昆明鼠自体卵丘细胞与早期胚胎序贯共培养对胚胎体外发育潜能的影响

目的:评价昆明鼠胚胎与自体卵丘细胞序贯共培养对提高早期胚胎体外发育潜能的影响。方法:分两组进行实验,序贯共培养组使用分离培养的卵丘细胞与序贯培养液构建培养体系,与昆明鼠早期胚胎进行共培养;序贯培养组使用序贯培养液对早期胚胎进行序贯培养,观察两组胚胎各阶段囊胚形成率,检测囊胚总细胞数、囊胚细胞凋亡数,囊胚进一步培养获得的干细胞系数。结果:序贯共培养3d后总的囊胚形成率为68.13%,序贯培养组囊胚形成率为45.31%(P<0.05);囊胚总细胞数分别为76.52和38.57(P<0.05),细胞凋亡率分别为7.44%和16.28%(P<0.05)。将囊胚进一步培养,共培养组干细胞建系率为12.50%,序贯培养组未能建系。结论:昆明鼠胚胎与自体卵丘细胞序贯共培养与序贯培养比较,前者能更好地模拟体内环境,提高早期胚胎体外发育潜能。     

4859枚非优质胚胎和废弃胚胎囊胚培养的临床观察

目的:探讨不孕症患者辅助生殖治疗过程中废弃的胚胎和新鲜周期移植后不够冷冻标准胚胎培养的临床意义。方法:收集本院不孕症患者接受辅助生殖治疗后第3天(D3)废弃的胚胎和移植后不够冷冻标准的胚胎,序贯培养至囊胚,将可利用囊胚进行冷冻保存。分析年龄、不孕类型、受精方式、胚胎卵裂球数目、集合培养胚胎的个数、胚胎质量分级等与囊胚形成的关系。同时比较冻融周期移植正常的卵裂期胚胎和培养形成的可利用囊胚的妊娠和出生婴儿情况。结果:共收集4859枚废弃的胚胎和新鲜周期移植后不够冷冻标准的胚胎,培养至第6天(D6),形成囊胚2020枚(41.6%),优质囊胚661枚(32.7%)。D3胚胎卵裂球数目≥10个,囊胚和优质囊胚的形成率最高,7~9个次之,6个时囊胚和优质囊胚的形成率急剧下降。D3Ⅰ~Ⅱ级胚胎囊胚形成率和优质囊胚显著高于Ⅲ、Ⅳ级胚胎(P0.05)。集合培养有利于囊胚的形成,每个微滴培养1个胚胎时优质囊胚形成率最低。冻融胚胎移植周期中移植D3胚胎和囊胚的临床妊娠率、流产率、双胎率、活产率、出生体重均为无统计学差异,其D3胚胎着床率低于囊胚且有统计学差异。结论:部分非优质胚胎和废弃胚胎仍具有发育潜能,囊胚培养有助于筛选出高发育潜能胚胎并进行保存,冻融囊胚移植可提高患者卵子的利用率,节约患者的治疗成本。     

Hemi-straw玻璃化与程序化冷冻小鼠不同发育阶段胚胎的效果

目的:探讨半细管(Hem i-straw)玻璃化方法与程序化方法冷冻不同发育阶段小鼠胚胎的效果。方法:采用慢速程序化方法与玻璃化方法冷冻小鼠原核期胚胎、卵裂期及早期囊胚期胚胎。解冻后观察存活率、囊胚形成率。结果:采用玻璃化方法冷冻小鼠卵裂期与早期囊胚期胚胎的存活率为92.7%与95.5%,显著高于玻璃化冷冻原核期胚胎的存活率79.8%与程序化冷冻的各组(均P<0.01)。程序化冷冻早期囊胚的存活率仅为50.2%,显著低于其他组(均P<0.01)。经培养后囊胚的形成率比较,程序化冷冻组内无显著性差异(P>0.05),但均显著低于玻璃化冷冻组(均P<0.01)。玻璃化冷冻卵裂期与早期囊胚组的囊胚形成率高达90.1%与92.2%,显著高于原核期胚胎玻璃化冷冻组69.5%(均P<0.01)。结论:胚胎行冷冻保存时,玻璃化冷冻效果较程序化冷冻好,且选择早期囊胚可获最佳冷冻效果。     

