MUC1基因疫苗对乳腺肿瘤抑制的实验研究

目的:研究人粘蛋白MUC1基因DNA疫苗诱导小鼠体内免疫应答及对乳腺肿瘤的特异性抑制作用。方法:采用股四头肌注射法接种PcDNA3.1(+)-MUC1质粒,通过ELISA法检测小鼠血清MUC1抗体、脾细胞产生IL-2和IFN-γ的量及血清中TNF水平,通过乳酸脱氢酶释放法测定CTL对MCF-7细胞的杀伤活性。结果:经PcDNA3.1(+)-MUC1免疫小鼠后脾细胞分泌IL-2、IFN-γ及血清TNF水平较对照组明显增高,差异有统计学意义;在效靶比为100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1时,MUC1基因疫苗免疫组小鼠CTL对人乳腺癌细胞系MCF-7杀伤率分别为63.8%、51.2%、43.5%、22.5%,较空载体PcDNA3.1(+)组小鼠和灭菌生理盐水组小鼠均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:MUC1基因DNA疫苗能够激活小鼠Th1细胞,诱导小鼠产生抗MUCl特异性抗体,诱导产生杀伤高表达MUC1基因的乳腺癌细胞的CTL,为MUC1基因疫苗用于乳腺肿瘤生物治疗提供了一定的实验依据。     

负载乳腺癌抗原的脐血树突细胞外泌体抗肿瘤免疫作用

目的:探讨负载乳腺癌抗原的人脐带血树突状细胞(DCs)分泌的外泌体的抗肿瘤免疫效应。方法:提取新鲜脐血单个核细胞,体外诱导分化为DCs,提取乳腺癌细胞MCF-7肿瘤抗原,并冲击脐血DCs,加入LPS诱导其成熟,利用流式细胞仪检测表型;超速离心法收获负载抗原的脐血DC外泌体;MTT法检测外泌体诱导的T淋巴细胞增殖反应及其激活的CTL对肿瘤细胞的杀伤效应。结果:脐血DC表面标志CD34、CD80、CD86、CD11c阳性细胞数与新鲜脐血单个核细胞相比明显增加(P<0.05);Western-Blot结果显示,负载乳腺癌的脐血DC外泌体携带有MHC-Ⅱ类、CD40、CD80、CD86分子;成熟脐血DC组及负载乳腺癌抗原脐血DC外泌体对同种异体来源的T细胞均有明显促增殖作用;负载乳腺癌抗原的脐血DC及其外泌体激活的CTL均能对乳腺癌细胞MCF-7产生显著地杀伤作用(P<0.05)。且在效靶比100∶1时,外泌体的杀伤作用高于负载抗原的脐血DC(P<0.05)。结论:负载乳腺癌抗原脐血DC分泌大量外泌体,可促进同种异体T细胞增殖,并能诱导特异性抗乳腺癌的免疫效应。     

腺病毒介导的体外免疫方法研究

目的:探讨腺病毒介导的体外免疫方法。方法:本实验中主要通过建立小鼠骨髓源树突状细胞体外培养方法,在此基础上用携带绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的腺病毒转导树突状细胞(DC),通过荧光倒置显微镜观察荧光表达,并经流式细胞仪检测GFP平均荧光强度表达以检测腺病毒转导效率。穿刺法制备小鼠脾单细胞悬液,腺病毒转导树突状细胞与脾细胞以1:10比例进行混合细胞培养后,经多肽(HYLSTQSAL)刺激通过流式细胞仪检测T淋巴细胞IFN-γ的分泌。结果:经多肽刺激后流式细胞仪可检测到T淋巴细胞IFN-γ的分泌。结论:成功建立腺病毒介导树突状细胞(DC)抗原呈递的体外免疫方法。     

