大蒜素体外抗B组柯萨奇病毒的实验研究

目的 研究大蒜素体外抗柯萨奇病毒B（Coxsackievirus group B type1-6,CVB1～CVB6）的作用。方法 观察大蒜素的细胞毒性、对CVB1～CVB6直接灭活作用、抗CVBI～CVB6吸附作用及对CVB1～CVB6生物合成抑制作用。结果 大蒜素对Hep-2细胞的半数中毒浓度（TC50）分别为2100μg／mL；无直接灭活CVB-CVB6及抗CvB1～CVB6吸附作用；大蒜素可呈剂量依赖性抑制CVB2、CVB6、CVB6生物合成。结论 大蒜素在体外通过抑制吨、CVB3、CVB6生物合成而发挥抗CVB的作用。     

柯萨奇B3病毒对HL-1心肌细胞的影响

目的探讨柯萨奇B3病毒对HL-1心肌细胞影响。方法实时荧光聚合酶链反应检测柯萨奇B3病毒感染的HL-1心肌细胞Bcl-2及Bax的表达：Annexin V-PE凋亡检测试剂盒检测感染的HL-1心肌细胞发生凋亡的比率,并与未感染心肌细胞进行对比。结果感染后4h组（0．199±0．005vs0．104±0．014,P=0．0008）及24h组（0．154±0．005vs0．1044-0．014．P=0．0176）的Bel－2／Bax表达均显著高于未感染组,差异有统计学意义。感染后4h组的Bel-2／Bax表达高于感染后24h组,差异有统计学意义（0．199±0．005孤0．154±0．005,P=0．0009）。感染后4h组（9．160％±0．161％vs．0．908％±0．015％,P〈0．0001）、12h组（6．305％±0．231％vs．0．908％±0．015％．P〈0．0001）、24h组（3．260％±0．162％vs0．908％±0．015％,P〈0．0001）的心肌细胞凋亡率显著高于未感染组,差异均有统计学意义。感染后4h组的心肌细胞凋亡率高于感染后12h组（9．160％±0．161％vs．6．305％±0．231％．P〈0．0001）和24h组（9．160％±0．161％vs．3．260％±0．162％,P〈0．0001）,差异均有统计学意义。结论柯萨奇B3病毒导致HL-1心肌细胞的凋亡,在感染4h后增加尤为明显。     

柯萨奇B3m病毒致T-2毒素染毒鼠心肌损伤的病理观察

目的：观察T－2毒素染毒小鼠感染柯萨奇B3m病毒（CVB3m）后心肌损伤的特点。方法：BALB／C小鼠随机分成4组，病毒组腹腔接种病毒液；毒素＋病毒组接种病毒前T－2毒素隔日灌胃，3周后腹腔接种与病毒组同等剂量的病毒液;毒素组单纯T－2毒素隔日灌胃；对照组生理盐水灌胃，腹腔接种1640营养液。观察各组小鼠心肌光镜、普通电镜、酶学电镜改变以及心肌病毒核酸持续感染情况。结果：毒素＋病毒组心肌损伤明显重于病毒组和毒素组，病灶纤维化明显，可见结缔组织增生、瘢痕形成。线粒体空泡变明显，酶活性产物严重脱失。结论：T－2毒素梁毒小鼠感染CVB3m后，心肌病变加重，心肌出现慢性损伤。     

柯萨奇病毒B组3型基因疫苗预防实验性心肌炎的研究

目的：以构建的柯萨奇病毒B组3型（CV3）VP1基因的真核表达系统pCEP4-CVB3VP1作为基因疫苗,评价其对CVB3实验性心肌炎的预防作用。方法：大量制备pCEP4-CVB3VP1,提纯后将其接种BALB／C小鼠,取血清进行ELISA,病毒中和试验和病毒攻击保护实验,结果：ELISA证明pCEP4-CVB3VP1表达产物可刺激机体产生抗CVB3的的特异性IgM,病毒中和试验证明其可诱导机体产生中和抗体。中和CVB3毒力,病毒攻击保护实验证明其可保护接种小鼠抵抗CVB3攻击,结论：pCEP4-CVB3VP1能诱导机产生免疫应答,可作为基因疫苗预防CVB3心肌炎。     

