抑制ClC-3表达促进顺铂诱导人卵巢癌SKOV3/DDP细胞凋亡的作用机制

目的:探讨抑制ClC-3基因表达对顺铂(DDP)复制的人卵巢癌SKOV3/DDP细胞损伤促进作用过程中的具体作用机制,为应用DDP治疗卵巢癌提供实验依据。方法:转染pSH1-siRNA-ClC-3重组质粒到人卵巢癌SKOV3/DDP细胞,Western blotting方法观察热休克蛋白(HSP70)、溶酶体组织蛋白酶D(cathepsin D)蛋白表达。结果:与SKOV3细胞比较,SK-OV3/DDP细胞中HSP70蛋白表达增加(P<0.05)。转染pSH1-siRNA-ClC-3重组质粒联合DDP作用后,SKOV3/DDP细胞中HSP70蛋白表达降低(P<0.05),cathepsin D蛋白表达增加(P<0.05)。结论:抑制ClC-3基因表达促进顺铂诱导SKOV3/DDP细胞凋亡的可能作用机制与溶酶体膜通透性(LMP)增加有关。     

靶向hTERT的siRNA对卵巢癌SKOV3细胞增殖及化疗敏感性的影响

目的:探讨RNA干扰沉默人端粒酶反转录酶(hTERT)的表达后对卵巢癌SKOV3细胞增殖及化疗药物敏感性的影响。方法:化学合成hTERT siRNA及Control siRNA,用EntransterTM-R转染试剂将hTERT siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞。采用Real time-PCR法及Western blot法检测SKOV3细胞中hTERT mRNA及对应蛋白的表达;流式细胞术(FCS)检测细胞凋亡率;并分别用顺铂、阿霉素作用于SKOV3细胞,WST-1法检测细胞存活率及两种化疗药物的IC50。结果:与对照组相比,转染hTERT siRNA后,hTERT mRNA及蛋白表达量明显降低(P<0.05),细胞凋亡率明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05),同时该组细胞的顺铂、阿霉素IC50显著下降。结论:hTERT siRNA不仅可以显著抑制卵巢癌SKOV3细胞中hTERT基因的表达,同时提高细胞对化疗药物的敏感性。     

自噬基因Beclin1过表达诱导人卵巢癌细胞SKOV3自噬和凋亡的研究

目的:探讨自噬基因Beclin 1在人卵巢癌SKOV3细胞中过表达对其体外生长活性的影响。方法:构建自噬基因Beclin 1的真核表达载体pcDNA3.1/Beclin1,将其稳定转染SKOV3细胞,实现Beclin 1在SKOV3中的过表达;用MTT法分析Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,用流式细胞仪检测凋亡和自噬情况,电镜和荧光显微镜下观察自噬现象。结果:pcD-NA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后Beclin 1在mRNA和蛋白水平均高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组。Beclin 1在SKOV3中的稳定过表达后G1期细胞明显增多,S期细胞比例明显减少,细胞增殖受到抑制,凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后MDC标记的自噬囊泡平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组。pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后在电镜下可见大量自噬囊泡形成。在荧光显微镜下见pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞中MDC标记的自噬囊泡明显增加。结论:自噬基因Beclin1过表达可诱导人卵巢癌细胞SKOV3自噬和凋亡,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性。     

MDR1及MDR3基因与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系

目的:探讨MDR1(Multidrug resistance gene-1)及MDR3(Multidrug resistance gene-3)基因与卵巢癌细胞顺铂耐药的关系。方法:两种质粒一起瞬时转染A2780/DDP细胞,空载体组及未转染组作为对照。Annexin V-FITC/PI双标流式细胞术、MTT法、RT-PCR、western blot分别检测A2780/DDP细胞早晚期凋亡、细胞增殖活性、MDR1和MDR3 mRNA表达及caspase-3蛋白水平。结果:两种质粒(pSuppressorNeo MDR1 siRNA,MDR3 siRNA)均未能逆转A2780/DDP细胞顺铂耐药:①流式显示转染MDR1 siRNA组、MDR3 siRNA组和pSuppressorNeo空载体组后相比较未转染A2780/DDP细胞凋亡率无显著改变(P>0.05);②在一定药物浓度范围内,转染MDR1和MDR3小分子干扰RNA均未能增强顺铂对A2780/DDP细胞的细胞毒作用;③与空载体组和未转染细胞相比,A2780/DDP细胞的MDR3及MDR1 mRNA表达均低下(P>0.05);④Caspase-3蛋白表达未见增加。结论:顺铂所致的卵巢癌细胞多药耐药与MDR1及MDR3基因过度表达均无关,卵巢癌细胞顺铂耐药为非P-gp     