负载乳腺癌干细胞RNA树突状细胞疫苗抗肿瘤免疫机制的研究

目的:通过制备负载乳腺癌干细胞RNA的树突状细胞疫苗,研究其抗肿瘤免疫机制.方法制备乳腺癌干细胞RNA树突状细胞疫苗的采用细胞毒性试剂盒检测2种乳腺癌干细胞疫苗[(A组,CD44+CD24-+MCF-7-CTLs)、(B组,MCF-7-CTLs)]和(C组,DC-CTLs)的体外细胞杀伤能力.取24只小鼠均分为四组:A1组皮下接种活化的A组疫苗+MCF-7乳腺癌细胞;B1组接种活化的B组疫苗+MCF-7乳腺癌细胞;C1组皮下注射活化的DCs-CTLs+MCF-7乳腺癌细胞;D1组单用MCF-7乳腺癌细胞作为对照.分析裸鼠接种后肿瘤在体内的生长情况.结果:体外对CD44+CD24-+MCF-7乳腺癌细胞杀伤能力强度:A组>B组>C组(P<0.05).体外对MCF-7乳腺癌细胞杀伤能力强度:B组>A组>C组(P<0.05).在体成瘤实验显示,B1组和A1组的成瘤时间分别为第7周和第6周,明显长于D1组(第1周)和C1组(第2周)(P<0.05).结论:CD44+CD24-乳腺癌干细胞RNA树突状细胞疫苗诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞能够产生特异性免疫应答,从而发挥抗肿瘤作用.     

卡介苗感染人树突状细胞对miRNA-99b表达和Th17/Treg分化的影响

目的 探讨牛型分枝杆菌减毒活菌—卡介苗(BCG)感染对人树突状细胞(DCs)microRNA-99b(miRNA-99b)表达的影响及对新生儿脐血CD_4~+初始T淋巴细胞分化为Th17/Treg的作用。方法 BCG感染体外培养的人树突状细胞,然后与新生儿脐血CD_4~+初始T淋巴细胞混合培养,qRT-PCR观察人树突状细胞miRNA-99b的表达变化,qRT-PCR检测CD_4~+T淋巴细胞Foxp3、ROR-γt、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-10(IL-10)基因转录水平,观察CD_4~+T淋巴细胞分化亚型的改变;ELISA法检测培养上清INF-γ、IL-17和IL-23表达水平。结果 BCG感染后,人树突状细胞miRNA-99b基因表达增加(P<0.001);CD_4~+T淋巴细胞IFN-γ、IL-10基因表达增加(P<0.05),ROR-γt基因表达降低(P<0.05),Foxp3基因转录增加,但差异无统计学意义;感染组培养上清中INF-γ表达水平增加(P<0.001),IL-17和IL-23表达水平均有一定的增加,但差异无统计学意义。结论 结核感染可能通过影响树突状细胞miRNA-99b的表达进而诱导初始CD_4~+T淋巴细胞分化为Th17/Treg的失衡参与结核病的发病过程。     

视黄酸对脐血树突状细胞的作用及其途径

目的:研究视黄酸(RA)对脐血树突状细胞(dendriticcell,DC)分化、成熟和功能的影响,探讨视黄酸受体(retinoicacidreceptorα,RARα)在RA对脐血DC调节中的作用。方法:收集脐血9份,分离单个核细胞后,均匀分为4组:对照组、RA组、RARα特异性拮抗剂组(RO组)、RA+RO组。在体外进行DC的诱导培养,流式细胞仪检测细胞表面标记及其荧光强度,观察RA及RARα对DC分化、成熟的影响;培养DC与T细胞进行混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction,MLR)后,观察RA及RARα对DC刺激异体T细胞增殖能力的作用;采用ELISA法和RT-PCR法研究RA和RARα在DC对Th细胞极向分化调节中的作用。结果:RA使DC的分化、成熟明显受抑,但当RO同时加入时,则可逆转该影响;MLR后发现RO可逆转RA对T细胞增殖的抑制作用;在DC对T细胞极向分化的研究中,无论在蛋白水平还是基因水平,RO均可明显阻止RA对Th1(IFN-γ)的下调和对Th2(IL-4、IL-10)的上调作用。结论:RA抑制体外培养的脐血单个核细胞向DC的分化和成熟,降低其MLR能力,使免疫反应向Th2方向偏移。RARα从多个环节上参与了RA对脐血DC的调节作用。     