蟾甘合剂对柯萨奇B3病毒的抑制作用

目的探讨蟾甘合剂体内外抗病毒作用及机理。方法采用细胞培养法、MTT法检测蟾甘合剂的抗病毒作用;通过不同的给药时间、途径研究其抗病毒作用的环节;建立病毒性心肌炎模型,通过组织病理学检查法观察蟾甘合剂对柯萨奇B3病毒感染动物的保护作用。结果蟾甘合剂具有抑制柯萨奇B3病毒繁殖的作用,并能有效预防及控制小鼠心肌炎的发生与发展。结论蟾甘合剂对柯萨奇B3病毒感染引起的心肌炎具有预防及治疗作用。     

柯萨奇病毒B3引致心肌细胞钙超载及细胞凋亡的研究

目的以柯萨奇病毒B3(CVB3)感染体外培养的小鼠心肌细胞,探讨CVB3感染心肌细胞后对心肌细胞周期、心肌细胞凋亡和心肌细胞浆游离钙的影响.方法制备心肌细胞样本,设正常对照组及实验组(CVB3感染心肌细胞),流式细胞仪、钙荧光探针标记分别检测细胞周期、细胞凋亡及心肌细胞浆内游离钙.结果CVB3感染心肌细胞后,可显著抑制心肌细胞的分裂增殖,诱导心肌细胞凋亡;显著增高心肌细胞浆内游离钙浓度和减少细胞外钙含量.结论CVB3感染体外培养的心肌细胞,可能引起心肌细胞凋亡和心肌细胞浆内钙超载,初步实验提示此种变化可能是病毒性心肌炎心脏损伤的重要机制.     

柯萨奇B1病毒VP1基因DNA免疫的研究

目的：构建柯萨奇B1病毒（CVB1）的DNA疫苗，评价其免疫学性状。方法：将重组质粒pMD18-T-VPI中的CVB1 VP1基因亚克隆至pCEP4载体,构建真核表达系统pCEP4－VP1作为DNA疫苗，经酶切、PCR和测序后鉴定后转染至HeLa细胞，用间接免疫荧光法检测CVB1抗原的体外表达。提纯制备pCEP4－VP1接种BALB／C小鼠，取血清用ELISA法检测抗CVB1IgM和IgG，用^51Cr释放法测定CTL反应。结果：酶切、PCR和测序证明了VP1 DNA疫苗构建正确，转染pCEP4－VP1的HeLa细胞中可见到荧光标记，提示表达了VP1蛋白，接种pCEP4－VP1的小鼠可检测到抗CVB1的IgM的IgM和IgG，并能产生较强的特异性CTL反应。结论：pCEP4-VP1可作为DNA疫苗诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答。     

柯萨奇B4和B3M病毒重叠感染对低硒昆明鼠T细胞亚群的影响

目的：观察低硒,补硒鼠先后感染ＣＶＢ４,ＣＶＢ３Ｍ两种病毒七天后,小鼠脾脏Ｔ细胞亚群的变化。方法：小鼠先后感染ＣＶＢ４,ＣＶＢ３Ｍ两种病毒七天后,检测脾脏Ｔ细胞亚群细胞数,血清中和抗体及心肌组织病毒滴度。结果：在低硒感染组ＣＤ４,ＣＤ８,ＣＤ３均显下降,而补硒感染组ＣＤ３,ＣＤ４,ＣＤ８Ｔ淋巴细胞亚群都明显升高,心肌组织病毒,病变程序及检出率低硒病毒组显重于补硒组,血清中和抗体效价低硒组显低于补硒组。结论：硒缺乏可以导致机体免疫功能的低下,而ＣＶＢ４,ＣＶＢ３Ｍ病毒的二重感染导致低硒鼠的的免疫功能进一步低下。     

