邯郸地区苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变的研究

目的探讨邯郸地区苯丙酮尿症(PKU)患儿苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因的突变情况及突变特征,为该地区苯丙酮尿症的产前诊断、治疗及干预措施的制定提供科学依据。方法选择15例PKU患儿及其父母为研究对象,利用Sanger测序技术,检测15例PKU患儿及其父母的PAH基因的突变,分析邯郸地区PKU患儿PAH基因突变特点。结果通过对15例PKU患儿全部外显子进行基因序列分析,15例患儿明确了30个突变基因,检出率高达100.0%。30个基因突变分为12种类型,其中包含有错义突变8种、剪接突变2种、无义突变1种、缺失突变1种。其中R243Q突变频率最高(23.3%),其次是V399V突变(13.3%)。结论邯郸地区PKU患者PAH基因突变具有明显的突变热点区域(外显子3、4、5、7、10、11、12)和热点突变(R243Q、V399V、IVS4),为深入研究邯郸地区苯丙酮尿症家系奠定了基础。     

泰安地区苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变的分析

目的探讨泰安地区苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因突变特点,为该地区苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)的产前诊断、预防、治疗及人群干预措施的制定提供科学依据。方法采用下一代测序技术(NGS)对34例泰安地区PKU患儿及其父母的PAH基因的13个外显子及与外显子连接的上下游200 bp内含子进行测序分析。结果 34例患儿的68个PAH等位基因中共检出63个突变等位基因,突变检出率为92.65%(63/68),共检出28种突变类型。34例患儿均检测到突变位点,且均为杂合突变,其中1例患儿检测出3个突变位点,25例患儿检测到2个突变,8例患儿检测到1个突变。第7外显子为高频突变区,共检测到8种22个基因突变,相对突变频率为34.92%(22/63);第12外显子检测到4种10个基因突变,占总突变的15.87%(10/62)。共发现4种PAH基因新突变,p.H271L、p.D415N和p.M276K被确定为国内首次报道,p.E56D为国际上目前尚未报道过的PAH基因新突变。结论泰安地区PAH基因突变谱广,突变均为杂合突变,第7、12外显子为高频突变区。     

江苏省苏州市苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变特点

目的探讨江苏省苏州市苯丙酮尿症(PKU)患儿苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变特点。 方法选择2008－2011年,于上海新华医院通过串联质朴技术、苯丙氨酸负荷试验及尿蝶呤检测确诊分型的江苏省苏州市内25例PKU患儿及其父母为研究对象,通过SNaPShot基因分型技术和二代测序(NGS)技术,检测25例PKU患儿及其父母的PAH基因的突变。采用Sanger测序验证上述2种测序的结果,并分析苏州市PKU患儿PAH基因突变特点。本研究遵循的程序符合南京医科大学附属苏州医院人体试验委员会所制定的伦理学标准,得到该委员会批准,并与患儿监护人签署临床研究知情同意书。 结果SNaPShot基因分型技术、NGS技术检测本组受试者PAH基因突变结果与Sanger测序结果一致。25例PKU患儿中,运用SNaPShot基因分型技术,共检测出PAH基因的9种突变类型,分别为Exon7-R243Q、Exon6-Y204X、Exon7-R241C、Exon5-IVS4-1、Exon12-R413P、Exon3-R111X、Exon7-R261Q、Exon10-W326X及Exon11-Y356X,PAH基因突变检出率为58.0%(29/50)。其中10例患儿可通过SNaPShot基因分型技术检测到PAH基因纯合突变或复合杂合突变,家系分析可提供100%的基因诊断信息。对另15例不能提供100%基因诊断信息的PKU患儿运用NGS技术进行检测,在其中12例患儿中检测到PAH基因复合杂合突变,家系分析可提供100%的基因诊断信息;其余3例患儿仅检测到PAH基因单位点杂合突变。运用NGS技术发现了PAH基因的另外15种突变,包括突变频率为4%的A434D、V399V和Y325X 。上述2种方法对PAH基因总突变的检出率为94%(47/50)。 结论江苏省苏州市PKU患儿的PAH基因热点突变包括R243Q、Y204X、R241C、IVS4-1、R413P、R111X、A434D、V399V和Y325X。运用SNaPShot基因分型技术检测PAH基因突变,具有一定临床应用价值。     