不同阶段胚胎培养与胚胎移植妊娠结局的临床研究

目的:探讨早期胚胎培养和囊胚培养对胚胎移植妊娠结局的影响。方法:随机选择53个周期进行早期胚胎培养,21个周期进行囊胚培养;采用Quinn,s AdvantageTM序贯培养方法,常规取卵、受精、观察卵裂;早期胚胎培养行2D或3D移植,囊胚培养行5D或6D选择3期以上胚胎移植,并观察两者的妊娠结局。结果:囊胚培养移植组21个周期,平均年龄31.67岁,共获卵子数458枚,平均获得卵子数21.8枚,受精率85.37%,卵裂率97.19%;而早期胚胎培养移植组53个周期,平均年龄27.63岁,共获卵子数461枚,平均获得卵子数8.7枚,受精率77.87%,卵裂率96.66%;随着培养时间的延长,优质胚胎数量逐渐减少,囊胚培养移植组从day2的88.16%降到day4的28.42%,早期胚胎移植组从day2的64.9%降到day3的62.5%;无潜能胚胎率逐渐增高,囊胚移植组由day2的11.84%升到day6的71.32%,早期胚胎移植组从day2的31.75%升到day3的37.5%。统计资料可以看出囊胚培养移植组的妊娠率57.14%,明显高于早期胚胎培养移植组的妊娠率32.08%,经统计学处理差异有显著性意义(0.05>P>0.01);流产方面差异无统计学意义(P>0.05),也可能与例数少有关。结论:采用Quinn s AdvantageTM序贯培养方法可获得较高的受精率、卵裂率,并且囊胚培养移植切实可行,妊娠率明显提高。     

不同阶段胚胎培养与胚胎移植妊娠结局的临床研揪

目的探讨早期胚胎培养和囊胚培养对胚胎移植妊娠结局的影响.方法随机选择53个周期进行早期胚胎培养,21个周期进行囊胚培养;采用Quinn,s AdvantageTM序贯培养方法,常规取卵、受精、观察卵裂;早期胚胎培养行2D或3D移植,囊胚培养行5D或6D选择3期以上胚胎移植,并观察两者的妊娠结局.结果囊胚培养移植组21个周期,平均年龄31.67岁,共获卵子数458枚,平均获得卵子数21.8枚,受精率85.37%,卵裂率97.19%;而早期胚胎培养移植组53个周期,平均年龄27.63岁,共获卵子数461枚,平均获得卵子数8.7枚,受精率77.87%,卵裂率96.66%;随着培养时间的延长,优质胚胎数量逐渐减少,囊胚培养移植组从day2的88.16%降到day4的28.42%,早期胚胎移植组从day2的64.9%降到day3的62.5%;无潜能胚胎率逐渐增高,囊胚移植组由day2的11.84%升到day6的71.32%,早期胚胎移植组从day2的31.75%升到day3的37.5%.统计资料可以看出囊胚培养移植组的妊娠率57.14%,明显高于早期胚胎培养移植组的妊娠率32.08%,经统计学处理差异有显著性意义(0.05＞P＞0.01);流产方面差异无统计学意义(P＞0.05),也可能与例数少有关.结论采用Quinn's AdvantageTM序贯培养方法可获得较高的受精率、卵裂率,并且囊胚培养移植切实可行,妊娠率明显提高.     

