Genistein调节肝癌HepG2细胞Caspase3蛋白表达诱导凋亡的作用研究

目的探讨三磷酸肌醇（IP3）和Caspase3蛋白表达变化在genistein诱导肝癌细胞凋亡中的作用。方法以肝癌HepG2细胞培养72h为对照组,实验各组以60μmol/L的genistein作用于HepG2细胞不同时间后,应用同位素试剂盒检测细胞IP3含量,Westernblotting分析细胞Caspase3蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果Genistein作用于肝癌HepG2细胞12、24、48、72h,各时相IP3含量显著低于对照组[（12.0±1.4）pmol/10^6cells、（7.5±0.8）pmol/10^6cells、（5.6±0.5）pmol/10^6 cells、（4.3±0.6）pmol/10^6 cellsvs（29.2±0.6）pmol/10^6 cells,P〈0.01];24h后Caspase3蛋白的RI显著高于对照组（2.7±0.2,7.4±0.5,7.4±0.5,30.7±1.6vs0.24±0.06,P〈0.05）;24h后各时相细胞凋亡率为显著高于对照组[（2.7±0.2）%、（7.4±0.5）%、（20.5±2.0）%、（30.7±1.6）%vs（2.6±0.1）%,P〈0.01]。结论Genistein能减少IP3生成,上调Caspase3蛋白表达,诱导肝癌细胞凋亡。     

Fas配体对HepG2细胞凋亡的影响

细胞凋亡 (apoptosis)与肿瘤的发生、增殖与转移有着较为密切的关系 ,而Fas Fas配体 (FasLigand ,FasL)被认为是传导细胞凋亡信号的“死亡信号传递分子”。其中FasL主要存在于免疫活性细胞 ,通过与靶细胞膜Fas结合 ,导致靶细胞凋亡。为研究FasL在肝癌细胞凋亡过程中的作用 ,我们首先采用ELISA法对慢性乙型肝炎、肝硬化与肝癌患者血清中Fas及可溶性FasL(sFasL)水平进行了初步检测 ,结果显示肝癌患者血清中sFas明显升高 ,而FasL的浓度又明显低于慢性肝炎及肝硬化者 ,提示在肝癌的发生中 ,FasL及Fas与肝癌细胞凋亡有重要关系。我们…     

人参皂苷Rh4诱导肝癌细胞HepG2的凋亡及分子机制

目的:探讨人参皂苷Rh4对人肝癌HepG2细胞凋亡的作用及机制。方法:采用MTT比色法测定不同浓度(10、20和40μmol/L)人参皂苷Rh4对人肝癌HepG2细胞活力的抑制作用;用流式细胞术检测定细胞凋亡率;通过Hoechst 33258和TUNEL染色观察人参皂苷Rh4诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的形态学变化;Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9的表达情况。结果:人参皂苷Rh4能够明显促进人肝癌HepG2细胞的凋亡,且呈剂量依赖性;TUNEL和Hoechst 33258染色实验结果表明,人参皂苷Rh4作用24 h后,细胞呈现明显皱缩、肿胀、破裂等凋亡形态;Western blot分析结果表明,随着人参皂苷Rh4给药浓度的增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达量逐渐下降,而促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3和caspase-9的表达逐渐升高。结论:人参皂苷Rh4可诱导人肝癌HepG2细胞凋亡,其作用机制可能与下调Bcl-2以及上调Bax、cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表达有关。     

