腺病毒介导的LacZ基因在乳腺癌细胞中的表达

目的：观察腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞的转导效率及腺病毒转导对细胞生长的影响。方法：腺病毒介导的基因转导。结果：在病毒的重复感染率（MOI）为500时细胞的转导效率达到100％；不同数量的病毒转导乳腺癌细胞对癌细胞的生长没有明显影响。低温冻存可使病毒的感染性明显下降。结论：腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞中有高的转导效率，而病毒载体本身对细胞的生长没有影响，可用作乳癌特异药物前体酶激活基因治疗的基因转移方法。     

腺病毒介导的LacZ基因在乳腺癌细胞中的表达

观察腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞的转导效率及腺病毒转导对细胞生长的影响。方法：腺病毒介导的基因转导。结果：在病毒的重复感染率为５００时细胞的转导效率达到１００％；不同数量的病毒转导乳腺癌细胞对癌细胞的生长没有明显影响。低温冻存可使病毒的感染性明显下降。结论：腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞中有高的转导效率，而病毒载体本身对细胞的生长没有影响，可用作乳癌特异物前体酶激活基因治疗的基因转移方法。     

腺病毒对内皮及成纤维细胞和血管环转染及基因表达的研究

目的：比较腺病毒对不同血管内皮及成纤维细胞的转染和对人冠状动脉搭桥动脉静脉血管的转导，为携带目的基因的腺病毒治疗血管狭窄提供更好的转染途径。方法：腺病毒Ad5CMVLacZ体外转染血管内皮细胞（HUVEC）和成纤维细胞（PA317）并间接转导入胸廓内动脉和大隐静脉血管环，运用β-半乳糖苷酶活性X－gal组织化学染色，观察转染情况，并进行动态分析。结果：腺病毒载体能使外源性基因有效地转入HUVEC、PA317及两种血管环并获得蛋白表达；两种血管环在转染10d后仍有β-半乳糖苷酶蛋白的表达，且大隐静脉有新内膜形成和中膜的增厚。结论：从细胞水平上证明腺病毒载体能将治疗性目的基因导入各种血管细胞及动静脉血管并获得表达，提示血管内膜和外膜都是腺病毒有效转染的途径；临床上无论动脉或静脉的血管狭窄都可能通过用腺病毒作为载体进行基因治疗和预防。     

AFP启动子控制的在肝癌细胞中特异性表达绿色荧光蛋白报告基因的腺病毒载体的研究

目的研究由AFP启动子控制的腺病毒载体在肝癌细胞中定向表达报告基因活性。方法采用分子生物学技术手段。将AFP启动子和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因插入腺病毒载体质粒中，并在293细胞中重组出携带GFP基因的腺病毒AdAFP—GFP。荧光显微镜下观察GFP基因在肝癌细胞中的特异性表达。结果AdAFP—GFP能够介导GFP基因在肝癌细胞中特异性表达，多数细胞呈现荧光反应，而在正常细胞中未发现GFP的表达。结论采用AFP启动子可以实现目的基因在肝癌细胞中定向而特异性表达，这项研究应用于抗肿瘤基因治疗，将有利于显著提高治疗效果。     

胰岛素样生长因子受体靶向性基因导人系统的体外和体内导人瘤谱

目的 通过研究E5基因导入系统的体外、体内基因导入瘤谱,建成一个平台技术：一个基因导入系统可用于多种肿瘤的基因治疗。方法 应用E5基因导入系统在体外、体内转移报告基因到IGF I R阳性的多种肿瘤细胞与裸小鼠皮下肿瘤。结果 E5基因导入系统在体外转移报告基因到富于IGF I R的5种肿瘤细胞,在体内将报告基因转移到IGF I R阳性裸小鼠皮下肿瘤,其导入率与IGF I R表达水平呈正相关。而体外、体内均不能将报告基因导入到IGF I R阴性的肿瘤细胞和裸小鼠皮下肿瘤。结论 E5基因导入系统具有相对的靶向性与广谱性,在临床基因治疗研究和应用中具有潜在的价值。     

