人脐静脉血管内皮细胞分离与原代培养体会

目的:探讨分离人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和原代培养的可靠方法与经验.方法:利用0.1%胶原酶消化、分离、体外原代培养脐静脉血管内皮细胞,0.125%胰酶-0.02%EDTA溶液消化传代,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子、CD31细胞免疫组化及对乙酰化LDL高摄取试验进行内皮细胞鉴定.结果:脐静脉血管内皮细胞的体外原代培养、传代生长均良好,呈典型的铺路石样形态学表现,Ⅷ因子、CD31细胞免疫组化显示阳性反应,及Dil-Ac-LDL摄取荧光检测提示其具有强摄取能力,从而鉴定为血管内皮细胞.结论:本方法获得的HUVEC量多,方法简单、可靠,为血管内皮细胞的研究提供实验模型.     

原代人脐静脉内皮细胞分离培养方法的探讨及其鉴定

目的通过比较两种原代人脐静脉内皮细胞的分离培养方法并对细胞特异性抗原进行鉴定,探索提高原代内皮细胞体外培养存活率及纯化率的方法。方法采用一次性无菌注射器向人脐静脉灌注消化液,消化液的浓度和消化时间分别0.25%（质量体积比）胰蛋白酶,10min和0.1%（质量体积比）胶原酶Ⅱ,15min。通过在倒置显微镜下观察细胞的形态特点和用免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定,比较两种消化方法的优劣。结果 0.1%胶原酶Ⅱ,15min的消化方法较0.25%胰蛋白酶,10min对原代人脐静脉内皮细胞有更好的分离效果,活细胞数量多且细胞纯度较高。免疫荧光染色结果表明细胞内有Ⅷ因子相关抗原表达。结论胶原酶Ⅱ可以有效分离脐静脉内皮细胞,最佳消化条件是0.1%胶原酶Ⅱ,37℃,15min。     

RNA干扰内皮细胞分泌白细胞介素6影响平滑肌细胞的迁移

背景：血管支架置入后靶血管部位易发生炎症反应。目的：利用siRNA技术抑制内皮细胞白细胞介素6的生成,观察其对平滑肌细胞迁移的影响。方法：采用RT-PCR测定脂多糖刺激EA.HY926细胞表达白细胞介素6 mRNA的时间梯度与浓度梯度,针对白细胞介素6构建短发卡状siRNA真核表达载体pGensil-1.1-白细胞介素6,通过lipofectamine 2000转染EA.HY926,抑制其白细胞介素6的产生。结果与结论：pGensil-1.1-白细胞介素6转染EA.HY926细胞后,脂多糖刺激下EA.HY926细胞表达的白细胞介素6 mRNA及蛋白明显减少。共培养模型中,转染pGensil-1.1-白细胞介素6的EA.HY926细胞作用下,人脐静脉平滑肌细胞表达的基质金属蛋白酶9 mRNA及蛋白明显降低,结晶紫染色显示人脐静脉平滑肌细胞迁移数量减少。说明siRNA技术可抑制内皮细胞白细胞介素6的生成,并通过降低平滑肌细胞基质金属蛋白酶9的表达减弱平滑肌细胞的迁移能力。     

RNA干扰内皮细胞分泌白细胞介素6影响平滑肌细胞的迁移

背景:血管支架置入后靶血管部位易发生炎症反应。目的:利用siRNA技术抑制内皮细胞白细胞介素6的生成,观察其对平滑肌细胞迁移的影响。方法:采用RT-PCR测定脂多糖刺激EA.HY926细胞表达白细胞介素6 mRNA的时间梯度与浓度梯度,针对白细胞介素6构建短发卡状siRNA真核表达载体pGensil-1.1-白细胞介素6,通过lipofectamine 2000转染EA.HY926,抑制其白细胞介素6的产生。结果与结论:pGensil-1.1-白细胞介素6转染EA.HY926细胞后,脂多糖刺激下EA.HY926细胞表达的白细胞介素6 mRNA及蛋白明显减少。共培养模型中,转染pGensil-1.1-白细胞介素6的EA.HY926细胞作用下,人脐静脉平滑肌细胞表达的基质金属蛋白酶9 mRNA及蛋白明显降低,结晶紫染色显示人脐静脉平滑肌细胞迁移数量减少。说明siRNA技术可抑制内皮细胞白细胞介素6的生成,并通过降低平滑肌细胞基质金属蛋白酶9的表达减弱平滑肌细胞的迁移能力。     