bax过表达对乙醇诱导的肝癌细胞凋亡的促进作用

目的探讨促凋亡基因bax过表达对乙醇诱导的原发性肝细胞癌(简称肝癌)细胞凋亡的调节作用。方法用脂质体介导的基因转染法将含有人bax cDNA的噬菌粒表达载体pBK-bax质粒导入人肝癌细胞系HCC-9204细胞中,同时设转染pBK-CMV空载体的和未转染的HCC-9204细胞对照。通过用G-418筛选后获得转入目的基因的细胞克隆。用免疫细胞化学ABC法、图像定量分析和Westert blot法检测bax蛋白在转染bax或空载体前后细胞中的表达情况。用6%乙醇分别作用于上述细胞6h后,MTT法检测细胞杀伤率,TUNEL染色法和流式细胞仪DNA含量分析法检测细胞凋亡的发生程度。结果转染后用G-418持续筛选2周,获得了导入bax或空载体的G-418抗性的细胞克隆。转染bax基因的细胞对bax蛋白的表达强度明显强于转染空载体或未转染的细胞,而转染空载体与未转染细胞的bax蛋白表达强度无明显差异。经低浓度乙醇作用后,转染bax的肝癌细胞的细胞杀伤率、TUNEL指数和亚二倍体凋亡峰比例均明显高于转染空载体或未转染的细胞。结论bax蛋白过表达能够促进低浓度乙醇诱导的肝癌HCC-9204细胞凋亡。     

细胞凋亡基因Fas的研究进展

细胞凋亡的研究方兴未艾，日益引起人们的关注。本文扼要介绍了细胞凋亡相关基因Ｆａｓ的基因结构，表达调控，信号传导在细胞凋亡中的作用及与某些人类重大疾病的关系。     

Bcl-2过表达抑制乙醇诱导的HCC-9204肝癌细胞凋亡

目的探讨凋亡相关基因bcl-2过表达对乙醇诱导的肝细胞癌(HCC)细胞凋亡的影响.方法将含有人bcl-2cDNA的逆转录病毒表达载体pDOR-SB质粒转染到不表达bcl-2蛋白的人肝癌细胞系HCC-9204细胞中,用免疫组织化学ABC法检测bcl-2蛋白的表达情况.连续克隆化直至获得100%表达bcl-2蛋白的单克隆细胞株,并进行流式细胞术检测.用6%乙醇分别作用于上述细胞6h后,用MTT法和TUNEL法和流式细胞仪检测细胞凋亡发生程度.结果转染pDOR-SB的细胞大部分为bcl-2蛋白表达阳性,而转染pDOR空载体或未转染的HCC-9204细胞均为bcl-2蛋白阴性.连续3次克隆化后,流式细胞检测表明所获得的单克隆细胞株100%稳定表达bcl-2蛋白,命名为HCC-bcl-2.6%乙醇作用后,HCC-bcl-2细胞和未转染的HCC-9204细胞经MTT法检测的吸光度值分别为0.519±0.053和0.366±0.046,前者明显高于后者(P<0.01);TUNEL指数分别为0.387和0.613,亚二倍体凋亡峰比例分别为3.8%和10.7%,前者均明显低于后者(P<0.05).结论bcl-2蛋白过表达能够抑制乙醇诱导的HCC-9204肝癌细胞凋亡.     

Nodosin通过Apaf-1和caspase-3诱导HepG2细胞凋亡

目的:研究传统中药提取物nodosin对人肝细胞癌Hep G2细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:将nodosin设置为1. 25μmol/L、2. 5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L不同浓度组,作用于Hep G2细胞24 h后,用Hoechst 33258染色和电镜观察不同浓度的药物对细胞形态学的影响,用流式细胞术检测细胞凋亡率,用RT-qPCR检测凋亡蛋白酶激活因子1 (Apaf-1) mRNA的表达,用Western blot检测caspase-3及其前体和活化体的蛋白水平。结果:形态学结果显示,随着用药剂量的增加,细胞皱缩和细胞核偏移越明显,凋亡小体在5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L剂量组明显增多。Apaf-1 mRNA的表达增加,caspase-3及其前体的表达和cleaved caspase-3的蛋白水平随着用药剂量的增加逐渐增加(P 0. 01)。结论:Nodosin能够诱导Hep G2细胞凋亡。该作用可能是通过增加Apaf-1 mRNA的表达继之激活caspase-3实现的。     