RI基因稳定转染的SKOV3细胞系的建立及其对细胞增殖的作用

目的:建立稳定表达RI基因的卵巢癌SKOV3细胞系,并观察外源基因对细胞体外增殖的作用。方法:以脂质体为介导,将携有RI基因的重组载体pLNCX-ri转染SKOV3细胞,实验分3组,RI基因转染组(SKOV3/RI组)、空质粒转染组(SKOV3/Neo组)和空白对照组(SKOV3组)。采用G-418筛选获得稳定转染的细胞系后,通过RT-PCR技术和免疫细胞化学染色方法鉴定各组细胞中RI基因的表达;通过MTT、细胞周期分析、细胞凋亡检测方法观察该基因对细胞生长的影响。结果:外源性RI基因已整合于细胞基因组中,并获得稳定表达。转染RI基因后的细胞生长速度减慢,明显低于对照组,差异有统计学意义。细胞周期分析显示,实验组G1期细胞增至69.23%,S期细胞降至24.34%,与另外两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。细胞凋亡检测表明SKOV3/RI组细胞凋亡率为58.25%,与SKOV3组(17.97%)及SKOV3/Neo组(21.42%)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:通过脂质体介导,可以建立RI基因稳定表达的卵巢癌细胞系,且RI基因对SKOV3细胞的体外增殖有抑制作用。     

抑制自噬基因Beclin 1的表达对耐药卵巢癌细胞A2780/DDP顺铂敏感性的影响及相关机制研究

[目的]观察抑制自噬基因Beclin1的表达对卵巢癌耐药细胞A2780/DDP顺铂敏感性的影响并探讨其中机制。[方法]利用脂质体将自噬基因Beclin1RNA干扰质粒pSUPER-Beclin1和对照质粒pSUPER-non分别转染耐药卵巢癌细胞A2780/DDP,筛选稳定表达株,检测顺铂作用下各组细胞(pSUPER-Beclin1组、pSUPER-non组和未转染组)生长抑制率、半数抑制浓度(IC50)、自噬和凋亡率的变化。[结果]A2780/DDP细胞转染干扰质粒pSUPER-Be-clin1后,细胞内Beclin1蛋白的表达明显下降;比较3组细胞顺铂48hIC50,pSUPER-Beclin1转染组最低(P﹤0.01);对3组细胞自噬与凋亡水平的检测显示,抑制Beclin1蛋白表达,在顺铂作用下,细胞自噬水平明显下降,而凋亡细胞比例明显升高,凋亡蛋白Caspase-3的表达亦明显上调,实验组与对照组相比差异有统计学意义(P﹤0.01)。[结论]抑制耐药细胞A2780/DDP自噬基因Beclin1的表达,可通过抑制自噬,增强凋亡提高耐药细胞对顺铂的敏感性。     

过表达PTEN对SKOV3和SKOV3-ADM细胞增殖的影响

目的:研究过表达PTEN对卵巢癌细胞SKOV3和卵巢癌耐药细胞株SKOV3-ADM增殖能力的影响。方法:构建PTEN真核表达载体,采用脂质体转染技术转染入SKOV3及SKOV3-ADM细胞,采用RT-PCR和Western-blot检测PTEN基因及蛋白表达水平的变化,判断转染效果;MTT法检测细胞增殖速率变化。结果:转染PTEN表达载体至SKOV3及SKOV3-ADM细胞后,RT-PCR及Western-Blot实验证实SKOV3和SKOV3-ADM细胞中PTEN基因及蛋白表达水平明显上调。MTT结果显示,上调PTEN表达后的SKOV3和SKOV3-ADM细胞相对于空白和阴性对照组,细胞的体外增殖能力明显减弱(P<0.01)。结论:PTEN蛋白在卵巢癌的发生发展过程中起着抑制作用,可能成为一种新的肿瘤分子治疗手段。     