青海地区回族苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因突变分析

目的明确青海地区回族苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因的突变特征,为该地区苯丙酮尿症(PKU)的产前诊断和遗传咨询提供理论依据。方法应用PCR产物直接测序法对13例回族PKU患儿及其父母的PAH基因启动子、第1~13外显子及其旁侧内含子区域进行基因突变分析。结果在26个PAH等位基因中检测出15种不同的突变基因,总检测率为80.8%(21/26),包括10种错义突变(66.7%)、3种无义突变(20.0%)和2种剪切位点突变(13.3%),大部分突变集中在第3、6、7、11外显子及第4内含子区域,常见的4种突变是R243Q(15.4%)、IVS4-1 GA(7.7%)、I65T(7.7%)、P281L(7.7%)。R243Q是青海地区回族PAH基因最常见的突变种类,P281L突变在宁夏及新疆回族中均未检出,可能是青海回族特有的热点突变。R53H、I65S、R158Q、V230I、R252Q和P281L这6种突变在中国回族人群中为首次报道。结论青海与宁夏、新疆回族在PAH基因的突变构成上差异显著,R243Q、IVS4-1 GA、I65T、P281L可能属于青海回族PAH基因突变的热点。     

新疆维吾尔族新生儿苯丙酮尿症PAH基因第3外显子突变研究

目的探讨新疆维吾尔族苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)患儿苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因第3外显子的突变情况及突变特征,为临床诊疗提供理论参考。方法应用PCR产物直接测序的方法对新疆南疆地区确诊的37例维吾尔族PKU患儿和40例健康维吾尔族新生儿PAH基因第3外显子及内含子衔接区进行序列分析,以确定其突变位点。结果在37例维吾尔族患儿的74条染色体中共检测到了2种突变,12个PAH基因突变位点,分别为位于第3外显子p.A104D(c.311CA)和第3内含子区域IVS3-22CT(c.353-22CT);其中IVS3-22CT为此次检测相对高检出的突变位点占总例数的18.9%。两种突变的性质分别为错义突变和静默突变。结论明确了新疆维吾尔族PKU患儿PAH基因第3外显子及内含子衔接区的突变种类和特征,为深入研究和临床诊断维吾尔族PKU奠定基础。     

新疆南疆地区维吾尔族苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因第6外显子突变研究

目的了解新疆南疆地区维吾尔族苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)患儿苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因第6外显子的突变特征。方法应用PCR产物直接测序的方法对新疆南疆地区27例维吾尔族PKU患儿PAH基因进行序列分析,以确定其突变位点。结果在54条染色体中共检测到了3种,22个PAH基因突变位点,分别为:p.R176X(c526CT)无义突变;p.EX6-96AG(c.611AG)剪接突变;p.Q232Q(c.696AG)静默突变;其中p.Q232Q为此次检测的高检出突变位点。结论明确了新疆南疆地区维吾尔族苯丙酮尿症患儿PAH基因第6外显子的突变种类和特征,为深入研究奠定基础。     

宁夏汉族苯丙氨酸羟化酶基因突变分析

目的 了解宁夏汉族苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)基因的突变构成及特点。方法 采用PCR产物直接测序的方法,测定12例汉族苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)患儿PAH基因全部外显子及其启动子区域序列。结果 在24个PAH等位基因中共检出18个突变基因,突变检出率为75%(18/24),这些突变包含11种类型,其中错义突变9种、无义突变1种、剪切位点突变1种。 结论 研究结果显示宁夏地区汉族PAH基因突变表现出多样性、复杂性,呈现明显的地域特色。     