柯萨奇病毒B3型VP1基因在酿酒酵母中的表达

目的在酿酒酵母AH109中表达柯萨奇病毒B3型VP1基因，并检测VP1蛋白对报告基因的转录自激活作用。方法用乙酸锂法将重组柯萨奇B3病毒VP1基因的细菌一酵母菌穿梭载体pGBKT7一VP1转化酵母菌。通过表型鉴定、PCR法验证质粒导入宿主菌后，Western blotting验证VP1蛋白的表达，最后经营养缺陷培养基和酶底物x—a-Gal反应检测VP1基因对报告基因的转录自激活作用。结果表型鉴定和PCR法均证实pGBKT7-VP1质粒转入酵母菌成功，Western blotting证实AH109能表达VP1蛋白，营养缺陷型培养基和酶底物X-a—Gal反应结果显示VP1蛋白对3种报告基因均无转录自激活作用。结论柯萨奇病毒B3型VP1蛋白可作为酵母双杂交系统的诱饵蛋白，为筛选与其相互作用的宿主细胞蛋白提供了基础。     

柯萨奇病毒B3在心肌疾病中作用的分子基础

柯萨奇病毒Ｂ３在心肌病中的作用与其基因组的特定核酸序列有关,其毒性尤其决定于５′端非编码区的第２３４位核苷酸上的碱基（是Ｕ还是Ｃ）;可能与宿主的免疫状态有关;可能与柯萨奇病毒Ｂ３无毒株在特定条件下（缺硒）的遗传突变有关;柯萨奇病毒Ｂ３蛋白与硒蛋白的结构有相似性     

鞘磷脂酶在柯萨奇病毒B3感染心肌细胞中的作用

目的检测柯萨奇病毒B3(CVB3)感染心肌细胞后鞘磷脂酶活性的变化、鞘磷脂酶mRNA、CVB3RNA的表达、病毒滴度的变化及心肌细胞表型的变化。初步探讨鞘磷脂酶在CVB3感染的心肌细胞中的作用。方法 CVB3感染心肌细胞后不同时间点,用薄层色谱法(TLC)检测鞘磷脂酶活性;用Real time-PCR检测心肌细胞中鞘磷脂酶mRNA与CVB3RNA的表达;同时取细胞培养上清液检测CVB3滴度。用Annexin V-FITC,PI双染法观察心肌细胞表型变化。设正常心肌细胞对照组,每个时间点设三个复孔。结果病毒感染组与正常心肌细胞相比,酸性鞘磷脂酶在4h、12h时活性有升高,其mRNA表达在2h时有升高趋势(P0.05);中性Mg2+非依赖性鞘磷脂酶活性在4h时有明显升高,在12h时活性下降,而其mRNA表达在20h时升高(P0.05);中性Mg2+依赖性鞘磷脂酶活性于病毒感染后4h、12h无明显变化,其mRNA表达在各组间也无明显变化。心肌细胞内病毒RNA表达在4h时有升高趋势,8h后开始明显升高(P0.01)。CVB3病毒滴度在2h时明显升高(P0.05)。心肌细胞在病毒感染2h后早期凋亡及坏死开始增加,4h时凋亡坏死增加更明显,到24h时坏死心肌细胞明显增多。以上实验均重复3次。结论中性Mg2+非依赖性鞘磷脂酶与酸性鞘磷脂酶在CVB3侵入心肌细胞及病毒的扩散增殖过程中可能起重要作用;而中性Mg2+依赖性鞘磷脂酶在此过程中可能不起作用。     

Coxsackievirus B3m与T-2毒素对小鼠脂质过氧化物代谢的影响

目的 探讨Ｔ－２毒素与ＣｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓＢ３ｍ的双重作用小鼠肝脏脂质过氧化物的影响。方法 实验采用析因设计，ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠随机分为４组，Ｉ正常对照组，ＩＩ病毒组，ⅢＴ－毒素组，Ⅳ病毒＋毒素组，病毒组常腹腔接种０．１ｍｌ内含１０００ＴＣＩＤ５０的１６４０营养液，毒素组隔日按１．０ｍｇ／ｋｇ体重Ｔ－２毒素灌胃，直至实验结束，病毒＋毒素组先Ｔ－２灌胃，３周后腹腔接种同稀释度病毒，各组鼠于病毒     