人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术

目的探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离原代培养的方法,并总结对培养的细胞鉴定方法。方法通过胰酶灌注法从人脐带获取内皮细胞进行分离培养,并采用免疫组化法及光镜和透射电镜观察超微结构鉴定所获得的细胞系。结果分离的HUVEC在体外7-10天左右可长成单层,光镜下胞体为单层铺路石状排列。第VⅢ因子相关抗原的检测为阳性。透射电镜下观察培养的内皮细胞胞浆内可见Weibel-Palade小体。结论用胰酶灌注法是获得脐静脉内皮细胞的有效方法。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

人脐静脉内皮细胞体外分离培养的改进及其鉴定

[目的]优化建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外原代及传代培养的方法,并对培养的细胞进行鉴定,为组织工程血管提供种子细胞。[方法]改进的胶原酶Ⅰ型灌注法分离HUVEC,用含胎牛血清及内皮细胞生长因子的RPMI—1640培养基培养,光镜、免疫组化法进行生物学鉴定。[结果]分离的HUVEC体外培养7～10d左右可长成单层,光镜下为多角形,呈铺路石状排列,人第Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测阳性。[结论]改进的胶原酶Ⅰ型灌注法所分离细胞数量多,易成活,且为具有细胞生物学功能的HUVEC。     

外加直流电场对内皮细胞增殖与迁徙的影响

背景:已有研究证明,电刺激可以引起内皮细胞的增殖、趋阴迁徙,同时伴随细胞分泌物释放的增加,从而调节血管张力和血管平滑肌细胞的生长,介导血管收缩和舒张.目的:观察外加直流电场对人脐静脉内皮细胞HY926增殖和迁徙的影响.方法:MTT法检测在外加电压3,5, 8,10 V作用12 h后人脐静脉内皮HY926细胞的增殖情况.并选择内皮细胞增殖最佳的外加电压5 V,在5 V外加电压作用10 h内追踪人脐静脉内皮HY926细胞的运动轨迹,包括细胞的平均累计移行距离和平均移行速率,细胞的平均最终位移大小及其方向,以及所有单个细胞每小时的平均追踪sine值.结果与结论:在外加电压3,5,8,10 V下作用12 h,人脐静脉内皮细胞生长均受到不同程度的抑制,但在外加电压5 V,电场强度163.46 mV/cm时内皮细胞增殖情况最好.在该生理电场下培养72 h,发现细胞生长贴壁生长、增殖正常,初步说明该生物反应器的细胞相容性良好,并且随时间的延长,内皮细胞的平均移行速率呈下降趋势.在5 V外加电压作用10 h后,内皮细胞整体明显持续朝向阴极方向迁徙.提示外加直流电场对人脐静脉内皮细胞增殖有显著的抑制作用,并且可诱导细胞定向向阴极迁徙.     

血管内皮细胞生长因子对人脐静脉间充质干细胞生长增殖的影响

背景:在体外构建组织工程材料的过程中,快速获得足够数量且纯度高的种子细胞极为重要,但目前人脐静脉间充质干细胞原代培养的增殖率仍较低.目的:观察血管内皮细胞生长因子对人脐静脉间充质干细胞原代生长、增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008 03/07在辽宁医学院解剖学实验室完成.材料:正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带20条,由锦州市凌河区妇幼保健院及辽宁医学院附属第一医院提供.方法:采用胶原酶消化法分离人脐静脉间充质干细胞,以1×105L-1的密度接种于24孔培养板,设立2组,实验组加入150 g/L 血管内皮细胞生长因子,对照组不加入任何细胞因子.主要观察指标:观察细胞形态变化,MTT法检测细胞生长曲线,免疫细胞化学法鉴定细胞CD166的表达.结果:接种后6 h细胞开始贴壁,48 h后细胞完全贴壁生长,出现呈椭圆形、多角形的内皮细胞,以及呈梭形的成纤维样细胞,有的形成漩涡状生长集落;原代培养1周后细胞以梭形为主;传代后24 h细胞基本完成贴壁,48 h细胞开始分裂增殖,5～7 d可见多核的成纤维样细胞贴壁,呈长杆状、三角形、梭形等.与对照组比较,实验组细胞生长状态较好,增殖较快,单位时间内获得的细胞数量明显增加(t=2.235,P＜0.05),CD166阳性细胞率显著升高(t=-1.638,P＜0.01).结论:血管内皮细胞生长因子可促进入脐静脉间充质干细胞贴壁,且更有利于间充质干细胞的增殖和纯化.     