新疆地区维吾尔族和回族苯丙氨酸羟化酶基因突变分析

目的了解新疆地区维吾尔族和回族苯丙酮尿症(PKU)患者苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因的突变特征,为该地区PKU的产前诊断和遗传咨询提供理论依据。方法应用PCR产物直接测序法、基因芯片捕获和二代高通量测序技术共对47例维吾尔族和回族PKU患儿及其父母的PAH基因启动子、第1~13外显子及其旁侧内含子等区域进行PAH基因突变分析。结果在新疆地区维吾尔族(33例)、回族(14例)PKU患者PAH等位基因中分别检测出27种、19种不同的突变基因,总检测率分别为89.4%(59/66)、89.3%(25/28),均以错义突变(51.9%、68.4%)、剪接位点突变和无义突变为主,两民族PAH基因大部分致病突变主要分布在第6、7、12外显子。维吾尔族PKU患者PAH基因最常见的致病突变是R413P(12.1%)、R243Q(9.1%)、EX6-96AG(7.6%)、F161S(7.6%)、IVS10-11GA(6.1%)、P281L(4.5%)和IVS11-2AC(4.5%);而回族最常见的致病突变是R413P、R243Q、R155H、R176X、R241C和A300S(均为7.1%),新疆维吾尔族PKU患者最常见的PAH基因致病突变是R413P,不同于中国汉族和韩国最常见突变是R243Q,也不同于欧洲最常见突变是R408W。IVS11-2AC和R155H可能分别是新疆维吾尔族、回族独有的PAH突变类型,新疆维吾尔族、回族PAH基因突变与中国北方类似,但显著区别于欧洲、拉丁美洲及中亚等国家及地区。新疆地区回族PKU患者中检出的M1I(c.3GT)是国际上未见报道的新的PAH基因突变,而T81N(c.242CA)、V230A(c.689TC)和L348V(c.1042CG)突变为国内首次报道。结论新疆地区维吾尔族和回族的PAH突变基因具有其自身独立保守的特性,而且还存在相互交叉、相互融合的特征,提示新疆多民族地区是研究基因突变多样性、PAH异质性以及人类起源、迁徙等的遗传资源宝库。     

河南省苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因外显子7突变特点

目的:了解河南省苯丙酮尿症(PKU)患者苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因外显子7突变类型和频率。方法:采用聚合酶链反应和基因测序的方法对河南省48例经典型PKU患者的PAH基因外显子7进行检测分析。结果:检出5种苯丙氨酸羟化酶基因突变,R243Q、G247R、G247V、R261X、L255S,其频率分别为18.8%(18/96),4.2%(4/96),3.0%(3/96),1.0%(1/96)和1.0%(1/96)。48例PKU患者有15例携带R243Q突变,其中纯合突变3例,杂合突变12例。结论:R243Q、G247R和G247V为河南省PKU患者常见的突变类型,R243Q是PKU患者的基因突变热点。     

应用碱性磷酸酶标记探针检测苯丙酮尿症突变基因

为建立一种简便易行。快速可靠的检测苯丙氨酸羟化酶基因点突变的方法,应用PCR技术扩增PAH基因外显子3,5,6,7,10,11,12序列,以碱性磷酸酶标记的ASO探针进行Southern印迹杂交,从而直接检测PAH基因突变,结果在15例患者中,检测出7种点突变,该结果与测序分析结果(另文发表)一致。证明碱性磷酸酶标记的PCR-ASO探针杂交法可快速、简便、准确、安全、可靠地检则PAH基因点突变,在PKU筛查中具有广泛应用价值。     

菏泽市苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变特点

目的 分析菏泽市苯丙酮尿症(PKU)患儿苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变特点,为深入开展PKU的诊断以及进一步的基因治疗提供科学依据。方法 采用高通量测序技术对临床确诊且自愿进行基因检测的PKU患儿的遗传代谢病相关基因进行检测,检出位点采用sanger测序进行验证及父母验证。结果 28个患者经测序分析后,共检出致病变异位点53个,总检出率为94.6%。其中25个患者检测到2个致病突变(89.3%),3个患者检测出1个突变位点(10.7%)。在53种变异类型中,错义突变38种(71.7%)、剪接突变4种(7.5%)、无义突变11种(20.8%)。变异位点分布在PAH基因第2、3、6、7、9~11外显子以及第4内含子区。外显子区变异位点50个(94.3%),内含子区变异位点3个(5.7%)。经典型PKU患儿以 c.1068C＞A为主,轻度PKU患儿以c.158G＞A、c.728G＞A为主,轻度高苯丙氨酸血症(HPA)以c.158G＞A及c.1068C＞A为主。c.158G＞A、c.728G＞A和c.1068c＞A的检出人数较多,c.158G＞A在轻度PKU及轻度HPA患儿中检出,平均Phe浓度为860.74 μmol/L,c.728G＞A在经典型PKU、轻度PKU患儿中检出,平均Phe浓度为879.51 μmol/L,c.1068C＞A在经典型PKU及轻度HPA患儿中检出,平均Phe浓度为1 098.44 μmol/L。结论 菏泽市PKU患儿PAH基因突变以c.158G＞A、c.728G＞A及c.1068C＞A突变为主。     

