原代人脐静脉内皮细胞分离培养方法的探讨及其鉴定

目的通过比较两种原代人脐静脉内皮细胞的分离培养方法并对细胞特异性抗原进行鉴定,探索提高原代内皮细胞体外培养存活率及纯化率的方法。方法采用一次性无菌注射器向人脐静脉灌注消化液,消化液的浓度和消化时间分别0.25%（质量体积比）胰蛋白酶,10min和0.1%（质量体积比）胶原酶Ⅱ,15min。通过在倒置显微镜下观察细胞的形态特点和用免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定,比较两种消化方法的优劣。结果 0.1%胶原酶Ⅱ,15min的消化方法较0.25%胰蛋白酶,10min对原代人脐静脉内皮细胞有更好的分离效果,活细胞数量多且细胞纯度较高。免疫荧光染色结果表明细胞内有Ⅷ因子相关抗原表达。结论胶原酶Ⅱ可以有效分离脐静脉内皮细胞,最佳消化条件是0.1%胶原酶Ⅱ,37℃,15min。     

人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术

目的探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离原代培养的方法,并总结对培养的细胞鉴定方法。方法通过胰酶灌注法从人脐带获取内皮细胞进行分离培养,并采用免疫组化法及光镜和透射电镜观察超微结构鉴定所获得的细胞系。结果分离的HUVEC在体外7-10天左右可长成单层,光镜下胞体为单层铺路石状排列。第VⅢ因子相关抗原的检测为阳性。透射电镜下观察培养的内皮细胞胞浆内可见Weibel-Palade小体。结论用胰酶灌注法是获得脐静脉内皮细胞的有效方法。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

与人脐静脉内皮细胞共培养的人脐动脉平滑肌细胞生物学特性研究

目的：通过共培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical venous endothe1ial cells，HUVEC)与人脐动脉平滑肌细胞(human umbilical arterial smooth muscle cells，HUASMC)，初步探讨共培养的HUASMC的形态和增殖特性。方法：用共培养装置将体外同时培养在一个培养孔中的HUVEC和HUASMC分离。在倒置显微镜下观察单独培养和共培养HUASMC的生长状态和形态；采用免疫荧光法标记细胞，流式细胞仪测定荧光强度和细胞周期。结果：共培养的HUASMC由长梭状变肥大，处于静止期状态；单独培养的HUASMC仍保持长梭形。共培养的和单独培养的HUASMC处于细胞周期G2+S期和G0／G．期的百分率为：(85&;#177;4)％和(69&;#177;3)％：(11&;#177;2)％和(20&;#177;3)％。两者均有Cyclin D的表达，但后者的表达显著高于前者。结论：单独培养的HUASMC无血清干预48h后仍保持长梭形，而共培养的HUASMC逐渐变肥大，进入静止期形态。此外，前者的增殖活性也显著高于后者。     

低频电磁场对培养的人脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶的影响

背景：目前认为经磁场作用的酶，大多有增强活性的倾向，而关于低频电磁场(low frequency electromagnetic field，LFEMF)对培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性表达的影响研究不多见。目的：探讨不同磁场强度，不同作用时间的LFEMF对HUVEC的NOS活性表达的影响，以探讨LFEMF用于经皮冠脉腔内成形术(percutanuous transluminal coronary angioplasty，FFCA)及支架植入术后冠脉再狭窄防治的意义。设计：随机对照的实验研究。地点、材料和干预：本研究在解放军第四军医大学西京医院心内科实验室完成。体外培养的人脐静脉内皮细胞系ECV304按LFEMF的不同磁场强度，不同作用时间分为9个实验组和1个对照组进行干预：进行ABC免疫酶染色后图像分析法观察HUVEC的NOS表达。主要观察指标：非磁场干预与不同强度磁场干预的体外培养的人脐静脉内皮细胞NOS结果。结果：除60mT20min组，60mT30min组外，其余各实验组内皮细胞结构型NOS(Endothelium Constnmtive nitric oxide synthase，ecNOS)表达均较对照组增强，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)。所有实验组与对照组诱生型NOS(Induced nitric oxide synthase，iNOS)均无表达。结论：LFEMF增强了培养的HUVEC的ecNOS的表达，可能适用于再狭窄的防治。     

人脐静脉血管内皮细胞分离与原代培养体会

目的:探讨分离人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和原代培养的可靠方法与经验.方法:利用0.1%胶原酶消化、分离、体外原代培养脐静脉血管内皮细胞,0.125%胰酶-0.02%EDTA溶液消化传代,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子、CD31细胞免疫组化及对乙酰化LDL高摄取试验进行内皮细胞鉴定.结果:脐静脉血管内皮细胞的体外原代培养、传代生长均良好,呈典型的铺路石样形态学表现,Ⅷ因子、CD31细胞免疫组化显示阳性反应,及Dil-Ac-LDL摄取荧光检测提示其具有强摄取能力,从而鉴定为血管内皮细胞.结论:本方法获得的HUVEC量多,方法简单、可靠,为血管内皮细胞的研究提供实验模型.     