腺病毒对内皮及成纤维细胞和血管环转染及基因表达的研究

目的比较腺病毒对不同血管内皮及成纤维细胞的转染和对人冠状动脉搭桥动脉静脉血管的转导,为携带目的基因的腺病毒治疗血管狭窄提供更好的转染途径.方法腺病毒Ad5CMVLacZ体外转染血管内皮细胞(HUVEC)和成纤维细胞(PA317)并间接转导入胸廓内动脉和大隐静脉血管环,运用β-半乳糖苷酶活性X-gal组织化学染色,观察转染情况,并进行动态分析.结果腺病毒载体能使外源性基因有效地转入HUVEC、PA317及两种血管环并获得蛋白表达;两种血管环在转染10d后仍有β-半乳糖苷酶蛋白的表达,且大隐静脉有新内膜形成和中膜的增厚.结论从细胞水平上证明腺病毒载体能将治疗性目的基因导入各种血管细胞及动静脉血管并获得表达,提示血管内膜和外膜都是腺病毒有效转染的途径;临床上无论动脉或静脉的血管狭窄都可能通过用腺病毒作为载体进行基因治疗和预防.     

新型腺病毒载体的制备及其特性研究

目的：本研究在普通腺病毒载体（Adv）纤毛头节区插入了具有整合素特异性的RGD肽,制备了一种新型RGD-Adv,以克服Adv基因转导的柯萨奇腺病毒受体依赖性.方法：用体外连接法构建RGD-Adv,并考察其基因转效率、稳定性及体外、体内毒性.结果：RGD-Adv可有效地实现向受试细胞转导基因,其转导能力随病毒量的增加而加强.结论：具有av亲和性的RGD-Adv是一种安全高效的新型腺病毒载体,将在基因治疗及实验研究中发挥重要作用.     

Rb基因对血管平滑肌细胞生长抑制作用的研究

目的探讨腺病毒载体介导的Ｒｂ基因对血管平滑肌细胞的作用，及其应用于动脉粥样硬化及动脉再狭窄基因治疗的可能性。方法构建Ｒｂ基因的重组腺病毒载体，体外转染兔血管平滑肌细胞。应用生化染色、免疫组化及聚合酶链反应检测基因的转染效率、基因表达情况。应用细胞计数、同位素掺入、流式细胞仪检测手段，观察Ｒｂ基因对平滑肌细胞生长的作用。结果腺病毒载体能快速有效地将外源性基因导入平滑肌细胞并表达。Ｒｂ基因导入可抑制平滑肌细胞生长，减少细胞ＤＮＡ合成，减少合成后期和分裂期细胞量，增加静止期和合成前期细胞。结论腺病毒载体介导Ｒｂ基因导入有可能作为动脉粥样硬化及动脉再狭窄的基因治疗手段。     

基因-病毒载体的研制及其抗肿瘤作用的初步研究

目的：研究一种结合肿瘤基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤治疗载体系统,即基因－病毒载体系统。方法：利用病毒重组技术将抗癌基因插入肿瘤细胞特异性的增殖病毒的病毒基因组中,通过细胞病理作用、荧光显微镜、免疫酶链技术及电镜等技术分别观察病毒的杀伤效应、报告基因绿色荧光蛋白、抗癌基因小鼠白细胞介素12表达量及病毒复制情况。结果构建了一种新型基因－病毒载体系统,该载体系统腺病毒E1b55000蛋白缺失,保留了腺病毒E1a蛋白。该载体系统具有肿瘤增殖病毒ONYX－015的相似功能,即它可在肿瘤细胞内复制及增殖,而在正常细胞内不能复制及增殖,从而特异性杀灭肿瘤细胞。该载体系统还可携带各种抗癌基因以进一步提高抗肿瘤的疗效。应该该载体系统携带该报告基因荧光蛋白可使绿色荧光蛋白在肿瘤细胞内高效表达,其表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体系,而在正常细胞内低表达,表达量与传统腺病毒载体系统相似或更低。应用该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素12,也产生类似结果。电镜也证实该载体系统携带抗肿瘤基因小鼠白细胞介素12可在肿瘤细胞株中复制及增殖。结论：基因－病毒载体将抗癌基因插入肿瘤增殖病毒基因组,可数百倍乃至上万部提高抗癌基因的表达量,进一步提高抗肿瘤的疗效。     