苯丙酮尿症的基因诊断

应用生物素—链抗生物素蛋白系统的固相技术,对PCR扩增后DNA片段进行直接顺序分析,检测了东北地区13例经典型PKU患者PAH基因点突变.结果表明;13例PKU患者中检出7种点突变,发现7种PAH基因突变组合类型,其中突变R243Q、R413P、Y204C和R111X是分别位于PAH基因第7、12、6和3外显子处的4种常见突变.本研究准确可靠地确定了PAH基因分子缺陷的遗传机理,为该疾病的基因诊断和基因治疗提供了科学依据.     

先天性甲状腺功能减退症患儿双氧化酶1基因突变研究

目的 研究山东地区先天性甲状腺功能减退症(CH)伴甲状腺肿大患儿双氧化酶1(DUOX1)基因突变类型及特点,为CH的诊断及基因治疗提供理论依据。方法 选取43例经新生儿筛查确诊为CH伴甲状腺肿大患儿及100例正常对照新生儿,提取CH患儿及正常新生儿外周血基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增及一代测序法(Sanger测序法),对DUOX1基因全部外显子进行基因突变检测,结合测序结果及生物信息学数据,分析DUOX1基因是否存在突变,并对发现的单核苷酸多态性(SNP)位点的基因频率进行χ²检验。结果 在43例CH伴甲状腺肿大患儿及100例正常对照新生儿中,均未发现DUOX1基因突变。但在外显子区发现了2个SNP位点(rs16939752,c.3076T>C;rs1706804,c.3228A>G),前者为错义突变(Cys→ Arg),后者为同义突变(Thr→Thr);内含子区发现了1个SNP位点(rs2020216,IVS8+129C>T)。经统计,本文实验组患儿与正常对照组新生儿SNP的基因频率比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 山东地区CH伴甲状腺肿大患儿中,DUOX1基因突变率低,可能不是该地区CH伴甲状腺肿大的主要病因。     

深圳地区人群苯丙酮尿症患者基因分析

目的 探讨深圳地区苯丙酮尿症(PKU)患血苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)基因单核苷酸多态性位点。方法 设计7对引物，应用多聚酶链反应-单链构像多态(PCR-SSCP)银染技术和DNA序列分析了3个PKU家族共13个成员的PAH基因。结果 PCR-SSCP分析发现，其中2个家族的子女及其父母有电泳条带异常。测序结果示两多态性位点均在内含子10上。结论 2种突变类型可能为单核苷酸变化。     

MPT抗原阴性的结核分枝杆菌复合群临床分离株mpt64突变特征分析

目的 分析MPT抗原阴性的结核分枝杆菌复合群临床分离株mpt64突变特征。 方法 收集湖南省胸科医院2017年1—6月BACTEC MGIT 960法(MGIT 960)培养分离的菌株,通过生化和分子生物学方法进行菌种鉴定,然后将结核分枝杆菌复合群随机抽取部分MPT抗原阳性株及全部MPT抗原阴性菌株进行DNA提取、mpt64基因扩增测序和序列比对,并对结核分枝杆菌复合群MPT抗原呈阴性的临床分离株mpt64突变特征进行分析。 结果 2017年1—6月湖南省胸科医院就诊的结核病患者的痰液或支气管肺泡灌洗液等标本共分离出2 560株结核分枝杆菌,其中MPT抗原检测阳性有2 458株,MPT抗原检测阴性有102株,MPT抗原阴性占比3.98% (102/2 560)。随机抽取的20株MPT抗原阳性株的mpt64基因无突变。测序成功的85株MPT抗原阴性的临床分离株中,有81株mpt64基因存在 63 bp碱基的缺失突变,有4株存在单碱基突变,2株402位G→A,2株613和614位间加了碱基C。 结论 湖南省胸科医院MPT抗原呈阴性的结核分枝杆菌复合群临床分离株mpt64基因突变主要类型为63bp碱基的缺失。     