人类胚胎干细胞与胚胎生殖细胞

胚胎干细胞(ES)是早期胚胎(桑椹胚,囊胚)或原始生殖细胞(PGCs)经体外分化抑制培养,在传代过程中筛选出来的具有发育全能性或多能性的细胞。这种细胞具有与早期胚胎相似的分化潜能和正常二倍体核型的特点,因此兼有早期胚胎卵裂球及体细胞的某些特性。在发育生物学、遗传学、生物工程、动物克隆、转基因动物中,具有广泛的应用价值。     

人类干细胞与胚胎生殖细胞

胚胎干细胞（ES）是早期胚胎（桑椹胚，囊胚）或原始生殖细胞（PGCs)经体外分化抑制培养，在传代过程中筛选出来的具有发育全能性或多能性的细胞。这种细胞具有与早期胚胎相似的分化潜能和正常二倍体核型的特点，因此兼有早期胚胎卵裂球及体细胞的某些特征。在发育生物学、遗传学、生物工程、动物克隆、转基因动物中，具有广泛的应用价值。     

人类胚胎干细胞与胚胎生殖细胞

胚胎干细胞(ES)是早期胚胎(桑椹胚，囊胚)或原始生殖细胞(PGCs)经体外分化抑制培养，在传代过程中筛选出来的具有发育全能性或多能性的细胞。这种细胞具有与早期胚胎相似的分化潜能和正常二倍体核型的特点，因此兼有早期胚胎卵裂球及体细胞的某些特性。在发育生物学、遗传学、生物工程、动物克隆、转基因动物中，具有广泛的应用价值。     

昆明鼠胚胎干细胞系建立中原代克隆生长及其传代方法的研究

目的:探讨昆明鼠胚胎内细胞团分离方法、原代干细胞克隆分离时机及干细胞传代方法对干细胞建系效率的影响。方法:取昆明鼠3.5d囊胚建胚胎干细胞系,比较全胚培养法与免疫外科法两种内细胞团分离方法对胚胎干细胞建系效率的影响,观察原代克隆的分离时机,机械法传代和酶消化传代对胚胎干细胞建系效率的影响。结果:全胚培养法30个囊胚建系3个,免疫外科法32个囊胚建系4个,两组均可以有效地形成胚胎干细胞系;昆明鼠原代干细胞克隆分离最佳时机是增殖4～6d;5代以前的干细胞以机械传代方法较好,5代后用酶消化法传代效果较好。结论:全胚培养法和免疫外科法均能有效建立昆明鼠胚胎干细胞系,采用机械化与酶消化法相结合传代更适合昆明鼠干细胞建系。     

细胞松弛素B在人类体外成熟卵子冷冻中的作用

目的:探讨细胞松弛素B在人类体外成熟卵子玻璃化冷冻中的作用。方法:收集常规胞浆内单精子显微注射-胚胎移植(ICSI-ET)周期中未成熟卵母细胞234枚(包括生发泡期即GV期和第1次减数分裂中期即MⅠ期),在体外培养24～48 h,181枚卵母细胞成熟(排出第2极体),随机分成3组并行玻璃化冷冻。A组(43枚)用细胞松弛素B(CB)预处理30 min后行玻璃化冷冻;B组(66枚)用CB预处理20 min后行玻璃化冷冻,C组(72枚)未用CB预处理直接行玻璃化冷冻。D组为对照组30枚体内成熟卵子未用CB处理直接玻璃化冷冻。各组卵子冷冻3周后解冻,复苏的卵子行ICSI辅助授精,观察各组成活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果:冻融后的体外成熟卵子,其成活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率均显著低于体内成熟卵子(P<0.05)。A组的成活率显著低于B、C两组(P<0.05),A、B、C 3组间的受精率、卵裂率差异无统计学意义(P>0.05),A、B两组未获囊胚,C组仅有1枚囊胚。结论:冻融体外成熟卵子,成活率、受精率、卵裂率均下降,囊胚形成率低,胚胎后期发育潜能显著降低。CB预处理未能提高卵子冷冻的成活率、受精率、卵裂率及胚胎的发育潜能。     

Alkaline phosphatase activity in bovine oocytes and preimplantation embryos as affected by removal of the zona pellucida and culture medium constituents