阴性突变Rac-N17基因转染对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的 探讨基因转染对内皮细胞凋亡的影响及其相关机制。方法 采用凝血酶诱导法诱导人脐静脉内皮细胞株（HUVECs）凋亡，检测细胞凋亡情况及caspase-3活性。结果 结果显示，凝血酶诱导48 h后，HUVECs细胞浆内颗粒和空泡增多，细胞凋亡率明显增高，caspase-3活性明显增加，而加入RacN17干预后，细胞凋亡率明显降低、caspase-3活性明显下降。结论 Rac-N17基因转染能防止细胞的凋亡与衰老，保护血管内皮细胞。     

血管抑素对人脐静脉内皮细胞及体外微血管模型的作用

目的:观察血管抑素对人脐静脉内皮细胞及体外微血管模型的抑制作用。方法:实验于2005-01/2006-12在中国医科大学基础医学院实验病理研究室(省部级)完成。①采用改进的Jaffe式培养法体外培养人脐静脉内皮细胞。②MTT法检测不同质量浓度(1,2,4,8,16,32mg/L)、不同时间(24,48,72h)血管抑素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。③流式细胞仪检测不同质量浓度(2,4,8,16,32mg/L)的血管抑素对人脐静脉内皮细胞生长周期的影响。④建立肿瘤微血管体外生成模型,培养4,8,12h倒置显微镜观察血管网形成情况;血管网未形成之前加16mg/L血管抑素观察对血管形成的影响;肿瘤微血管体外生成模型经24h培养形成血管网后加16mg/L血管抑素观察对新生血管的影响。结果:①血管抑素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响:8,16,32mg/L血管抑素能明显抑制人脐静脉内皮细胞的生长(P<0.01),血管抑素作用于人脐静脉内皮细胞24,48,72h后细胞明显受抑制(P<0.01),这种作用具有剂量-时间依赖性。②血管抑素对人脐静脉内皮细胞生长周期的影响:血管抑素作用于人脐静脉内皮细胞后能诱导细胞凋亡。③血管抑素对体外血管模型的影响:光镜下血管抑素可抑制新生血管的形成,且能破坏新生的血管网。结论:血管抑素可能抑制人脐静脉内皮细胞增殖,从而破坏新生血管形成,抑制肿瘤的生长和转移。     

不同浓度尿酸对体外培养人脐静脉血管内皮细胞增殖过程的影响

背景:近年对尿酸特别是其与心血管疾病的研究较多,但多集中在流行病学领域,从细胞学角度探讨尿酸对内皮细胞影响的研究并不多见。目的:观察不同浓度的尿酸对体外培养的人脐静脉内皮细胞株(ECV304)丙二醛,一氧化氮及3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐的影响。设计:以人脐静脉内皮细胞为观察对象,随机对照实验。单位:解放军第四军医大学西京医院内分泌科。材料:脐静脉内皮细胞株ECV304由解放军第四军医大学免疫教研室提供;DMEM低糖培养基,美国Gibco公司生产;胎牛血清,北京元亨圣马生物技术研究所生产;胰蛋白酶,美国Gibco公司生产;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,华美公司生产;二甲基亚砜(DM-SO),分析纯,天津博迪化工有限公司生产;尿酸,Sigma公司生产。一氧化氮测试盒,丙二醛测试盒,南京建成公司生产。普通倒置显微镜、酶联免疫检测仪IX70型倒置显微镜,日本Olympus生产;酶联免疫检测仪,华东电子管厂生产。方法:实验于2003-12/2004-04在第四军医大学内分泌科和烧伤科进行。内皮细胞的复苏、培养、传代、接种均参考司徒镇强等主编的《细胞培养》中的方法进行。用无血清DMEM培养24h使细胞同步化于G0/G1期,分4组实验,分别为对照组,低浓度尿酸组,中浓度尿酸组和高浓度尿酸组,每组分为24h,48h和72h3个时间点,每个时间点8个样本。对照组,低浓度尿酸组,中浓度尿酸组和高浓度尿酸组分别加入含有0mmol/L,0.1mmol/L,0.2mmol/L,0.4mmol/L尿酸的5%的血清培养液,然后将培养板放入37℃,体积分数为0.05的CO2孵箱中孵育。在24h后检测丙二醛,一氧化氮及3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,48h及72h分别再检测3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐。主要观察指标:各组人脐静脉内皮细胞增殖情况及一氧化氮和丙二醛的含量。结果:随尿酸浓度增高,ECV304产生丙二醛的含量逐渐下降,分别为(2.97±0.05),(2.89±0.09),(2.78±0.10),(2.44±0.03)μmol/L。ECV304产生一氧化氮的量分别为(6.86±1.41),(12.5±2.7),(18.9±1.8),(21.1±1.4)μmol/L,ECV304产生一氧化氮的量和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐吸光度逐渐增加,细胞增殖以48h增加最为明显。结论:尿酸有抗氧化性,可促进血管内皮细胞的增殖及一氧化氮的释放。     