宫颈癌细胞冻融抗原负载树突状细胞激发细胞毒性T淋巴细胞杀伤宫颈癌细胞的体外研究

目的研究HeLa、SiHa两种宫颈癌细胞株冻融抗原负载的树突状细胞(dendritic cells,DC)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外抗原特异性杀伤官颈癌细胞的能力.方法利用免疫磁珠分离法(MACS)分离纯化脐血CD34 细胞并在体外诱导分化为DC,用反复冻融法分别从两种宫颈癌细胞株(HeLa利SiHa)中提取可溶性冻融抗原并负载DC.流式细胞学检测负载两种抗原后DC表面分子的表达,ELISA法检测DC上清中IL-12的表达,MLR测定DC刺激T细胞增殖的能力,MTT法检测DC经抗原负载后激活的CTL分别对HeLa和SiHa细胞的杀伤作用.结果与未经抗原负载的DC相比,经HeLa和SiHa冻融抗原负载的DC能更好的表达各种DC分化相关抗原(CD1a、CD83、CD80、HLA-DR以及CD54),刺激T淋巴细胞增殖和IL-12分泌的能力也显著加强(P＜0.05).与未经抗原负载相比,两种宫颈癌细胞冻融抗原负载DC后激发的CTL在体外对官颈癌细胞的杀伤能力也明显加强.此外,HeLa细胞抗原负载DC诱导的CTL在体外对HeLa细胞的杀伤率为72.2%,显著高于它对SiHa细胞的杀伤率(22.3%);而SiHa细胞抗原负载DC诱导的CTL对SiHa细胞的杀伤率为69.5%,也明显高于它对HeLa细胞的杀伤率(28.1%),具有显著的抗原特异性.结论经宫颈癌细胞冻融抗原负载DC激活的CTL在体外具有更强的增殖能力,并具有抗原特异性杀伤宫颈癌细胞的作用.     

血吸虫Sj23基因转染对树突状细胞功能影响

目的 探讨日本血吸虫23kDa膜蛋白(Sj23)基因转染对树突状细胞(DC)功能的影响.方法 利用脂质体介导的基因转染技术将Si23基因转染DC,流式细胞术(FCM)检测Sj23基因转染的IX;摄取抗原的能力,混合淋巴细胞反应(MLR)检测Sj23基因转染的DC对同种异体T淋巴细胞的刺激作用.结果 Sj23基因转染后Sj23蛋白在DC中高表达,与pcDNA3转染的DC和未转染的DC相比,Sj23基因转染的DC摄取抗原的能力降低,能明显刺激混合淋巴细胞反应.结论 Sj23基因转染DC后能促进DC的活化,增强DC的生物学活性.     

下调VEGFR-1基因表达对抑制乳腺癌细胞增殖的影响

目的利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)下调VEGFR-1基因的表达研究对乳腺癌增殖的影响。方法设计针对人VEGFR-1基因的小干扰RNA,直接化学合成,脂质体Lipofectamine~(TM)2000作为转染试剂,转染人乳腺癌细胞系MCF-7,然后四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖变化,半定量RT-PCR和蛋白印迹试验检测VEGFR-1 mRNA和蛋白的表达,Hoechst33258荧光染色分析细胞凋亡。结果实验结果显示:下调VEGFR-1基因表达,乳腺癌细胞MCF-7增殖被抑制,VEGFR-1 mRNA和其蛋白的表达明显降低,Hoechst33258荧光染色显示转染siRNA72h后MCF-7细胞凋亡明显增加。结论化学合成的siRNA能成功下调VEGFR-1基因的表达,并抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖、增加凋亡;下调VEGFR-1基因的表达有可能是潜在的肿瘤治疗方法。     

下调VEGFR-1基因表达对抑制乳腺癌细胞增殖的影响

目的利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)下调VEGFR-1基因的表达研究对乳腺癌增殖的影响。方法设计针对人VEGFR-1基因的小干扰RNA,直接化学合成,脂质体Lipofectamine~(TM)2000作为转染试剂,转染人乳腺癌细胞系MCF-7,然后四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖变化,半定量RT-PCR和蛋白印迹试验检测VEGFR-1 mRNA和蛋白的表达,Hoechst33258荧光染色分析细胞凋亡。结果实验结果显示:下调VEGFR-1基因表达,乳腺癌细胞MCF-7增殖被抑制,VEGFR-1 mRNA和其蛋白的表达明显降低,Hoechst33258荧光染色显示转染siRNA72h后MCF-7细胞凋亡明显增加。结论化学合成的siRNA能成功下调VEGFR-1基因的表达,并抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖、增加凋亡;下调VEGFR-1基因的表达有可能是潜在的肿瘤治疗方法。     