Fas、细胞凋亡与自身免疫病

本文综述近年来通过对细胞凋亡的基础研究，两种小鼠自身免疫病模型ｌｐｒ和ｇｌｄ系Ｆａｓ基因和ＦａｓＬ基因改变所致的研究现状。     

乙醇诱导肝癌细胞凋亡及其单克隆抗体的制备

目的：探讨原发性肝细胞癌（简称肝癌）细胞凋亡过程中相关分子的表达情况,制备抗肝癌凋亡细胞相关抗原的单克隆抗体（mAb)。方法：用含6％乙醇的培养液培养肝癌细胞系HCC－9204细胞6h诱导其凋亡,透射电镜观察细胞形态变化,TUNEL法检测细胞DNA片段化发生情况,流式细胞仪分析细胞DNA含量变化。环磷酰胺消减免疫法免疫小鼠。杂交瘤法制备抗凋亡细胞的mAb。ELISA法筛选在凋亡细胞高表达,而在非凋亡细胞低表达的mAb。有限稀释法连续克隆化。用免疫细胞化学ABC法进一步筛选和分析,并进行杂交瘤细胞染色体和免疫球蛋白（Ig)类型分析。结果：6％乙醇作用HCC－9204细胞6h后,可见明显的凋亡形态学变化,大部分细胞为TUNEL染色阳性,并且流式细胞仪检测可见亚二倍体凋亡峰。经连续克隆化筛选出1株在乙醇诱导凋亡的HCC－9204细胞的胞核高表达,而在未经诱导凋亡的HCC9－9204细胞低表达的mAb。染色体分析结果符合mAb杂交瘤细胞特征,其Ig类型为IgG1。结论：低浓度乙醇诱导凋亡的HCC－9204肝癌细胞中有某些相关分子的表达升高。初步获得了1株可能是抗乙醇诱导的肝癌细胞凋亡相关抗原的mAb。     

几种免疫分子对Fas介导细胞凋亡的调节

Fas/ APO- 1介导的细胞凋亡在免疫自稳、免疫调控、免疫逃逸、免疫赦免等各个免疫生理、病理过程中均发挥着至关重要的作用 ,它可使免疫细胞的活化增殖和机体的免疫应答维持在一定的限度 ,从而避免发生过度免疫反应损伤机体 ,使机体的免疫系统处于一平衡状态。免疫分子 ,凋亡基因及抗凋亡基因表达的蛋白 ,以及多种药物均可调节 Fas介导的细胞凋亡。本文主要对几种免疫分子对 Fas介导细胞凋亡的调节机制的研究进展做一论述。     

Genistein下调肝癌细胞survivin基因表达和诱导细胞凋亡的实验研究

目的： 探讨三磷酸肌醇(IP3)和survivin蛋白表达变化在genistein诱导肝癌细胞凋亡中的作用。 方法： 以肝癌HepG2细胞培养72 h为对照组，实验各组以60 μmol/L的genistein作用于HepG2细胞不同时间后，应用同位素试剂盒检测细胞IP3含量，Western blotting分析细胞survivin蛋白表达，流式细胞仪检测细胞凋亡率。 结果： 对照组IP3含量为(29.2±0.6) pmol/106cells， survivin蛋白与内参β-actin蛋白灰度和面积之积的比值V-survivin/ V-β-actin为0.63±0.06；细胞凋亡率为（2.6±0.1）%。Genistein作用于肝癌HepG2细胞12 h、24 h、48 h、72 h后IP3分别为（12.0±1.4）pmol/106cells、（7.5±0.8）pmol/106cells、（5.6±0.5）pmol/106cells、（3.3±0.6）pmol/106cells，与对照组(29.2±0.6)pmol/106cells比，P＜0.01。V-survivin/ V-β-actin分别为0.36±0.13、0.33±0.03、0.23±0.04、0.18±0.04，与对照组(0.63±0.06)比，P＜0.01。细胞凋亡率分别为（2.7±0.2）%、（7.4±0.5）%、（20.5±2.0）%、（30.7±1.6）%，与对照组(2.6±0.1)%比，P＜0.01。 结论： Genistein能减少IP3生成，下调survivin基因表达，诱导肝癌细胞凋亡。     

