狼疮鼠淋巴细胞IgG2aVH区反义RNA重组体的构建及鉴定

目的 :构建系统性红斑狼疮 (SLE)鼠模型 (NZW×NZB)F1淋巴细胞IgG2aVH 区反义RNA表达重组体 ,为SLE基因治疗提供基础。方法 :采用逆转录—PCR技术克隆狼疮鼠淋巴细胞IgG2aVH 区cDNA ,经T/A克隆再定向插入表达载体pcDNA3.1,并经酶切电泳 ,PCR ,DNA测序鉴定分析。结果 :经鉴定 ,证明成功构建了表达狼疮鼠淋巴细胞IgG2aVH 区的重组体。结论 :BWF1和鼠淋巴细胞中存在IgG2aVH 区 ,其表达型重组体可用于IgG2aVH 的大量复制。     

hURAT1基因5’UTR区荧光素酶表达重组体的构建

目的构建人尿酸盐转运蛋白1(hURAT1)基因5’UTR区荧光素酶表达重组体。方法PCR扩增包含hURAT1基因启动子最小功能单位和5’UTR区域在内的DNA片段,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic,构建hURAT1 5’UTR区表达重组体。重组体经双酶切后测序进行鉴定。结果克隆获得的590 bp的DNA序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。结论成功构建了含hURAT1基因5’UTR区的荧光素酶表达载体,可用于后续功能研究。     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。     

人心肌肌钙蛋白I基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因的原核表达重组体并鉴定。方法利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人cTnⅠ的cDNA片段,设计引物将其第二和第四个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体,并导入宿主菌BL21(DE3)中,采用双酶切及PCR方法鉴定后测序。结果经PCR扩增成功获得699bp的cTnI基因,重组体酶切分析及PCR显示结果与预想一致,测序正确。结论成功克隆了cTnI基因并构建了原核表达重组体。     

以内部核糖体进入位点序列连接两个独立表达基因构建重组腺病毒双表达载体

目的:以内部核糖体进入位点(IRES)序列连接鼠TGF-β1和PLP-Ig 2基因,构建重组腺病毒双表达载体.方法:采用常规分子生物学方法,分别从Con A刺激的小鼠脾细胞和WT-1杂交瘤细胞抽提总RNA,克隆鼠TGF-β1基因和Ig重链Fc基因;将编码PLP139-151的DNA与信号肽设计在引物上,经过2次克隆,形成PLP-Ig.与TGF-β1以IRES序列相连接后,经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接,鉴定后在HEK 293细胞包装.获得高滴度病毒后,采用ELISA方法鉴定TGF-β1基因的表达;Western印迹鉴定PLP-Ig的表达.结果:该双表达重组腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定,与预期结果一致;病毒感染细胞分别经ELISA和Western印迹检测后证实TGF-β1和PLP-Ig得到了独立表达.结论:构建的可调控性鼠TGF-β1和PLP-Ig重组腺病毒双表达载体的独立表达,为后续基因治疗研究奠定了基础.     

重组原核表达载体pQE30-hALRIP的构建及鉴定

目的:构建人肝再生增强因子相互作用肽(hALR interacting protein,hALRIP)重组原核表达载体并进行鉴定.方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增hALRIP编码区基因,将PCR扩增产物克隆至pMD18-T载体中并测序.利用pQE30质粒载体构建重组原核表达载体pQE30-hALRIP,并通过酶切电泳鉴定重组质粒.结果:构建了重组克隆载体pMD18-hALRIP和重组表达载体pQE30-hALRIP,测序及酶切鉴定与预计相同.结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-hALRIP,为进一步研究该多肽奠定基础.     