腺病毒介导的p53和顺铂的联合应用对胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用

目的：研究ｐ５３基因和顺铂联合应用对胆管癌细胞的作用。方法：将重组体腺病毒ｐ５３和顺铂联合作用于人胆管癌细胞ＱＢＣ９３９，对ｐ５３基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果：用Ａｄ－ＬａｃＺ进行复组腺病毒转导效率的检测，发现当ＭＯＩ为１００以上时，重组腺病毒可使９０％以上的培养的人胆管癌ＱＢＣ９３９细胞被传导，用ＲＴ－ＰＣＲ方法，在胆管癌ＱＢＣ３９细胞系中ｐ５３无表达。重组体腺病毒能介导外源基     

野生型p53基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究

目的探讨逆转录病毒载体介导的人野生型ｐ５３基因转移对预防血管成形术后再狭窄的作用。方法构建野生型ｐ５３基因逆转录病毒载体，通过逆转录病毒载体介导，将野生型ｐ５３基因转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，２１ｄ后观察其对新生内膜形成的影响，并检测ｐ５３蛋白表达水平。结果构建和包装了人野生型ｐ５３基因的重组逆转录病毒载体，并在体外细胞中表达；用逆转录病毒载体转导野生型ｐ５３基因至大鼠球囊损伤的颈动脉，免疫组化检测表明转导血管局部表达人野生型ｐ５３蛋白，且与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了４４％。结论人野生型ｐ５３基因治疗对血管成形术后再狭窄有一定的预防作用     

野生型Rb基因转移预防血管成形术后再狭窄的实验研究

目的：探讨人野生型Rb基因转移对预防血管成形术后再狭窄的作用。方法：通过逆转录病毒载体介导，将野生型Rb基因转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中，21天后观察其对新生内膜形成的影响，并检测Rb蛋白表达水平。结果：成功地构建和包装了人野生型Rb基因的重组逆转录病毒载体，并在体外细胞中成功表达；免疫组化检测表明转导血管局部表达人野生型Rb蛋白，与对照组相比，损伤血管新生内膜／中层面积比降低了49％。结论：人野生型Rb基因治疗时血管成形术后再狭窄有一定的预防作用。     

Protective effect of adenovirus-mediated BDNF gene expression on spinal axon following in rats after spinal cord injury

The routine treatments of spinal cord injury are palliative in Practice at Present. Their goal is only to preventthe secondal injeq and the complications, and then thepatients to adapt new life style under palalysis condition.The sprouting and the Plasticity of the neims in foe centlal nervous system (CNS) Of malnlnals has been ProVedll]. It is wen known that the neurntrOPhins facilitatethe renovation and regenerahon of the ne~ns in CNS after injuries. HoweVer the c~ive effect Of the ne…     

用infiltrator导管向兔髂动脉壁内导入calponin基因的效果

目的 探讨calponin基因对血管再狭窄的防治作用；评价用infiltrator系统进行基因转染的实用价值。方法 以pCAGGS质粒为基因载体，以脂质体为介导，用infiltrator浸壁球囊导管向兔髂动脉壁内导入人重组calponin基因。结果 实验组（n=6)基因转染全部成功。4wk后转基因组血管内膜增生较轻，而对照组（n=6）血管内膜明显增生，管腔显变窄。未观察到目的基因及转染系统相关的不良反应。结论 infiltrator导管是活体局部转基因的合适工具；用该导管转染calponin基因可能成为防治血管再狭窄的有效方法。     