The aims of the present study were: (1) to characterize alkaline phosphatase (AP) activity in bovine oocytes and embryos with intact or removed zona pellucida (ZP); and (2) to evaluate the effect of culture medium constituents on AP activity. Alkaline phosphatase activity in non-matured and matured oocytes was most evident nearest the plasma membrane and perivitelline space. In more than 90% of two- to 16-cell embryos, AP activity was observed in the perivitelline space and at blastomere contacts. In blastocysts, AP activity was localized to the trophectoderm. Only after immunodissection was AP activity detected in the inner cell mass. Removal of the ZP by pronase or mechanical means reduced AP activity. Alkaline phosphatase activity was detected in evacuated ZP after mechanical removal. Specific constituents comprising the embryo culture medium altered AP activity. Alkaline phosphatase activity was reduced in eight- to 16-cell embryos and evacuated ZP cultured in CR1aa + 0.4% bovine serum albumin compared with embryos cultured in CR1aa alone or embryos co-cultured on a monolayer of Buffalo rat liver cells in the presence of 10% fetal bovine serum. The presence of AP activity at blastomere contacts and in evacuated ZP limits its usefulness as a marker for the differentiation of embryonic cells comprising the early cleavage-stage embryo.     

人皮肤成纤维细胞来源诱导性多潜能干细胞的建立和鉴定

目的建立和鉴定人皮肤成纤维细胞（HSF）来源的诱导性多潜能干细胞（iPS）。方法利用逆转录病毒将Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因导入原代HSF细胞,将其编程为iPS细胞。检测细胞内源、外源基因表达量,鉴定外源基因是否插入iPS细胞,分析细胞核型,细胞碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色,体内分化畸胎瘤,体外分化拟胚体实验,对建立的iPS细胞进行鉴定。结果（1）iPS细胞形态类似于胚胎干细胞（ES）。（2）iPS细胞内源多能基因（Nanog、Oct4、Rexl、Sox2）表达量增高,外源编程基因（Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc）表达量降低。（3）琼脂糖凝胶电泳实验证实外源基因插入iPS细胞核内。（4）iPS细胞核型正常,碱性磷酸酶活性增高,表达ES细胞特异性蛋白。（5）iPS细胞在体内能分化为畸胎瘤,在体外能分化为拟胚体。结论新建立的iPS细胞类似于ES细胞具有多向分化潜能。     

两株人胚胎干细胞的无饲养层扩增

目的:建立两株中国人胚胎干细胞(hESCs)的无饲养层的培养体系,观察条件培养基所需的饲养层密度,并探索最佳的传代方式。方法:两株人胚胎干细胞hES-846XX和hES-1846XY分别使用不同密度(3×105/mL、6×105/mL和1.2×106/mL)获得的条件培养基(CM)在无饲养层培养体系培养12代以上,用机械分离法和Ⅳ型胶原酶法进行传代,观察比较结果并对所得hESCs鉴定。结果:6×105/mL～1.2×106/mL之间的密度都是合适密度;Ⅳ型胶原酶在长期传代中优于机械法传代;所得细胞维持干细胞未分化状态和全能性。结论:无饲养层的培养体系可以用于中国胚胎干细胞培养,两株中国人胚胎干细胞(hESCs)的倍增周期、所需饲养层密度及分化率等方面与国外hESCs有明显差别。     