携带人PPARγ1受体基因高效真核表达载体的构建及其意义

目的:构建高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体γ1(hPPARγ1)的真核表达载体,为hPPARγ1受体功能和基于hPPARγ1受体靶点的药物筛选提供分子研究平台。方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从HepG2细胞总RNA克隆hPPARγ1全长基因,与经XhoI、SmaI相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建重组质粒phPPARγ1-IRES2-EGFP,经酶切及测序鉴定重组质粒中hPPARγ1基因的完整性和忠实性;荧光显微镜观察重组质粒转染的293细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞hPPARγ1的表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测。结果:经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARγ1的高效表达。结论:成功构建phPPARγ1-IRES2-EGFP重组质粒,为基于hPPARγ1受体靶点的药物筛选平台的建立及受体功能研究提供了高效表达载体。     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的构建人PCK1基因的真核表达载体。方法以人内脏脂肪细胞cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致。重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体。     

miR-1腺病毒载体的构建及表达分析

目的构建并鉴定microRNA-1(miR-1)的腺病毒表达载体。方法 PCR扩增含大鼠miR-1前体的DNA片断,并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack。pAdTrack经PmeI酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组。重组质粒pAdprecusor-miR-1线性化后,转染293A细胞,进行病毒包装,得到重组腺病毒颗粒Ad-miR-1。Ad-miR-1与Ad-GFP病毒转染培养的乳鼠心肌细胞,通过实时荧光定量PCR方法检测miR-1的表达效率。结果基因测序及酶切鉴定证实重组Adprecursor-miR-1腺病毒载体构建成功;腺病毒Ad-miR-1转染心肌细胞后,实时荧光定量PCR方法证实腺病毒Ad-miR-1能够显著提高心肌细胞内miR-1的表达水平。结论利用同源重组的方法构建的miR-1腺病毒能够提高心肌细胞内miR-1的表达水平。     

结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。     

狼疮鼠淋巴细胞IgG2aVH区反义RNA重组体的构建及鉴定

OBJECTIVE: To construct recombinant plasmid of IgG2aVH region antisense RNA of systemic lupus erythematous. METHODS: Total RNA was isolated from spleen cell of BWF1 mice. Using spleen cell total RNA as the template, We designed specific primers from A6.1 region sequences, and amplified the IgG2aVH region 375 bp DNA fragments by RT-PCR. The IgG2aVH cDNA was cloned by T/A and inserted into pcDNA 3.1 plasmid of vector. RESULTS: The IgG2aVH antisense RNA plasmid expressing recombinant was identified by restriction enzyme digestion and DNA sequence analysis. CONCLUSION: There is IgG2aVH gene in F1 mice spleen cell; the IgG2aVH antisense RNA expressing recombinants is constructed successfully.     

mTOR反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的反义RNA真核表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSNC）功能的影响。方法：提取人VSMC总RNA，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增mTOR基因cDNA序列，经pGEM-T载体克隆后双酶切，将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1，构建mTOR基因反义RNA真核表达载体。转染VSMC，采用Western blot法检验反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响，流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果：经RT-PCR获得664bp产物，T载体克隆后，经DNA测序，确定该片段为mTOR基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR，测序证明序列正确后转染VSMC，证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达，VSMC的分裂、增殖过程受阻。结论：已经成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体。     

利用反义技术抑制大肠杆菌β-内酰胺酶基因表达的实验研究

目的探讨利用反义表达质粒抑制细菌耐药基因表达的可行性。方法根据GenBank中β-内酰胺酶TEM-1基因序列设计一对寡核苷酸引物，通过PCR扩增获取TEM—1基因，将其反向克隆入质粒pBK—CMV的多克隆位点构建反义表达质粒，将此反义表达质粒导入携带TEM-1型β-内酰胺酶的大肠杆菌，Western—blotting检测TEM-1表达情况。结果成功构建了TEM-1基因的反义表达质粒，将其导入携带TEM-1型β-内酰胺酶的大肠杆菌后，Western-blotting检测发现TEM-1表达显著下调。结论利用反义表达质粒可抑制大肠杆菌β-内酰胺酶TEM-1基因表达。     