重组柯萨奇B3病毒VP1基因的穿梭表达载体的构建及鉴定

目的　构建重组柯萨奇B3病毒VP1基因的细菌 -酵母菌穿梭表达载体pGBKT7-VP1。方法　用PCR从质粒pT7-CV3- 5 5中扩增柯萨奇B3病毒VP1基因 ,经NdeⅠ和PstⅠ双酶切后 ,定向插入细菌 -酵母菌穿梭表达载体 pG BKT7中完成质粒构建。用酶切和测序鉴定构建质粒。结果　限制性内切酶酶切和序列分析表明VP1巳成功插入pGBKT7载体的多克隆位点 ,克隆方向和阅读框与病毒VP1基因一致。结论　本研究成功构建VP1基因的细菌 -酵母菌穿梭表达载体 pGBKT7-VP1,为研究VP1蛋白与其宿主细胞之间的相互作用奠定了基础。     

一株引起病毒性脑炎的柯萨奇B3病毒的生物学特性分析

目的通过分析分离自病毒性脑炎病人的一株柯萨奇病毒B3株KMA103-09生物学特性,研究其致病机理。方法将KMA103-09病毒分别按一定量接种至KMB17细胞、RD细胞、VERO细胞、Hep-2细胞、Hela细胞及MRC-5细胞进行培养,观察细胞的生长情况,并采用微滴法检测病毒在不同时间、不同细胞中的病毒感染滴度;将一定量KMA103-09病毒注射乳鼠和成鼠脑内,观察病毒的致病性,并检查鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-r、TNF、IL-17A、IL-10含量。结果该病毒株在6种细胞上皆能适应生长,并产生明显的细胞病变效应。病毒在Hela细胞上生长繁殖最快,42h时细胞全部发生病变,感染性滴度达8.625lgCCID50/ml;在MRC-5细胞上病毒的感染性滴度最低,120h才全部发生病变,感染性滴度为5.50lgCCID50/ml。该病毒对一日龄乳鼠致死并在脑、肺和心脏等组织产生病理改变,实验乳鼠血清IL-6、IL-10、TNF含量分别为4.71pg/ml、21.08pg/ml和36.79pg/ml,与阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）,其余4种皆无表达。该病毒对成鼠不致病,脑、肺、心脏病理检查无异常。结论 KMA103-09病毒在Hela细胞生长适应性良好,对乳鼠致病而对成鼠不致病。     

针对HBV X基因的siRNA抑制HepG2细胞HBV的复制和表达

目的构建能转录产生针对乙型肝炎病毒（HBV）X基因转录体的小干扰RNA（siRNA）转录载体pSIH—BV／X,研究其在体外对HBV复制和抗原表达的抑制作用。方法将构建成功的pSIHBV／X与HBV1．3倍体真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞，转染后24、48、72h检测上清液中HBsAg、HBeAg的变化，并检测72h时HBV DNA的变化。结果成功构建了针对HBVX基因转录体的siRNA表达载体pSIHBV／X，并发现它能抑制HBsAg、HBeAg的分泌，抑制高峰在72h．抑制率分别是64％和61％，而无关对照序列的siRNA无此作用。荧光定量PCR证实HBV DNA的复制亦受到抑制，抑制率31％。结论针对HBVX基因转录体的siRNA在体外具有抑制HBV复制和抗原表达的作用。     

针对P基因的siRNA对乙肝病毒S表达稳定性的影响

目的以乙型肝炎病毒（HBV）P基因为靶点，构建表达小干扰RNA（siRNA）的质粒载体psRNA1、psRNA2、psRNA3、psRNA4及对照psiRNA0，体外观察针对P基因的siRNA对HBs表达的影响。方法设计并合成针对HBV-P基因的siRNA寡核苷酸，经退火形成双链后克隆入psiRNA-H1neo质粒中，通过鉴定将构建成功的5个psiRNAs真核表达质粒瞬时转染HepG2．2．15细胞，用半定量RT-PCR对筛选到的位点进行了试验观测抑制效果。结果表明针对P基因的siRNA能下调HBs的表达，其中psiRNA1、psiRNA2的抑制HBs基因表达的效果最强。结论针对P基因的siRNA可以有效的抑制HBs的表达，抑制的效果和siRNA的靶位点有关。     

