃、90℃<1 min,100℃<30s,不能将L3全部杀死。     

Relationship between the expression of iNOS, VEGF, tumor angiogenesis and gastric cancer

AIM: To investigate the relationship between theexpression of inducible nitric oxide synthase(iNOS),vascular endothelial growth factor(VEGF),themicrovascular density(MVD) and the pathologicalfeatures and clinical staging of gastric cancerMETHODS: Immunohistochemical staining was used fordetecting the expression of iNOS and VEGF in 46resected specimens of gastric carcinoma; themonoclonal antibody against CD34 was used fordisplaying vascular endothelial cells, and MVD wasdetected by counting of CD34-positive vascularendothelial cells.RESULTS: Of 46 resected specimens of gastriccarcinoma,the rates of expressions of iNOS and VEGFwere 58.70% and 76.09%, respectively,and MVDaveraged 55.59± 19.39.Judged by the standard TNMcriteria, the rate of expression of iNOS in stage ⅣV(84.46%) was higher than those in stage Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ(Fishexact probabilities test, P=0.019,0.023 and 0.033,respectively);the rates of expression of VEGF in stageⅢ, Ⅳ (76.0%,92.31%, respectively) were higher thanthose in stage Ⅰ, Ⅱ (Fish exact probabilities test,P=0.031,0.017,0.022 and 0.019). MVDs in stage Ⅲ, Ⅳ(64.72 ± 14.96,67.09± 18.29,respectively) werehigher than those in stage Ⅰ ,Ⅱ(t=2.378,4.015,2.503and 2.450,P＜0.05,P＜0.001,P＜0.001,P＜0.05,respectively). In 37 gastric carcinoma specimens withlymph node metastasis, MVD(68.69±18.07) and therates of expression of iNOS and VEGF(70.27%,83.78%,respectively) were higher than those in the specimenswith absence of metastasis (t=2.205, x2=6.3587,x2=6.2584,P＜0.01, P＜0.05,P＜0.05, respectively). MVDand the expressions of iNOS and VEGF were notcorrelated to the location ,size or grade of tumor, nor withthe depth of invasion of tumor; MVDs in the positive iNOSand VEGF specimens(59.88±18.02,58.39±17.73,respectively) were higher than those in the negative iNOSand VEGF specimens (x2=6.3587 and 6.1574, P＜0.05,P＜0.05,respectively) ;thus the expressions of iNOS andVEGF was correlated to MVD, but the expression of iNOSwas not correlated to that of VEGF. In addition,of the46 surviving patients, the 5-year survival rate ofpatients with positive iNOS or VEGF tumors wassignificantly less than that of patients with negativeiNOS-or VEGF tumors(x2=4.3842 and 5.4073,P＜0.05,P＜ 0.05,respectively).CONCLUSION: The expressions of iNOS and VEGF areclosely related to tumor angiogenesis, and are involvedin the advancement and the lymph node metastasis;thus MVD and the expressions of iNOS and VEGF mayserve indexes for evaluating staging of gastriccarcinoma and forecasting its risk of metastasis, whichwill help establish a comprehensive therapeuticalmeasure of post-operative patients and provide a newapproach to tumor therapy.     

促红细胞生成素及血红蛋白与老年慢性心力衰竭患者的相关性

目的探讨促红细胞生成素(EPO)和血红蛋白(Hb)与慢性心力衰竭(CHF)的相关性。方法选择老年CHF患者1 69例,根据本次住院确诊的心功能(NYHA)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级依次分为1组33例、2组34例、3组59例和4组4 3例。对4组患者Hb、EPO及是否死亡进行logistic回归分析。结果与1组比较,2、3和4组lg EPO水平明显上升,Hb水平明显下降(P<0.01);4组患者lg EPO和Hb水平两两比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。Hb、EPO及肌酐(OR=0.978,35.820,1.013,P<0.01)均是影响老年CHF患者住院死亡的危险因素。结论 EPO随患者CHF程度的加重而升高,Hb值则降低。Hb、EPO及肌酐均为影响CHF患者住院死亡的危险因素。     

Protective efficacy of BCG Tokyo 172 in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis

BCG Tokyo 172 strain was examined for its protective efficacy against pulmonary tuberculosis in a guinea pig model. Guinea pigs were vaccinated with an intradermal injection of 10(3) CFU of BCG Tokyo 172 strain. BCG Copenhagen 1331 was employed as a control strain. Eight weeks after the vaccination, the animals were infected with about 10 CFU of M. tuberculosis H37Rv by a respiratory route in an aerosol chamber. Five weeks after infection, the animals were euthanized and their spleens, lungs and livers were obtained for enumeration of M. tuberculosis H37Rv and histopathological examinations. The mean log10 CFU of M. tuberculosis H37Rv recovered from right lower lung lobes of guinea pigs vaccinated with BCG Tokyo 172 (frozen), BCG Tokyo 172 (freeze-dried), BCG Copenhagen 1331 (freeze-dried) and placebo were 4.72, 4.23, 4.35 and 5.76, respectively. The mean log10 CFU of the bacteria recovered from spleens were 2.11, 1.51, 1.37 and 5.90, respectively. There was a significant difference in bacterial recovery from both lung and spleen between the vaccinated and the non-vaccinated groups. No significant difference was seen among the groups vaccinated with different strains of BCG in any organ. The lungs exhibited just small granulomatous nodules and the spleens showed no granulomatous nodules in the BCG-vaccinated guinea pigs. On the other hand, the lungs and spleens from non-vaccinated guinea pigs showed much larger granulomatous nodules with central necrosis. These histopathological difference between the vaccinated and the non-vaccinated guinea pigs was consistent with the difference of bacterial growth between them. The results of this study have clearly indicated that BCG Tokyo 172 strain possesses a significant protective efficacy against M. tuberculosis as well as BCG Copenhagen 1331 strain. These results have also shown that the respiratory infection model in guinea pigs is very useful to evaluate efficacy of vaccines against pulmonary tuberculosis.