乙型肝炎肝硬化患者与乙型肝炎病毒携带者乙型肝炎病毒X基因序列比较研究

目的研究乙型肝炎肝硬化患者与乙型肝炎病毒（HBV）携带者HBV X基因序列的差异。方法对20例标本的PCR产物进行直接测序;并对3例乙型肝炎肝硬化患者和3例无症状HBV携带者HBV DNA的扩增片段进行克隆测序,并分析比较。结果肝硬化患者中X基因核心启动子双突变T1762/A1764、G1719T、T1727G/A、G1730C、T1753C等变异高于HBV携带者;前者X启动子区变异率明显高于后者;乙型肝炎肝硬化同一患者X区不同克隆之间的碱基序列同源性为91.3%-99.7%,而HBV携带者为96.0%-100.0%。结论乙型肝炎肝硬化患者,HBV DNA X区的CP启动子区以及X启动子区变异程度明显高于HBV携带者,同时乙型肝炎肝硬化患者体内存在变异程度更大的HBV准种群。     

p53-Bax线粒体凋亡通路DNA甲基化与胆管癌病理生物学的关系

目的探讨p53-Bax线粒体凋亡通路抑癌基因启动子区的甲基化状态与胆管癌病理生物学行为的关系。方法采用甲基化PCR检测36例胆管癌患者癌组织和癌旁组织中抑癌基因甲基化诱导静止基因（TMS1／ASC）、死亡相关蛋白激酶（DAPK）和p14启动子区甲基化状态,并对p53基因外显子5～8进行DNA测序,分析以上基因的突变与胆管癌生物学行为的关系。结果24例（66．7％）胆管癌患者癌组织中至少有1个抑癌基因启动子区存在甲基化,p14、DAPK和TMS1／ASC的甲基化率分别为25％、30．6％和36．1％。5例（13．9％）患者的癌旁组织中存在抑癌基因启动子区甲基化,其中TMS1／ASC启动子区甲基化3例（8．3％）,DAPK启动子区甲基化2例（5．6％）。DNA测序显示,22例（61．1％）胆管癌患者癌组织中p53基因外显子5～8存在突变。其中14例（38．9％）p53基因外显子突变伴1个以上抑癌基因启动子区甲基化,与胆管癌的病理类型、浸润深度、分化程度显著相关（P〈0．05）。抑癌基因非甲基化及p53突变阴性组（4例）术后1、2、3年的生存率分别为70％、43％、28％,抑癌基因甲基化及p53突变阳性组（14例）术后1、2、3年的生存率分别为28％、5％、0％,前者的生存率显著高于后者（X^2=9．060,P=0．03）。结论p53-Bax线粒体凋亡通路中抑癌基因启动子过甲基化是胆管癌组织中常见的分子事件,癌旁组织中TMS1／ASC和DAPK基因甲基化程度虽然较低,但可能对胆管癌有早期诊断意义。p53突变伴抑癌基因甲基化与胆管癌的病理生物学行为有关,趋向于较高的恶性程度和较低的生存率。     

深圳地区当地与外来人口乳腺癌BRCA1基因突变位点的比较

目的:探讨深圳地区当地与外来人口乳腺癌BRCA1基因突变发生率及突变位点差异。方法:入选202例明确诊断为原发性乳腺癌女性患者,其中深圳地区64例,外来人口138例,收集两组人群一般资料进行比较,PCR/DNA方法检测两组人群BRCA1基因突变发生率及突变位点;采用Logistic回归分析影响乳腺癌发病率的危险因素。结果:①外来患者平均年龄较深圳本地患者小(P<0.05),两组人群乳腺癌病理类型分布、乳腺癌家族史百分率差异均有统计学意义(P<0.01)。②深圳本地乳腺癌患者存在基因突变为22例(占34.4%),存在5个BRCA1基因突变位点;外来患者存在基因突变为54例(占39.1%),存在4个BRCA1基因突变位点,两组人群BRCA1基因突变发生率差异有统计学意义(P<0.05);两组人群中有3个基因突变位点相似。③Logistic回归分析提示乳腺癌发病率与阳性家族史、地区差异以及基因突变相关。结论:深圳地区当地与外来患者乳腺癌BRCA1基因突变发生率及突变位点存在差异,这可能导致两组人群发病年龄及病理类型存在差异的原因。