槲皮素诱导MCF-7细胞凋亡及其与Fas/FasL通路的相关性研究

目的:了解槲皮素诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用及其与Fas/Fas L通路的相关性。方法:建立槲皮素诱导的MCF-7细胞凋亡模型。采用透射电镜观察细胞核形态变化,Annexin V-FITC/PI和JC-1荧光标记流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位(Δψm)及Fas L中和抗体对细胞凋亡的阻断作用。采用免疫荧光法和流式细胞术检测细胞Fas/Fas L的表达。流式细胞术观察p38 MAPK抑制剂SB203580对细胞Fas/Fas L表达的影响。Western blot检测p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白水平的变化。结果:80.0μmol/L槲皮素处理MCF-7细胞48h,透射电镜可见染色质浓缩及边缘化现象;处理24 h、48 h和72 h,Δψm分别下降17.4%、44.3%和68.9%,细胞凋亡率分别为(10.2±3.3)%、(28.9±7.5)%和(39.2±8.9)%。Fas L中和抗体预处理细胞后,24 h、48 h和72 h的细胞凋亡率则分别为(8.2±2.8)%、(19.2±5.3)%和(22.5±6.9)%,细胞凋亡阻断率分别为19.6%、33.6%和42.6%。Fas/Fas L表达率随处理时间增加而升高,SB203580可显著抑制细胞Fas/Fas L的表达率。p38 MAPK的蛋白水平变化不大,而p-p38 MAPK的蛋白水平在48 h和72 h显著增高。结论:槲皮素可上调MCF-7细胞的Fas/Fas L表达,并经膜Fas/Fas L途径诱导MCF-7细胞凋亡,p-p38 MAPK可能是上调Fas/Fas L表达的重要信号分子。     

CD4 engagement induces Fas antigen-dependent apoptosis of T cells in vivo

CD4 is a T lymphocyte receptor for major histocompatibility complex class II antigens. It is referred to as coreceptor because it synergizes with the T cell receptor for antigen when both receptors become engaged simultaneously. We show here in mice that when engaged by antibody independently of the T cell antigen receptor, CD4 induces T cells to undergo apoptosis. Several features of this process were identified. The expression of an intact Fas protein is a requirement for CD4-mediated T cell death. Mice homozygous for the lpr mutation which are defective in the expression of Fas and in their ability to delete lymphocytes apoptotically fail to delete anti-CD4-reactive T cells. Sessile anti-CD4-reactive T cells leave their homing environment in lymphoid organs and modulate their cell surface molecules, e.g. CD2, CD3, CD4. A massive influx of lymphoid cells with null-cell phenotype occurs in the blood where they begin to reexpress cell surface markers. With their arrival in the circulation, anti-CD4-reactive T cells develop features of DNA degradation typical of apoptosis. More than one third of the circulating lymphoid cells show apoptotic features 7–8 h after anti-CD4 injection. Their frequency declines subsequently presumably due to their physical disintegration via shedding of apoptotic bodies and phagocytosis. Our data show that when not obliged to the activation process by the antigen receptor, CD4 can mediate deletion signals. Thus, besides functioning as coreceptor with the antigen receptor, CD4 has a function of its own in facilitating the induction of apoptosis.     