胰蛋白酶消化法体外培养和鉴定人脐静脉血管内皮细胞

背景:体外建立稳定可靠的人脐静脉血管内皮细胞模型,目前培养方法缺乏统一的标准。目的:探索脐静脉内皮细胞的体外培养的方法。方法:采用2.5g/L胰蛋白酶和0.02%EDTA消化、分离、体外原代培养及消化传代脐静脉内皮细胞,简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子),当原代培养细胞80%以上汇合,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子进行内皮细胞的鉴定。结果与结论:种植在培养瓶中的内皮细胞2h贴壁生长,24h换液后内皮细胞80%融合,细胞状态好,内皮细胞呈单层铺路石样外观,经过镜下观察和Ⅷ因子相关抗原鉴定证明是脐静脉内皮细胞。证实用胰蛋白酶灌注脐静脉是一种简单、实用的获得人脐静脉血管内皮细胞的方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。     

人脐静脉内皮胞细体外培养及鉴定

目的探索人脐静脉内皮细胞体外培养及鉴定的方法。方法采用0.1%Ⅰ型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,加入含10%胎牛血清及人AB血清的M1640培养基,在37℃,5%CO2孵箱中培养,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果原代培养细胞在接种4 h后开始贴壁生长,5～7 d后融合成单层,倒置相差显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列,有接触抑制现象,免疫组化显示细胞胞浆中人Ⅷ因子相关抗原阳性。结论用胶原酶灌注消化脐静脉是获得内皮细胞的一种可靠的方法,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。     

氯吡格雷对人脐静脉内皮细胞全基因表达谱的影响及生物信息学分析

本研究探讨氯吡格雷对体外培养人脐静脉内皮细胞(EA.hy926)基因表达谱的影响及作用的分子机制。将10μmol/L氯吡格雷与人脐静脉内皮细胞株共培养48 h,运用Affymetrix U133 plus2.0全基因组表达芯片检测氯吡格雷对人脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响,应用分子注释系统MAS3.0软件进行聚类分析,实时定量RT-PCR验证基因表达谱结果。结果表明:氯吡格雷作用内皮细胞48 h后,基因芯片分析筛选出差异表达大于1.5倍的基因508个,其中上调基因139个,下调基因369个,包括蛋白结合、转录因子活性、锌离子结合、DNA依赖的转录的调节、转录、RNA剪接等相关基因,RT-PCR验证结果与基因芯片结果一致。结论:氯吡格雷在基因水平通过多条通路调节内皮功能。     

氯吡格雷羧酸代谢物SR26334对人脐静脉内皮细胞全基因表达谱的影响

本研究探讨氯吡格雷无抗血小板活性的羧酸代谢成分SR26334对体外培养人脐静脉内皮细胞(EA.hy926)基因表达谱的影响及其对内皮细胞作用的分子机制。SR26334 10μmol/L与人脐静脉内皮细胞共培养48h;运用Affymetrix HU133 plus2.0全基因组表达芯片检测氯吡格雷羧酸代谢物对人脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响,用分子注释系统MAS3.0软件进行聚类分析。用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)验证基因表达谱。结果表明:氯吡格雷羧酸代谢物SR26334 10μmol/L作用内皮细胞48 h后,基因芯片分析筛选出差异表达大于1.5倍的基因235个,其中上调基因176个,下调基因59个,包括DNA依赖的转录调节、转录、从RNA聚合酶Ⅱ启动子开始转录的正调节、细胞周期、细胞分割、蛋白氨基酸去磷酸化等相关基因,RT-PCR检测结果与基因芯片结果一致。结论:氯吡格雷羧酸代谢物SR26334在基因水平通过多条通路调节内皮功能。     