肾小管上皮细胞分离方法与原代培养

肾小管皮皮细胞培养是研究肾肘疾病的一项重要技术，目前该细胞分离方法有酶分离法、化学分离法筛网分离法、显微解剖分离法、流式细胞仪分离法、免疫分离法。本文就这些分离方法及所分离出细胞的性质做一综述。     

氯吡格雷对人脐静脉内皮细胞全基因表达谱的影响及生物信息学分析

本研究探讨氯吡格雷对体外培养人脐静脉内皮细胞(EA.hy926)基因表达谱的影响及作用的分子机制。将10μmol/L氯吡格雷与人脐静脉内皮细胞株共培养48 h,运用Affymetrix U133 plus2.0全基因组表达芯片检测氯吡格雷对人脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响,应用分子注释系统MAS3.0软件进行聚类分析,实时定量RT-PCR验证基因表达谱结果。结果表明:氯吡格雷作用内皮细胞48 h后,基因芯片分析筛选出差异表达大于1.5倍的基因508个,其中上调基因139个,下调基因369个,包括蛋白结合、转录因子活性、锌离子结合、DNA依赖的转录的调节、转录、RNA剪接等相关基因,RT-PCR验证结果与基因芯片结果一致。结论:氯吡格雷在基因水平通过多条通路调节内皮功能。     

人脐静脉内皮胞细体外培养及鉴定

目的探索人脐静脉内皮细胞体外培养及鉴定的方法。方法采用0.1%Ⅰ型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,加入含10%胎牛血清及人AB血清的M1640培养基,在37℃,5%CO2孵箱中培养,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果原代培养细胞在接种4 h后开始贴壁生长,5～7 d后融合成单层,倒置相差显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列,有接触抑制现象,免疫组化显示细胞胞浆中人Ⅷ因子相关抗原阳性。结论用胶原酶灌注消化脐静脉是获得内皮细胞的一种可靠的方法,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。     

Melatonin attenuates homocysteine‐induced injury in human umbilical vein endothelial cells

Homocysteine (Hcy) is a major risk factor for vascular disease and is closely associated with endothelial dysfunction. Melatonin is a neurohormone that is mostly produced by the pineal gland. Studies have reported that melatonin exhibits neuroprotective effects in several neurodegenerative disorders. The aim of the current study was to investigate the possible protective effect of melatonin against Hcy‐induced endothelial cell apoptosis in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and to explore the underlying mechanisms. HUVECs were exposed to Hcy in the presence or absence of melatonin. The effect of melatonin on viability was examined by MTT assay. Intracellular reactive oxygen species (ROS) levels were determined by 2′,7′‐dichlorofluorescein diacetate (DCF‐DA). Further, expression of Bax, Bcl‐2, and caspase‐3 was analyzed by Western blot analysis. Lipid peroxidation (LPO) levels, total antioxidant power (TAP), and total thiol molecules were also evaluated. The results of this study revealed that melatonin significantly prevented Hcy‐induced loss in cell viability in HUVECs. It was found that ROS significantly increased in the presence of Hcy, whereas melatonin reduced ROS production. Melatonin also downregulated Bax, upregulated Bcl‐2, and decreased the expression and activity of caspase‐3. Hcy increased the levels of LPO, and this effect was significantly attenuated by melatonin. Melatonin also increased the levels of TAP and total thiol molecules. It was concluded that melatonin played a protective role against Hcy‐induced endothelium cell apoptosis through inhibition of ROS accumulation and the mitochondrial‐dependent apoptotic pathway.     