可溶性BTLA真核表达载体的构建及其抗肿瘤作用

目的初步研究确定体内表达可溶性B、T淋巴细胞衰减因子（BTLA）对肿瘤生长的抑制作用，探索新的肿瘤免疫治疗途径。方法采用RT—PCR及重组DNA技术构建可溶性BTLA真核表达质粒，体外细胞转染检测重组质粒的转录表达，小鼠实体瘤模型研究基因转染抑制肿瘤生长的作用。结果用RT—PCR从小鼠脾细胞中扩增出编码BTLA胞外段cDNA，克隆至真核表达载体pcDNA3．1．获得重组表达质粒pBTLA；体外转染BHK细胞可检测到重组质粒的转录表达；肌肉内注射转染质粒pBTLA可明显抑制H22小鼠肿瘤的生长。结论可溶性BTLA能够抑制肿瘤生长．提示B7x-BTLA途径参与肿瘤免疫耐受．封闭此途径有可能成为肿瘤免疫治疗的新靶点。     

鼠源TRAIL真核表达质粒的构建及其抑瘤效应的初步观察

采用RT-PCR自小鼠脾细胞RNA中扩增出鼠TRAIL基因的全长cDNA，利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1中获得重组质粒pX1。经酶切鉴定及序列分析，表明成功构建TRAIL的真核表达质粒。通过直接肌肉内注射进行基因转染，pX1具有诱导肝癌细胞凋亡，抑制肝癌生长的作用。表明TRAIL可作为一种直接杀伤机制应用于肝癌的基因治疗。     

人CpG-寡脱氧核苷酸对质粒DNA免疫刺激活性的影响

目的：研究人CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODN)对DNA疫苗质粒骨架免疫刺激活性的影响。方法：将多拷贝对人和小鼠均有免疫刺激活性的CpG2006序列导入质粒骨架,并在小鼠模型体内外评价重组质粒DNA的免疫刺激活性。结果：首先构建了质粒pMini,仅含有卡那抗性基因和pUC18复制起点,然后向pMini中导入了多拷贝对小鼠具有交叉免疫刺激活性的人CpG2006拷贝数的增加,质粒DNA在体外活化小鼠脾细胞分泌IgM的能力逐步增强,但诱生IFN－γ的能力却依次降低,用重组质粒DNA作为HBsAg疫苗佐剂,免疫BALB／c小鼠,pMini和pCpG11对特异性总抗体以及IgG1亚型抗体水平无明显影响（P＞0．05）,但pCpG26能够使两类抗体水平分别提高3倍（P＜0．001）和2倍（P＜0．02）,所有质粒DNA均能够使IgG2a亚型抗体水平提高5－10倍,但三者之间差异无显著意义（P＞0．05）,结论：向质粒骨架中导入一定数量的人CpG-ODN能够增强质粒DNA的免疫刺激活性。     

反义X区RNA和反义P区RNA小鼠体内抗HBV的比较

目的:探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)X区反义RNA和P区反义RNA对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响.方法:构建表达HBV X区反义RNA和P区反义RNA的重组载体质粒,与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用荧光聚合酶链反应定量法检测血清HBV DNA含量,用Nested-PCR法检测血清HBV DNA转阴率.结果:PLXSN-asX小鼠血清HBV DNA的复制于给药后2 d被抑制,至给药后8周抑制依然存在;PLXSN-asP小鼠血清HBV DNA的复制于给药后4 wk被抑制,至给药后8周抑制处于上升趋势. 与给药前相比,小鼠血清HBV DNA的复制,在PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别于2和8 wk达到抑制高峰,抑制率均为58%; 8周后小鼠血清HBV DNA转阴率PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别为25.0%(2/8), 12.5%(1/8).结论:HBV X区反义RNA与HBV P区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠抗HBV作用效率无显著差异,但X区反义RNA的起效时间明显早于P区反义RNA.     

EBV—LMP1反义基因真核表达载体的构建及序列鉴定

目的：构建ＥＢ病毒ＬＰＭ１反义基因的真核表达载体。方法：通过ＰＣＲ方法,扩增ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因的第一外显子片段,使之反向克隆到质粒ｐｃＤＮＡ３．１的多克隆位点中。经限制性酶切、ＰＣＲ扩增和测序鉴定重组载体。结果：酶切产物和ＰＣＲ产物的凝胶电泳显示４００ｂｐ左右的目的基因片段,测序结果显示与已知ＬＭＰ１基因序列一致。结论成功构建了ＬＭＰ１反义基因的真核表达载体。