组织因子对人脐静脉血管内皮细胞黏附功能的影响

目的:观察组织因子对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞黏附功能的影响。方法:体外培养人脐静脉血管内皮细胞,分别加入不同浓度的组织因子,采用细胞双抗体夹心酶联免疫分析法及ELISA检测血管内皮细胞黏附因子-1(VCAM-1)及可溶性细胞间黏附因子-1(sICAM-1)表达的变化,并用单核细胞黏附率试验检测单核细胞黏附。结果:TF在0～1000pmol/L范围内以剂量依赖方式增强血管内皮细胞VCAM-1和sICAM-1的表达(P<0.01);细胞黏附试验表明TF增加单核细胞黏附率,且黏附率与加入的TF浓度呈正相关,在1000pmol/L时刺激作用最强(P<0.01)。结论:体外情况下TF能上调内皮细胞黏附分子VCAM-1及sICAM-1表达,促进单核细胞黏附,这可能在TF致动脉粥样硬化的病理过程中发挥重要作用。     

人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应因子

背景：外源性刺激引起血管屏障功能损伤的分子机制是血管病理生理学尚未阐明的热点问题之一。目的：探讨炎症递质脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应分子,寻找有效治疗靶点。方法：应用脂多糖刺激并观察人脐静脉内皮细胞骨架蛋白F-actin和细胞单层通透性的改变。应用荧光免疫组化和Westernblot方法检测脂多糖刺激前后细胞中RhoA和SRF等信号分子的改变。并通过阻断实验证实RhoA-SRF信号通路的作用。结果与结论：100μg/L脂多糖刺激6h可引起人脐静脉内皮细胞中F-actin快速重构并形成大量应力纤维,细胞单层通透性明显增强。细胞中活化RhoA的表达明显增加,SRF发生明显的入核转位现象。应用特异性分子抑制剂Y27632抑制RhoA的活化后,细胞中F-actin重构现象消失,细胞单层通透性增加也受到明显抑制,SRF蛋白发生明显的出现转位。而应用LatrunculinB抑制脂多糖刺激的人脐静脉内皮细胞中F-actin应力纤维形成,对抗通透性增加,但RhoA活化未受到干扰,SRF入核现象则受到抑制。提示RhoA-SRF通路的活化介导了脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞中F-actin重构和内皮单层通透性增加,特异性抑制F-actin也可以阻断脂多糖引起的血管内皮单层通透性增加,同时反馈抑制SRF的入核活化现象。     

胰岛素样生长因子Ⅰ抑制氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的体外试验

目的：胰岛素样生长因子Ⅰ作为重要的促细胞生长因子之一，其对内皮细胞凋亡影响的报道不多。实验拟验证和探讨胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用及可能机制。 方法：实验于2006—12／2007—07在华中科技大学同济医学院协和医院心血管疾病研究所完成。①实验材料及分组处理：取人新鲜脐带（产妇或家属签署知情同意书）分离培养人脐静脉内皮细胞，分为：胰岛素样生长因子Ⅰ组（1×10^-9mmol／L）、氧化型低密度脂蛋白（200mg／L）＋胰岛素样生长因子Ⅰ组（1×10^-9mmol／L）、氧化型低密度脂蛋白（200mg／L）组、正常对照组。分别在细胞培养24h后加入。②实验评估：采用四甲基偶氮唑盐法测定细胞活力；DAPI细胞核荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化及细胞凋亡率的测定；并进行内皮细胞caspase-3活性的检测。 结果：①氧化型低密度脂蛋白可明显抑制人脐静脉内皮细胞增殖，胰岛素样生长因子Ⅰ与氧化型低密度脂蛋白共同加入后，细胞增殖率明显上升（P〈0．05）。②氧化型低密度脂蛋白可诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡，而加入胰岛素样生长因子I刺激后细胞凋亡率降低（P〈0．05）。③caspase-3活性检测表明与对照组相比，氧化型低密度脂蛋白能明显上调caspase-3的表达，而胰岛素样生长因子Ⅰ＋氧化型低密度脂蛋白组caspase-3活性则降低（P〈0．05）。 结论：胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡具有抑制作用，可能与其下调caspase-3蛋白表达有关。     