NDRG2基因过表达影响卵巢癌细胞生物学功能的研究

目的构建N-myc下游调节基因2 (NDRG2)过表达质粒,研究NDRG2基因影响卵巢癌细胞增殖、凋亡及侵袭等生物学行为的作用。方法 NDRG2过表达质粒载体感染卵巢癌细胞,从而实现NDRG2基因的在卵巢癌细胞中的过表达。之后通过CCK8试验观察卵巢癌细胞的生存能力及平板克隆形成试验观察卵巢癌细胞的增殖能力。流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果质粒转染后,Q-PCR检测NDRG2基因特异过表达。Q-PCR试验观察NDRG2过表达质粒瞬时转染后NDRG2基因表达情况,与空载体组相比,NDRG2过表达转染组卵巢癌细胞NDRG2基因表达水平明显升高(OVCAR-3、SKOV3、CAOV3卵巢癌细胞t值分别为48.000、28.667、29.784,均P0.05)。CCK8检测、平板克隆试验结果显示过表达NDRG2基因显著抑制OVCAR-3、SKOV3及CAOV3细胞生长(t=22.928、13.797、10.332;χ~2=5.530、4.060、4.230,P0.05),并促使上述3种卵巢癌细胞周期停滞于G1期。结论通过真核表达载体使细胞NDRG2基因的过表达,可以明显抑制OVCAR-3、SKOV3及CAOV3细胞的生长和增殖。     

慢病毒介导HMGN5基因沉默对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其机制研究

目的观察慢病毒介导的高迁移率族核小体结合域5(HMGN5)基因沉默对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并对其机制进行初步探讨。方法 RT-qPCR法检测人卵巢上皮细胞株IOSE及4株不同卵巢癌细胞中HMGN5的表达情况,将HMGN5 shRNA慢病毒载体转染至人卵巢癌细胞SKOV3中,RT-qPCR和Western blot检测SKOV3细胞中HMGN5 mRNA和蛋白表达情况,MTT法检测沉默HMGN5基因对细胞增殖能力的影响,划痕实验检测沉默HMGN5基因对细胞迁移能力的影响,Transwell实验检测沉默HMGN5基因对细胞侵袭能力;Western blot检测SKOV3细胞中PCNA、MMP-9、Wnt1和β-连环蛋白(β-catenin)蛋白表达水平。结果与卵巢上皮细胞株IOSE相比,HMGN5在卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、HO-8910、Caov3中的表达明显升高(P<0.05)。与Blank组和NC组相比,sh-HMGN5组SKOV3细胞中HMGN5 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),SKOV3细胞增殖、迁移和侵袭能力均明显下降(P<0.05),细胞中PCNA、MMP-9、Wnt1和β-catenin蛋白表达水平明显下调(P<0.05)。结论沉默HMGN5可能通过阻碍Wnt/β-catenin信号通路的激活抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移和侵袭能力。     

RNA干扰对卵巢癌细胞mTOR表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨RNA干扰技术对人卵巢癌细胞SKOV3中mTOR的表达及对细胞增殖与凋亡的影响。方法:培养SKOV3细胞系,设计合成mTOR siRNA实验分4组:正常培养组:未转染的正常培养SKOV3细胞;空白对照组:转染空脂质体的SKOV3细胞;转染组:转染mTOR siRNA的SKOV3细胞;无义对照组:转染无义siRNA的SKOV3细胞。采用Western blot法检测各组细胞中的mTOR蛋白表达水平;应用MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:mTOR siRNA转染组SK-OV3细胞mTOR蛋白的表达显著低于各对照组(P<0.05);mTOR siRNA转染组SKOV3细胞增殖低于各对照组(P<0.05);mTOR siRNA转染组细胞凋亡率高于各对照组(P<0.05)。结论:mTOR siRNA对SKOV3细胞中mTOR蛋白的表达有明显的抑制作用,特异性阻断mTOR基因表达可显著抑制SKOV3细胞的增殖并促进其凋亡。     

内皮抑素质粒联合顺铂对上皮性卵巢癌细胞株A2780增殖和凋亡的影响

目的:探讨内皮抑素质粒联合顺铂对上皮性卵巢癌细胞株A2780增殖和凋亡的影响。方法:通过瞬时转染内皮抑素质粒到卵巢癌细胞A2780后,采用MTT法和流式细胞术检测内皮抑素以及内皮抑素和顺铂联合应用对细胞增殖和凋亡的影响。结果:MTT法检测发现转染内皮抑素质粒后,A2780细胞的增殖明显减慢,顺铂对其生长抑制作用明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测发现与空白组相比,转染内皮抑素质粒后A2780细胞的G0/G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少,细胞的凋亡率由(1.59±0.86)%增加到(8.66±1.27)%;内皮抑素质粒联合顺铂治疗后,上述差异更加显著(P<0.01)。结论:内皮抑素联合顺铂可通过抑制A2780细胞的生长和增加其凋亡而产生协同抗瘤作用。     