肝细胞癌中DcR3表达与癌细胞凋亡的关系研究

目的探讨诱捕受体3（decoy receptor 3,DcR3）蛋白在原发性肝细胞癌（HCC）中的表达及其与癌细胞凋亡和HCC预后的关系。方法应用免疫组织化学（EnVision法）及和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）技术检测43例HCC,16例非癌肝组织（单纯性肝硬化及肝血管瘤周围正常肝组织）中DcR3蛋白的表达及凋亡情况,并分析其与临床病理参数的关系。结果DcR3明确定位于肝细胞胞质内;HCC组织中的DcR3蛋白的阳性率为74．42％（32／43）,明显高于非癌肝组织43．75％（7／16,P〈0．05）;HCC中有转移癌组DcR3阳性率为100％（22／22）,明显高于无转移组52．94％（9／17,P〈0．01）;DcR3蛋白的表达与AFP水平（r=0．444,P〈0．01）、门静脉癌栓（r=0．414,P〈0．01）有关,与年龄、性别、有无肝硬化、包膜浸润、肿瘤结节数及分化程度无关（P〉0．05）。HCC中细胞凋亡指数[AI（0．78±0．64）％]明显低于非癌肝组织[（3．32±1,81）％,P〈0．01];HCC临床TNM分期Ⅰ、Ⅱ期AI（1．03±0．69）％高于Ⅲ、Ⅳ期[（0．52±0．48）％,P〈0．01];HCC无转移组AI（1．10±0．72）％高于转移组[（0．44±0．27）％,P〈0．01];AI与AFP水平（r=-0．468,P〈0．01）、门静脉癌栓（r=-0．434,P〈0．01）、包膜浸润（r=-0,331,P〈0．05）有关,与年龄、性别、有无肝硬化、肿瘤结节数及分化程度无关（P〉0．05）。在HCC和非癌肝组织中,DcR3阳性者的AI均分别低于阴性者的AI（均P〈0．01）。结论DcR3表达可影响凋亡并在HCC的发生发展中起重要作用;检测DcR3蛋白与AI有助于判断HCC患者预后。     

白藜芦醇对Hela细胞凋亡及Bcl-2和Fax基因表达的影响

目的观察白藜芦醇对人宫颈癌Hela细胞凋亡及Bcl-2、Fax基因表达的影响。方法实验设白藜芦醇用药组和空白对照组,应用流式细胞术检测药物作用24h后细胞凋亡和细胞周期进程情况;应用免疫组化法检测Heal细胞Bcl-2、Fax基因的表达情况。结果经不同浓度的白藜芦醇处理Heal细胞后,镜下可见到凋亡细胞,各组的凋亡率明显高于对照组(P0.01)。PCM分析发现各实验组S期细胞比例增高,G2/M期细胞比例减少,并呈剂量依赖性(P0.01);各实验组Heal细胞Bcl-2的表达均低于对照组。而Fax的表达均高于对照组(P0.01)。结论白藜芦醇对人宫颈癌Hela细胞有明显的抑制生长和促凋亡作用,凋亡途径可能与Fas表达上调、Bel-2表达下调有关。     

miR-363下调HepG2细胞Mcl-1蛋白的表达并诱导其凋亡

目的:探讨微小RNA-363(microRNA-363,miR-363)的作用靶点及其对Hep G2细胞的抑制作用。方法:通过生物信息学分析预测Mcl-1基因是否受microRNA调控。实时荧光定量PCR检测正常肝细胞系LO2及肝癌细胞系Hep G2、Huh7、PLC的miR-363和Mcl-1的表达水平。将miR-363转染人Hep G2细胞,检测miR-363对Mcl-1表达水平的影响。MTT法检测Hep G2细胞在转染miR-363后的相对细胞活力,Annexin V/PI染色法检测miR-363转染对Hep G2细胞凋亡的影响。结果:Mcl-1 mRNA 3’-非翻译区(3’-UTR)存在miR-363的假定结合位点,在肝癌细胞中转染miR-363后Mcl-1的表达下降。转染miR-363可抑制Hep G2细胞的活力并诱导其发生凋亡。结论:miR-363过表达可显著抑制Hep G2细胞的活力并诱导其发生凋亡,其机制可能与miR-363能下调Hep G2细胞Mcl-1蛋白的表达有关。     