人脐静脉内皮细胞分离鉴定及其膜分子的表达

背景：肿瘤微环境作用于血管内皮细胞,影响其膜表面分子的表达,与肿瘤的生长、转移及免疫逃逸作用相关,但迄今相关机制尚不完全清楚。目的：分析肿瘤微环境下血管内皮细胞的膜表面分子表达量变化。方法：原代分离培养人脐静脉内皮细胞,采用不同肿瘤培养上清,用不同时间进行诱导。记录培养血管内皮细胞形态;利用免疫组织化学方法,鉴别Ⅷ因子相关抗原;荧光实时定量PCR法测定其膜表面分子mRNA表达量。结果与结论：肝癌smmc7721细胞培养上清处理后,内皮细胞抗原提呈会随着时间延长减弱,黏附白细胞能力随着时间延长而变化。胃癌SGC7901细胞培养上清处理后内皮细胞后,抗原提呈能力无明显变化;黏附能力有关分子中,CD31和细胞间黏附分子1表达降低,CD62E表达增高。说明肿瘤微环境可能通过上述黏附分子和抗原提呈分子表达的变化影响血管内皮细胞的相应功能。     

人脐带血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力

背景：目前组织工程心脏瓣膜再内皮化种子细胞主要来源于成熟内皮细胞,内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞越来越受到人们的关注。目的：分离和扩增人脐带血内皮祖细胞,观测其体外生物学特性。方法：密度梯度离心法分离新鲜的脐血中单个核细胞,在含血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的培养液中培养扩增,通过形态学、免疫荧光和流式细胞仪等对贴壁细胞进行鉴定;并与脐静脉内皮细胞进行增殖和迁移能力比较。结果与结论：随着培养和诱导时间延长,贴壁细胞形态发生明显的改变,从小圆形变成梭形,逐渐分化成典型成熟内皮细胞的鹅卵石样形态,并可形成特征性的克隆;体外诱导7d后90%以上贴壁细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性;贴壁细胞流式细胞仪分析显示：培养7d的细胞VEGFR-2、CD34和CD133表达分别占（77.4±4.9）%、（52.4±6.6）%和（19.4±2.1）%,培养28d的细胞VEGFR-2和CD34表达分别占（81.1±7.4）%和（7.6±3.1）%,而未检测到CD133表达;人内皮祖细胞增殖和迁移能力明显高于人脐静脉内皮细胞（P〈0.05）,并且细胞数量可扩增达109L-1。结果显示用密度梯度离心法和贴壁筛选法,可从人脐带血分离、纯化内皮祖细胞;内皮祖细胞可诱导分化为内皮细胞,增殖和迁移能力都很强。     

相对分子质量透明质酸在脐静脉内皮细胞增殖及连接蛋白Ezrin磷酸化表达中的作用研究

目的探讨高相对分子质量透明质酸（nHA）和低相对分子质量透明质酸（oHA）对脐静脉内皮细胞增殖能力及膜-细胞骨架连接蛋白埃兹（Ezrin）表达的影响。方法分别用nHA和oHA处理人脐静脉内皮细胞,以5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测透明质酸（HA）作用后细胞增殖能力;用荧光实时定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白免疫印迹试验（Western blot）检测HA对Ezrin mRNA和蛋白表达的影响。结果与对照组相比,72 h后oHA（10μg/mL）显著促进血管内皮细胞增殖（P〈0.001）,24 h后促进Ezrin基因的表达,48 h后促进Ezrin蛋白磷酸化表达。而nHA（200μg/mL）则抑制血管内皮细胞的增殖（P〈0.01）和Ezrin蛋白的表达磷酸化。结论oHA能有效促进血管内皮的增殖并促进其胞内连接蛋白Ezrin的表达磷酸化,nHA则抑制内皮细胞的增殖和Ezrin蛋白的表达。     

凋亡相关基因在金黄色葡萄球菌感染人脐静脉内皮细胞的表达

目的研究凋亡相关基因Bcl-2、Bax和caspase-3在金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染人脐静脉内皮细胞株ECV-304内的表达,探讨其对人脐静脉内皮细胞的凋亡作用。方法采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹(Western-blot)法检测S.aureus感染后人脐静脉内皮细胞Bcl-2、Bax和caspase-3的mRNA及蛋白表达水平。结果 S.aureus感染人脐静脉内皮细胞后,其细胞内与抗凋亡相关的细胞因子Bcl-2mRNA水平及蛋白表达量下降,感染12小时差异有统计学意义(P0.01),而促凋亡的细胞因子Bax和caspase-3表达上升,感染6小时差异有统计学意义(P0.01)。结论凋亡相关细胞因子Bcl-2、Bax和caspase-3可能在S.aureus感染所致的脐静脉内皮细胞凋亡中起重要的作用。