二甲双胍通过抑制MAPK信号通路增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性

目的：探讨二甲双胍是否可以提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性及相关的作用机制。方法：BRDU ELISA方法检测顺铂联合或者不联合二甲双胍对SKOV3细胞增殖的影响;二甲双胍联合或者不联合MAPK信号通路阻断剂后BRDU ELISA方法检测细胞增殖的变化。Western blotting检测二甲双胍作用下卵巢癌细胞系SKOV3的磷酸化AMPK/总AMPK水平和磷酸化p38 MAPK/总MAPK水平的变化。结果：（1）二甲双胍不仅能抑制卵巢癌细胞系SKOV3细胞的增殖,而且能提高对顺铂的敏感性,并且这种作用是依赖于AMPK激活的;（2）p38 MAPK阻断剂SB203580能够抑制SKOV3的增殖,二甲双胍能够增强这种抑制作用。结论：二甲双胍可增强顺铂对卵巢癌细胞的抑制作用,并且二甲双胍可能通过激活AMPK信号通路进而抑制MAPK信号通路增加顺铂对卵巢癌细胞的抑制增殖作用。     

促凋亡因子Smac过表达增强胰腺癌Panc-1细胞化疗敏感性研究

目的探讨胞浆过表达促凋亡因子Sm ac对胰腺癌细胞Panc-1化疗敏感性的影响。方法应用RT-PCR获得Sm accDNA(不含线粒体定位序列),定向克隆入pEGFP-N1质粒载体中,经限制性酶切、PCR及测序鉴定。利用脂质体将pEGFP-N1/Sm ac重组体转染胰腺癌细胞株Panc-1,应用荧光显微镜检测Sm ac-EGFP绿色荧光融合蛋白表达;流式细胞仪测定顺铂、5-FU诱导的转染细胞凋亡率;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞生长抑制率。结果荧光显微镜下可见转染pEGFP-N1/Sm ac的细胞胞浆自发绿色荧光;在顺铂、5-FU作用下,N1/Sm ac转染组细胞凋亡率分别为(36.8±5.5)%、(47.6±6.9)%,明显高于未转染组(12.3±3.2)%、(19.2±4.7)%及空载体转染组(16.9±3.7)%、(22.5±5.8)%,其差异有统计学意义(P<0.01)。N1/Sm ac转染组细胞的生长抑制率亦明显高于未转染组及空载体转染组(P<0.01)。结论胞浆过表达Sm ac活性分子可明显促进顺铂、5-FU诱导的Panc-1细胞凋亡,增强其对化疗药物的敏感性,为探索基于凋亡的胰腺癌治疗新策略提供实验依据。     

LINC 01118通过调控vimentin蛋白影响卵巢癌细胞紫杉醇耐药

目的探讨LINC 01118对人卵巢癌细胞紫杉醇耐药的影响,并研究其调控机制。方法利用RT-qPCR测定两组卵巢癌紫杉醇耐药细胞系及亲本细胞系中LINC 01118的表达水平;利用Lipofectamine TM2000将siRNA-LINC 01118、siRNA-LINC 01118+GV 230-vim以及相关对照转染至卵巢癌紫杉醇耐药细胞SKOV 3-TR 30中,RT-qPCR验证siRNA对LINC 01118的靶向沉默效率;利用MTT法测定转染后SKOV 3-TR 30细胞对紫杉醇的敏感性;利用流式细胞仪测定转染后SKOV 3-TR 30细胞的凋亡率;利用免疫印迹实验(Western blot)测定转染后vimentin蛋白,耐药蛋白MRP 1、MDR 1及ABCG 2的表达水平。结果RT-q PCR实验结果显示,LINC 01118在卵巢癌紫杉醇耐药细胞中的表达水平显著高于其亲本细胞(P<0.05);转染siRNA-LINC 01118可明显抑制SKOV 3-TR 30细胞中LINC 01118的表达(P<0.05);MTT实验结果显示,抑制LINC 01118的表达显著增加了SKOV 3-TR 30细胞对紫杉醇的敏感性(P<0.05),过表达vimentin能逆转抑制LINC 01118表达时卵巢癌耐药细胞对紫杉醇的敏感性增加现象(P<0.05);流式细胞术结果显示,抑制LINC 01118表达显著增加了SKOV 3-TR 30细胞的凋亡率(P<0.05);Western-blot实验结果显示,抑制LINC 01118表达后,vimentin蛋白的表达水平明显降低(P<0.05),耐药蛋白MRP 1、MDR 1及ABCG 2的表达均显著减少(P<0.05)。结论LINC 01118在卵巢癌紫杉醇耐药细胞中异常高表达;抑制LINC 01118表达可以逆转卵巢癌细胞紫杉醇耐药,诱导细胞凋亡;LINC 01118可以通过正向调控vimentin蛋白影响卵巢癌细胞紫杉醇耐药。     