Manumycin induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells

Farnesyltransferase inhibitors (FTIs) were developed to prevent Ras processing and thus to be effective agents for the treatment of cancers harbouring mutated ras. In the present study, HepG2 cells underwent internucleosomal DNA fragmentation after treatment with farnesyltransferase inhibitor manumycin (20 microM) for 12 h. Flow cytometric analysis showed that HepG2 cells were accumulated in the G2/M phase of the cell cycle and the number of apoptotic sub-G1 fraction of cells was increased after treatment with manumycin in a time-dependent manner. During the induction of apoptosis, expression of p53 and p21WAF1 was upregulated, phosphorylation of IkappaB-alpha was blocked, caspase substrates poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) and lamin B were cleaved, and Bcl-2 and Bax protein expression remained unchanged. These results indicated that manumycin induced apoptosis in HepG2 cells. The induction of apoptosis by manumycin involved the upregulation of p53 and p21WAF1, the activation of caspases, and the inhibition of nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) pathway. However, Bcl-2 and Bax are not associated with manumycin-mediated apoptosis.     

青蒿琥酯通过增加活性氧簇生成诱导人肝癌HepG2细胞凋亡

目的:探讨青蒿琥酯诱导人肝癌Hep G2细胞凋亡的机制及活性氧簇(ROS)在青蒿琥酯诱导Hep G2细胞凋亡中的作用。方法:采用MTT法观查青蒿琥酯对人肝癌Hep G2细胞存活的影响,Hoechst 33258荧光染色法观察细胞凋亡形态的变化,流式细胞术检测Hep G2细胞的凋亡率,DCFH-DA检测细胞凋亡过程中ROS的变化。Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和细胞色素C(Cyt C)蛋白水平的变化。采用NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素(apocynin)预处理Hep G2细胞,Western blot检测NADPH氧化酶亚基p47~(phox)和p22~(phox)蛋白表达水平,流式细胞术检测ROS变化。结果:与对照组相比,青蒿琥酯作用于Hep G2细胞24 h后,细胞存活率明显减少(P0.05);细胞核呈致密浓染色,细胞凋亡比例升高(P0.05);ROS明显升高(P0.05);Western blot结果显示,青蒿琥酯作用后细胞内Bcl-2蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调,Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高,cleaved caspase-3和Cyt C蛋白水平升高。Apocynin预处理能降低青蒿琥酯给药组细胞内p47~(phox)和p22~(phox)蛋白表达及ROS的生成。结论:青蒿琥酯能诱导Hep G2细胞凋亡,其凋亡过程可能与ROS的生成增加相关。     

槲皮素通过抑制c-Jun的表达水平增强5-氟尿嘧啶对胃癌细胞凋亡的诱导活性

目的:探讨槲皮素是否能增强5-氟尿嘧啶对胃癌细胞凋亡的诱导活性并研究其机制。方法:MTT法检测5-氟尿嘧啶在槲皮素辅助治疗下对胃癌细胞系BGC-823的杀伤活性和半抑制浓度(IC50)。免疫共沉淀和Western blot实验检测5-氟尿嘧啶和槲皮素对BGC-823细胞c-Jun和Bcl-x L的表达水平、c-Jun磷酸化水平、caspase-9和caspase-3活化水平以及细胞色素C释放的影响。流式细胞术检测5-氟尿嘧啶在槲皮素辅助下对BGC-823细胞凋亡的影响。结果:槲皮素能明显提高5-氟尿嘧啶对BGC-823细胞的杀伤活性,降低5-氟尿嘧啶对BGC-823细胞的IC50。槲皮素处理明显抑制BGC-823细胞c-Jun的表达,并抑制BGC-823细胞中5-氟尿嘧啶诱导的c-Jun磷酸化及其与ATF2蛋白的相互作用,进而抑制5-氟尿嘧啶诱导的Bcl-x L蛋白上调。转染c-Jun过表达质粒后,槲皮素联合5-氟尿嘧啶对BGC-823细胞的杀伤活性受到显著抑制。同时,槲皮素能显著增强BGC-823细胞中5-氟尿嘧啶诱导的细胞色素C从线粒体中释放和caspase依赖的凋亡。结论:槲皮素可通过c-Jun/ATF2/Bcl-x L途径增强5-氟尿嘧啶对胃癌细胞线粒体途径凋亡的诱导活性。