The effect of folic acid on the homocysteine metabolism in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)

Mild hyperhomocysteinaemia is associated with increased risk for vascular disease. We studied homocysteine export from human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) by measuring total homocysteine (tHcy) concentrations in the culture medium. Under standard culture conditions tHcy concentrations in the HUVEC culture medium increased by constant amounts after 24, 48 and 72 h [mean = 2.5 (SD ± 0.7) μmol L⁻¹ homocysteine every 24 h]. As the cells are the only source of homocysteine increase in the culture medium, we designate this as homocysteine export from HUVEC. Folic acid supplementation to the culture medium lowered the homocysteine export in a dose-dependent manner. Methyl-tetrahydrofolate (MeTHF) and folinic acid (a stable precursor of MeTHF) were in this respect about 10 times more effective than folic acid. A 50% reduction in the homocysteine export was seen with 10–30 nmol L⁻¹ MeTHF supplementation; reduction to almost zero was seen with 100–300 nmol L⁻¹ MeTHF. Additions to the culture medium of the other vitamins involved in the homocysteine metabolism, such as vitamin B₁₂, vitamin B₆ and flavin adenine dinucleotide, did not show any effect on homocysteine export. Because homocysteine export reflects an imbalance in the homocysteine metabolism, our observations showed a susceptible dependency of this metabolism on folic acid in endothelial cells.     

山莨菪碱和蜕皮激素对内毒素致体外内皮细胞能量代谢的保护作用

目的：探讨山莨菪碱（６５４－２）和蜕皮激素９ＥＤＳ）对内毒素（ＬＰＳ）致伤培养脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣｓ）能量代谢的保护作用。方法：采用反相市郊和液相色谱分析法测定ＬＰＳ损伤后培养ＨＵＶＥＣｓ ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ及能量负荷（ＥＣ）的变化以及６５４－２、ＥＤＳ的保护作用。结果：ＬＰＳ与内皮细胞孵育后低浓度、早期内皮细胞被激活,ＬＰＳ同一浓度刺激后,随刺激时间延长,ＨＵＶＥＣｓ ＥＣ降低,与正常     

人脐静脉血管内皮细胞移植对脱细胞猪真皮早期血管化的影响

目的探讨脐带血管内皮细胞对脱细胞猪皮早期血管化的影响。方法将8只贵州小香猪的背侧去毛后对称性分为4个区,前后交叉分为两组:实验组(n=16),和对照组(n=16)。每个区均切除皮肤全层至深筋膜,造成大小为5cm×5cm的圆形皮肤缺损区域,然后移植脱细胞猪真皮封闭创口。实验组在脱细胞猪真皮下注射培养的人脐带静脉血管内皮细胞1ml,含2×106个细胞,对照组则不注射任何细胞。术后7d和14d分别在每个区切取脱细胞猪真皮不同部位的3个点以进行组织学和免疫组化检查,观察血管生成情况。结果第7天实验组血管数比对照组明显增加(P<0.01),第14天时实验组血管数仍然比对照组多,但没有统计学意义(P>0.05)。结论人脐静脉血管内皮细胞移植具有促进脱细胞猪真皮早期血管化的作用。     

恒磁场对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的　研究不同强度的恒磁场对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。方法　体外培养的第 3代人脐静脉内皮细胞 ,分为对照组及不同剂量磁场组。各剂量磁场作用组的磁感应强度分别为 0 .0 5mT、0 .1mT、1mT、10mT、30mT、60mT和 10 0mT ,磁场作用时间均为 48h。用3H TdR法及MTT法测定细胞增殖。结果　 0 .0 5mT组细胞增殖显著高于对照组 (0 .2 92± 0 .0 10对 0 .2 2 0± 0 .0 0 8,P <0 .0 5 ) ;0 .1mT组细胞增殖与对照组相比无明显差异 (0 .2 31± 0 .0 0 9对 0 .2 2 0± 0 .0 0 8,P >0 .0 5 ) ;其余剂量组细胞增殖均显著低于对照组 (P <0 .0 5 )。结论　 0 .0 5mT的恒磁场可以促进人脐静脉内皮细胞的增殖     

血小板微颗粒对人脐静脉内皮细胞组织因子表达影响的初步探讨

目的探讨血小板微颗粒（PMPs）可刺激人脐静脉内皮细胞（ECV-304）表达组织因子（TF）。方法将一定数量分离于人富血小板血浆（PRP）的PMPs加到ECV-304细胞作用一定时间后,应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、流式细胞术检测细胞TF表达。结果一定数量PMPs可刺激ECV-304细胞表达TF,但与相同反应条件下一定浓度内毒素（LPS）作用于ECV-304细胞表达的TF量有所不同。结论PMPs可刺激ECV-304细胞表达TF。     

血小板微颗粒对人脐静脉内皮细胞组织因子表达影响的初步探讨

目的探讨血小板微颗粒(PMPs)可刺激人脐静脉内皮细胞(ECV-304)表达组织因子(TF)。方法将一定数量分离于人富血小板血浆(PRP)的PMPs加到ECV-304细胞作用一定时间后,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术检测细胞TF表达。结果一定数量PMPs可刺激ECV-304细胞表达TF,但与相同反应条件下一定浓度内毒素(LPS)作用于ECV-304细胞表达的TF量有所不同。结论PMPs可刺激ECV-304细胞表达TF。