Intravascular local gene transfer mediated by protein- coated metallic stent

Objective To assess the feasibility, efficiency and selectivity of adenovirus- mediated ge ne transfer to local arterial wall by protein- coated metallic stent. Methods A replication- defective recombinant adenovirus carrying the Lac Z reporter gene for nuclear- specific β- galactosidase (Ad- βgal) was used in this study. Th e coating for metallic stent was made by immersing it in a gelatin solution cont aining crosslinker. The coated stents were mounted on a 4. 0 or3. 0mmpe rcutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA) balloon and submersed into a high- titer Ad- βgal viral stock (2×10(10)pfu/ml) for 3 min, and then im planted into the carotid arteries in 4 mini- swines and into the left anterior d escending branch of the coronary artery in 2 mini- swines via 8F large lumen gui ding catheters. The animals were sacrificed7 (n=4), 14 (n=1) and 21 (n=1) days after implantation, respectively. The β- galactosidase expression was as sessed by X- gal staining. Results The results showed that the expression of transgene was detected in all animal. In 1 of carotid artery with an intact intima, the β- gal expression was l imited to endothelial cells. In vessels with denuded endothelium, gene expressi on was found in the sub- intima, media and adventitia. The transfection efficie ncy of medial smooth muscle cells was 38. 6%. In 2 animals sacrificed 7 days af ter transfection, a microscopic examination of X- gal- stained samples did not s how evidence oftransfection in remote organs and arterial segments adjacent to the treated arterial site.Conclusions Adenovirus- mediated arterial gene transfer to endothelial, smooth muscle cells and adventitia by protein- coated metallic stent is feasible. The transfection efficiency is higher. The coated stent may act as a good carrier of adenovirus - mediated gene transfer and have a potential to prevent restenosis following PT CA.     

MISE AU POINT D'UNE TECHNIQUE D'ADMINISTRATION IN VIVO DES VECTEURS GENETIQUES DANS LEMUSCLE CARDIAQUE

Objective In order to improve the in vivo gene transfer into the heart muscle, we have designed a ECG-synchronized microinjection system that allows sequential gene delivery to the myocardium.Methods A cannula was introduced into the right carotid artery of the Wistar rat under general anesthesia.With the ECG-synchronized injection during diastole, the genetic vector (Ad CMV lacZ ) infusion was performed with various concentrations( l07 ～ l010pfu ) and different frequency ( the ratio of heart beats per injection from 1: 1 to 4: 1 ). The hearts of the rats were removed after 7 days for histological examination. Results Best results were obtained with a total vector amount of l09 pfu and a good ratio 3: 1 between heart frequency and injection frequency. The transfection efficiency was increased by use of vasodilators and by an increase of vascular permeability. No signs of myocardial ischemia or ventricular arrythmia were observed. Conclusion We have established a novel and safe method for in vivo gene transfer into the heart. Transgene expression suggests that this method may be useful technique to study cardiac function of treat cardiac diseases by means of gene theratpy.     

Angiogenesis effects of adenovirus—mediated gene transfer of VEGF—B on chronic ischemic myocardium

Objective: To study the angiogenesis effects of adenovirus-mediated gene transfer of VEGF-B on chronic ischemic myocardium. Methods: Domestic pigs underwent thoracotomy and placement of an ameroid constrictor on the circumflex coronary artery. Four weeks later, Ad. VEGF-B, Ad. LacZ or PBS were administrated directly into the myocardium at 10 sites in the circumflex distribution (109 PFU or 100 μl) according to groups. Echocardiography and ex vivo coronary angiography were performed. The injection sites around myocardium were harvested and subjected to histological analysis and immunochemical staining. Results: E-chocardiography assessment 4 weeks after vector administration demonstrated significant improvement of regional wall systolic function. Collateral vessel development assessed by angiography was also significantly greater in Ad. VEGF-B animals than that in control animals. Vascular density analysis revealed a mean of 43±5 neovessels per high-power field in Ad. VEGF-B group versus 19±4 and 17±6 in