Effect of interleukin-15 on the course of myocarditis in Coxsackievirus B3-infected BALB/c mice

OBJECTIVE:

Cytokines have an important role in both the initiation and perpetuation of viral myocarditis. Because a causative therapy of myocarditis is not yet well established and immunomodulation is a promising approach, the influence of interleukin (IL)-15, a proinflammatory cytokine, on the course of experimental myocarditis in Coxsackievirus B3 (CVB3)-infected mice was examined.

METHODS:

Hearts from CVB3-infected (n=14), sham-infected (n=14) and CVB3-infected BALB/c mice treated with IL-15 (n=6) or a competitive IL-15 fusion protein (n=6) were analyzed for hemodynamic function, cellular infiltrates and myocardial collagen content.

RESULTS:

Induction of myocarditis was associated with significant loss of body and heart weight, decreased left ventricular function, and increased collagen content and cellular infiltrates in the myocardium. Treatment of infected animals with IL-15 resulted in normalization of body and heart weight, and significantly improved systolic and diastolic left ventricular function, comparable with that of uninfected animals. This was paralleled by a significant reduction of myocardial collagen content to levels observed in animals without disease and by markedly reduced cellular infiltration of lymphocytes and macrophages in the myocardium. Inhibition of intrinsic IL-15 with IL-15 fusion protein tended to aggravate the disease.

CONCLUSIONS:

Treatment with IL-15 has a positive effect on CVB3-induced murine myocarditis and seems to be a promising approach to modifying clinical course, hemodynamics and histopathology of virus-induced myocarditis. Further studies are needed to identify the underlying mechanisms.     

柯萨奇病毒B组3型中国分离株VP1基因真核表达系统的克隆

目的探讨构建柯萨奇病毒Ｂ组３型（ＣＶＢ３）基因疫苗的可行性。方法应用逆转录ＰＣＲ技术扩增ＣＶＢ３中国分离株ＶＰ１基因,通过ＴＡ克隆法构建ｐＣＲ２．１－ＣＶＢ３ＶＰ１,将ＣＶＢ３ＶＰ１亚克隆至真核表达载体ｐＣＥＰ４,构建真核表达系统ｐＣＥＰ４－ＣＶＢ３ＶＰ１,并进行酶切和测序鉴定。结果发现ＣＶＢ３的中国分离株与Ｎａｎｃｙ株的ＶＰ１基因基本一致,均编码２９３个氨基酸,其中有５９处核苷酸存在变异,但仅改变了１０处氨基酸编码,证实克隆的片段为ＣＶＢ３ＶＰ１基因,表达载体为ｐＣＥＰ４。结论实验成功地构建了ＣＶＢ３中国分离株的真核表达系统ｐＣＥＰ４－ＣＶＢ３ＶＰ１,为ＣＶＢ３基因疫苗的研究奠定了基础     

Congenital Skin Lesions Caused by Intrauterine Infection with Coxsackievirus B3

Summary Background: Serious neonatal coxsackievirus infections transplacentally acquired in late pregnancy involve primarily the central nervous system, heart, liver and rarely the skin. Patients and Methods: A boy born with a disseminated papulovesicular, nodular, bullous and necrotic ulcerated rash at 39 weeks gestational age developed pneumonia, carditis and hepatitis during the first days after birth. Molecular biological and serological methods were used for virological diagnosis. Results: Coxsackievirus B3 (CVB3) was found in throat swabs and/or feces of the neonate and his mother. In addition, there was serological evidence of intrauterine infection. Conclusion: Intrauterine transmission of CVB3 during late pregnancy may lead to varicella-like congenital skin lesions. Received: January 17, 2000 · Revision accepted: June 28, 2000