脐带间充质细胞来源诱导性多潜能干细胞的建立和鉴定

目的建立和鉴定脐带间充质细胞（UMC）来源的诱导性多潜能干细胞（iPS）。方法以逆转录病毒作为Sox2、KIf4、Oct4、c—Myc基因转移载体,将UMC细胞编程为iPS细胞。应用RT-PCR检测细胞基因表达量,鉴定外源编程基因是否整合到iPS细胞核内,分析细胞核型,对细胞进行碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色,体内分化畸胎瘤和体外分化拟胚体实验,对建立的iPS细胞进行鉴定。结果（1）iPS细胞形态学上类似于胚胎干细胞（ES）。（2）iPS与ES细胞内源多能基因（Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2）表达谱相类似,外源编程基因（Sox-2、KIf4、Oct-4、c—Myc）表达发生沉默。（3）外源编程基因已被插入到iPS细胞核内。（4）iPS细胞核型正常,碱性磷酸酶活性增高,表达Es细胞特异性膜蛋白（SSEA3、SSEA4）,质蛋白（TRA-1-60、TRA-1—81）,核蛋白（Nanog）。（5）iPS细胞在体内能分化为畸胎瘤,在体外能分化为拟胚体。结论iPS细胞类似于Es细胞具有多向分化潜能。     

The derivation and potential use of human embryonic stem cells

Human embryonic stem cells lines can be derived from human blastocysts at high efficiency (>50%) by immunosurgical isolation of the inner cell mass and culture on embryonic fibroblast cell lines. These cells will spontaneously differentiate into all the primary embryonic lineages in vitro and in vivo, but they are unable to form an integrated embryo or body plan by themselves or when combined with trophectoderm cells. They may be directed into a number of specific cell types and this enrichment process requires specific growth factors, cell-surface molecules, matrix molecules and secreted products of other cell types. Embryonic stem (ES) cells are immortal and represent a major potential for cell therapies for regenerative medicine. Their use in transplantation may depend on the formation of a large bank of suitable human leucocyte antigen (HLA) types or the genetic erasure of their HLA expression. Successful transplantation may also require induction of tolerance in recipients and ongoing immune suppression. Although it is possible to customize ES cells by therapeutic cloning or cytoplasmic transfer, it would appear unlikely that these strategies will be used extensively for producing ES cells compatible for transplantation. Embryonic stem cell research may deliver a new pathway for regenerative medicine.     

诱导人胚胎干细胞向子宫内膜样细胞分化的初步研究

目的:探讨无饲养层培养的人胚胎干细胞诱导分化为子宫内膜样细胞的方法。方法:将无饲养层培养的人胚胎干细胞分别通过共培养诱导法和细胞因子诱导法向子宫内膜样细胞诱导,流式细胞术检测分化的细胞中子宫内膜上皮细胞标志物细胞角蛋白18和间质细胞标志物波形蛋白的表达情况。结果:共培养诱导法和细胞因子诱导法在分化第7天均出现长梭状细胞样改变。分化第8天通过流式细胞术检测发现细胞波形蛋白表达均为阴性,部分细胞角蛋白18表达阳性,共培养诱导法分化率高于细胞因子诱导法[(55.63±10.29)%vs.(13.90±0.26)%,P<0.05]。结论:共培养诱导法和细胞因子诱导法均可使人胚胎干细胞分化为子宫内膜上皮样细胞,但前者的分化效率更高。     

Human embryonic stem cells: challenges and opportunities

Human and non-human primate embryonic stem (ES) cells are invaluable resources for developmental studies, pharmaceutical research and a better understanding of human disease and replacement therapies. In 1998, subsequent to the establishment of the first monkey ES cell line in 1995, the first human ES cell line was developed. Later, three of the National Institute of Health (NIH) lines (BG01, BG02 and BG03) were derived from embryos that would have been discarded because of their poor quality. A major challenge to research in this area is maintaining the unique characteristics and a normal karyotype in the NIH-registered human ES cell lines. A normal karyotype can be maintained under certain culture conditions. In addition, a major goal in stem cell research is to direct ES cells towards a limited cell fate, with research progressing towards the derivation of a variety of cell types. We and others have built on findings in vertebrate (frog, chicken and mouse) neural development and from mouse ES cell research to derive neural stem cells from human ES cells. We have directed these derived human neural stem cells to differentiate into motoneurons using a combination of developmental cues (growth factors) that are spatially and temporally defined. These and other human ES cell derivatives will be used to screen new compounds and develop innovative cell therapies for degenerative diseases.