LPSp对HBV宫内感染脐血单个核细胞分泌IL-4、IFN-γ及TLR4表达的影响

目的:观察不同浓度LPSp对HBV宫内感染孕妇的脐血单个核细胞分泌IL-4、IFN-γ及细胞表面TLR4表达的影响。方法:选择外周血HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性且脐血HBV-DNA阳性孕妇25例为试验组,根据加入LPSp的不同分为:无LPSp组、LPSp 1μg/L组、LPSp 10μg/L组、LPSp 100μg/L组;以外周血HBV标志物为阴性的正常分娩孕妇20例为对照组。分离CBMC并培养,采用ELISA法检测培养上清液中的IFN-γ、IL-4的浓度,用流式细胞仪检测CBMC表面TLR4表达。结果:①LPSp各组中IFN-γ、IL-4水平与无LPSp组比较差异均有统计学意义(P<0.01),IFN-γ水平与LPSp浓度呈正相关(r=0.778),IL-4水平与LPSp浓度呈负相关(r=-0.927)。②TLR4表达与IFN-γ水平呈正相关(P<0.05),TLR4与IL-4呈负相关(P<0.05);TLR4表达水平与LPSp浓度呈正相关(r=0.754)。结论:不同浓度的LPSp可能通过影响TLR4信号传导通路诱导CBMC分泌不同细胞因子,选择性调控Th1/Th2型应答。     

Rb基因在染料木黄酮抑制人乳腺癌细胞生长中的作用

目的:研究Rb基因在染料木黄酮(genistein,Gen)抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖中的作用。方法:采用MTT实验和集落形成实验观察Gen对人乳腺癌细胞增殖影响,Westernblotting检测Rb基因、细胞周期素cyclinE蛋白表达情况,RT-PCR检测Rb基因mRNA的表达。结果:Gen显著抑制MCF-7细胞生长,促进细胞Rb基因在蛋白及mRNA水平的表达,抑制cyclinE蛋白的表达。结论:Gen抑制人乳腺癌细胞增殖,其机制可能通过上调Rb基因表达,下调cyclinE蛋白表达。     

Twist及其相关调控基因在不同转移性人乳腺癌细胞中的差异表达

目的:观察不同转移潜能人乳腺癌细胞株中Twist及其相关调控基因mRNA表达的差异。方法:培养低侵袭性人乳腺癌细胞株MCF-7和高转移性人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S,采用RT-PCR法检测两种细胞株中Twist、脆性组氨酸三联体(FHIT)、皮性钙黏附素(E-cadherin)、细胞凋亡相关基因Mcl-1、Bcl-2和Bax mRNA表达的差异。结果:MCF-7中FHIT、E-cadherin、Bax mRNA的表达显著高于MDA-MB-435S细胞,Twist mRNA在MDA-MB-435S细胞中的表达明显高于MCF-7,Mcl-1、Bcl-2 mRNA在两种细胞株中的表达无明显差异。结论:Twist、FHIT、E-cadherin、Bax mRNA表达差异可能与人乳腺癌细胞的不同转移潜能有关。     

人乳腺癌多耐药细胞株中ALDH1,P-gp及CD44v6的表达研究

目的:比较人乳腺癌亲代敏感株MCF-7和多耐药细胞株MCF-7/A中ALDH1,P-gp及CD44v6的表达差异,探讨多耐药与侵袭转移作用机制。方法:以阿霉素低浓度加量持续诱导法,建立人乳腺癌多耐药细胞模型株MCF-7/A,用ALDEFLUOR分析法检测乳腺癌干细胞功能性标志物ALDH1阳性细胞在亲代敏感株MCF-7与多耐药细胞株MCF-7/A中所占比例,Transwell侵袭实验论证乳腺癌胞耐药是否伴随相应侵袭转移能力的改变,免疫细胞化学染色及荧光定量PCR分析亲代敏感株MCF-7与多耐药细胞株MCF-7/A中MDR1(P-gp)和CD44V6的表达变化。结果:耐药细胞株MCF-7/A较亲代敏感株ALDH1阳性细胞比例数明显增高;耐药细胞株MCF-7/A穿膜细胞数明显多于敏感细胞株MCF-7;耐药细胞株MCF-7/A中P-gp和CD44v6表达均明显高于亲代敏感细胞株。结论:乳腺癌的多耐药不仅包含获得性耐药细胞比例增加,同时伴有肿瘤干细胞的富集造成的内在性耐药增加,耐药的乳腺癌细胞伴有侵袭能力增强。     