丹参酮ⅡA对人卵巢癌细胞SKOV3增殖与凋亡的影响

目的:探讨丹参酮ⅡA(TanⅡA)对人卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制和诱导凋亡作用及其可能机制。方法:培养人卵巢癌细胞SKOV3,经TanⅡA作用后,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定丹参酮ⅡA对人卵巢癌细胞SKOV3的增殖抑制作用;流式细胞术检测细胞周期;RT-PCR检测Survivin与Smac/DIABLO mRNA表达水平;免疫荧光细胞化学检测Survivin蛋白及Smac/DIABLO蛋白的表达。结果:1.0～10.0μg/ml TanⅡA对人卵巢癌细胞SKOV3具有生长抑制作用,并具有时间-剂量依赖性。实验组较对照组G1/G2期细胞数量增多,而S期细胞数量减少(P<0.05)。随着TanⅡA干预浓度的增加和作用时间的延长,Survivin mRNA的表达受到明显抑制(P<0.05),而Smac/DIABLO mRNA的表达明显上调(P<0.05)。Survivin蛋白及Smac/DIABLO蛋白均表达于SKOV3细胞,其表达多定位于细胞质中,偶见于细胞核。结论:TanⅡA对人卵巢癌细胞SKOV3具有生长抑制和诱导凋亡作用,其作用机制可能是通过抑制人卵巢癌细胞SKOV3 Survivin和促进Smac/DIABLO的表达而实现的。     

THY1基因影响上皮性卵巢癌SKOV3细胞株生长的体内和体外实验研究

目的构建THY1基因真核表达载体，并转染卵巢癌细胞株SKOV3，观察重组载体在体内和体外对SKOV3生长的影响。方法本研究于2005年3月至2007年3月通过目的基因克隆、载体构建技术构建重组载体pcDNA3．1（＋）-THY1，转染SKOV3（SKOV3-THY1组），同时设空载体转染组（SKOV3-Null组）和空白对照组（SKOV3组），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）测定法及流式细胞术检测细胞生长及细胞周期变化；并建立雌性裸鼠异体移植卵巢癌模型，观察瘤体生长速率。结果PCR、酶切及DNA测序证实，THY1基因正确插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），RT—PCR和蛋白质斑迹法（Westernblot）证实重组载体已整合于SKOV3；SKOV3-THY1组细胞抑制率明显高于SKOV3-Null组（P〈0．05）；建立裸鼠致瘤模型4周后，SKOV3-THY1组瘤体体积较SKOV3-Null组和SKOV3组显著降低（P〈0．05）。结论THY1真核表达载体能抑制SKOV3的恶性增殖，THY1基因可能在上皮性卵巢癌发生发展中起重要作用。     

EGFR基因靶向RNA干扰抑制卵巢癌细胞增殖的研究

目的:利用RNA干扰技术抑制卵巢癌细胞株skov3细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达及细胞的体外增殖活性。方法:根据EGFR mRNA序列设计特异性siRNA插入序列,体外合成该序列后将其定向克隆入线性化质粒pSilencerTM2.1-U6neo,以HifectinII真核转染试剂将重组质粒转染至skov3细胞中,用RT-PCR和免疫细胞化学方法分别鉴定转染前后EGFR基因在mRNA和蛋白水平表达的变化;四甲基偶氮唑蓝法(MTT)测定转染前后细胞增殖活性的改变。结果:DNA测序证实EGFR siRNA表达载体的siRNA插入序列完全正确,该表达载体可特异性抑制EGFR基因的表达;转染后细胞的增殖受到抑制,其中第5天的抑制率达到30%(P<0.05)。结论:靶向EGFR的序列特异性siRNA真核表达载体可有效抑制skov3细胞中EGFR基因的表达和细胞的增殖。