晚孕期孕妇口服益生菌制剂对新生儿肠道菌群及脐血IL-4、IFN-γ水平影响的临床研究

目的:通过给妊娠晚期孕妇服用含有益生菌的孕妇奶粉,检测其新生儿肠道菌群变化及新生儿脐血中IL-4、IFN-γ的变化,探讨益生菌对新生儿免疫的影响。方法:随机将妊娠34周择期剖宫产的孕妇分为实验组(服用含益生菌的孕妇奶粉21例)及对照组(服用不含益生菌的孕妇奶粉21例),取新生儿粪便分别进行有氧及厌氧环境培养,并进行细菌涂片,观察新生儿肠道菌群变化情况。剖宫产收集新生儿脐带血液标本,留取血清,采用ELISA方法测定两组中IL-4及IFN-γ水平。结果:①实验组与对照组新生儿肠道菌群变化两组间无统计学差异(P>0.05);②实验组与对照组新生儿脐带血清IL-4水平两组之间有统计学差异(P<0.05),IFN-γ水平两组之间无明显统计学差异(P>0.05),而IL-4/IFN-γ比值两组之间有统计学差异(P<0.05)。结论:晚孕期孕妇口服益生菌制剂对新生儿肠道菌群变化无明显影响,但通过新生儿脐带血IL-4及IFN-γ的检测发现晚孕期孕妇口服益生菌制剂可能会增强新生儿免疫力,从而预防或减少新生儿过敏性疾病的发生。     

Human diploid MRC-5 cells exhibit several critical properties of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells

MRC-5 is the most common human diploid cell line used in production of viral vaccines; mesenchymal stem cells (MSCs) is a type of adult multipotent stem cells. Both cell types share the same fibroblast-like morphology and maintain a normal diploid karyotype over long in vitro expansion. However, other than these similarities, very little is known about MRC-5 in terms of biological properties possessed by MSCs. In this study, we compared MRC-5 with human umbilical cord-derived MSCs (hUC-MSCs), which serves as a representative of human MSCs, in expression of cell surface markers, abilities to differentiate into multiple cell lineages, inhibition of lymphocyte proliferation and promotion of Regulatory T lymphocytes (Treg), and IDO1 expression in response to inflammatory cytokines, all of which are critical properties of MSCs. It was revealed that MRC-5 was almost identical to hUC-MSCs in expression of both positive and negative surface markers of MSCs. Similar to hUC-MSCs, MRC-5 was also able to differentiate into osteocytes and chondrocytes, effectively inhibit mitogen-activated lymphocyte proliferation and promote Tregs, and express IDO1 in response to inflammatory cytokines IFN-γ and TNF-α. In addition, both MRC-5 and hUC-MSCs were non-tumorigenic with an extremely low telomerase activity. Moreover, both cells demonstrated a similar sensitivity to infection by EV71 and rubella viruses, which served as model viruses, in a virus infectivity assay. Therefore, this study suggests that MRC-5 is very likely a previously undefined MSC cell line, thus suggesting the feasibility of developing MSCs of at least umbilical cord origin as new cell substrates to be used in production of viral vaccines.     

IEX-1基因转染对人卵巢癌细胞增殖活性及顺铂敏感性的影响

目的:探讨即刻早期反应基因-1(immediate early response gene X-1,IEX-1)转染人卵巢癌细胞SKOV3后,对顺铂药物敏感性的影响。方法:提取并鉴定重组质粒pEGFP-N1-IEX-1,采用脂质体介导将重组质粒转染到人卵巢癌细胞SKOV3,RT-PCR检测转染前后IEX-1mRNA和蛋白的表达情况,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染后卵巢癌细胞SKOV3增殖情况以及对顺铂敏感性的变化。结果:成功转染IEX-1基因后可检测到IEX-1mRNA的高表达;转染组细胞的增殖速度增快(P<0.05),但对顺铂的敏感性明显增强(P<0.05)。结论:IEX-1可增强卵巢癌细胞的体外增殖能力,并增强卵巢癌细胞体外对顺铂化疗的敏感性,为肿瘤的有效干预和治疗提供新的靶点。