肝细胞生长因子基因转染促进伤口愈合及预防瘢痕形成的实验研究

肝细胞生长因子 (HGF)是一多功能的生长因子 ,不仅刺激皮肤微血管内皮细胞增殖、运动 ,而且可促进皮肤角质细胞的迁移运动[1] 。另外 ,HGF能够明显地抑制肝纤维性组织中转化生长因子 -β(TGF - β)的产生和增强胶原酶的活性[2 ] 。这也提示 ,应用外源性HGF可能会促进伤口愈合 ,抑制胶原的合成和沉积。但直接应用HGF蛋白受到许多限制。为研究人HGF基因预防病理性瘢痕的可行性 ,笔者构建了携带人HGF基因的重组质粒 (pUDKH) ,以新西兰兔耳瘢痕为模型 ,探索其促进伤口愈合、预防创伤愈合过程中瘢痕过度形成的作用。一、材料与方法1.模…     

肝细胞生长因子对人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的观察肝细胞生长因子(HGF)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HKC)转分化的影响。方法将体外培养的HKC分为正常组、TGF-β1组、HGF组、TGF-β1 HGF组、延迟加入HGF组。应用间接免疫荧光技术观察HKC中α-SMA蛋白、E-cadherin的表达。用RT-PCR技术检测细胞中α-SMA mRNA的表达。结果免疫荧光技术显示,TGF-β1能诱导HKC表达α-SMA蛋白,减少E-cadhefin表达;同时加入HGF能减少α-SMA蛋白表达,而延迟加入HGF能使部分转分化的HKC细胞恢复E-cadherin的表达。RT-PCR结果显示,正常组无α-SMA mRNA表达,TGF-β1可诱导HKC表达α-SMA mRNA;同时加入HGF后α-SMA mRNA基本无表达,而延迟加入HGF后α-SMA mRNA表达明显下降。结论TGF-β1可诱导肾小管上皮细胞转分化,而HGF能抑制TGF-β1诱导的转分化,延迟加入HGF能使部分发生转分化的肾小管细胞恢复上皮表型。     

HGF和FGF4在诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的作用

目的 评估肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子4(FGF4)在诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的作用.方法 CCl_4经腹腔注射复制小鼠肝损伤模型,48h后处死小鼠取肝组织,分离肝脏组织制备肝损伤条件培养液进行培养.以正常小鼠肝组织制备的培养液作为对照组.ELISA法测定培养0、1、5、3、6、12、24、48h后肝组织培养液中的HGF和FGF4含量.用肝损伤条件培养液培养骨髓间充质干细胞,分别加入HGF抗体和(或)FGF4抗体,以封闭培养液中的HGF和(或)FGF4因子,未添加细胞因子抗体的培养液作为对照组;ELISA法检测肝细胞特异性白蛋白(ALB)水平,免疫荧光法检测细胞内ALB、甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白19(CK19)的表达,评价骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化状况.结果 与对照组比较,肝损伤小鼠肝细胞培养液中HGF和FGF4表达量均升高(P<0.05);在培养3h时HGF、FGF4上升达峰值,随后下降;FGF4在培养12h达低谷后再次升高.抑制HGF和(或)FGF4第14天后,ELISA和荧光标记染色法检测均显示ALB表达下降,与对照组比较差异显著(P<0.05);荧光标记染色显示封闭后AFP及CK-19表达均有下降(P<0.05).结论 HGF、FGF4是诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的重要因子,且可能有其他因子参与诱导肝细胞的定向分化.     

外源性肝细胞生长因子对肝癌细胞p16基因表达水平影响

目的 探讨外源性肝细胞生长因子(HGF)能否调控肝癌细胞HEPG2 p16基因的表达水平.方法 以人肝癌细胞株HepG2为研究对象,根据培养基中HGF的浓度不同,实验分组为:对照组、实验1组和实验2组,采用流式细胞仪(FCM)检测HGF的肝癌细胞生长周期;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测HGF对肝癌细胞p16基因表达的影响.结果 HepG2细胞在10 pg/L和50 μg/L HGF的作用下,细胞周期出现明显改变,其中G0/G1期细胞明显多于对照组,而S期细胞减少.经HGF作用后肝癌细胞的p16基因表达上调.结论 HGF通过上调p16表达阻滞细胞分裂于G0/G1期,可能为其抑制人肝癌细胞HepG2的生长作用的重要机制之一.     

急性轻型病毒性肝炎肝组织Fas和Fas配体的表达

细胞凋亡是病毒性肝炎肝细胞损伤的重要方式之一[1].近年来研究显示,Fas和Fas配体(FasL)是介导细胞凋亡的重要细胞表面分子[2、3].鉴于急性病毒性肝炎(AH)中对Fas和FasL表达报道尚缺,本文对20例AH活检肝组织进行观察,并与10例慢性肝炎(CH)作比较,旨在探讨Fas和FasL的表达在AH肝细胞凋亡中的意义.     

肝细胞生长因子诱导小鼠胚胎干细胞分化的实验研究

目的探讨肝细胞生长因子（HGF）诱导小鼠胚胎干细胞（ESC）体外定向分化为肝细胞的能力。方法对ESC体外悬浮培养5～7天形成的拟胚体,观察ESC自主分化、HGF诱导分化的情况。观察和检测经诱导4周的细胞的HE染色,糖原染色,尿素氮及甘油三酯合成,心肌MHC、白蛋白、AFP、CK18的表达,以及吲哚氰绿（ICG）染色情况。结果ESC自主分化难以控制。HGF可促进ESC向内胚层进一步分化,但更可能诱导其向心肌分化。表达白蛋白、AFP、CK18、ICG和FDA染色阳性。结论HGF可诱导ESC分化出肝细胞,但HGF的单一作用能力有限,提示肝细胞的诱导分化可能需要多种因素共同作用。     

肝细胞生长因子与表皮细胞生长因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞

目的探讨肝细胞生长因子（HGF）与表皮细胞生长因子（EGF）联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为类肝细胞的可行性。方法取大鼠股骨骨髓,用直接贴壁法分离纯化Mats并体外传代,实验组用HGF（20mg／m1）＋EGF（10mg／m1）对体外培养的Mscs进行诱导分化。细胞免疫化学法及流式细胞仪对培养的MSCS进行鉴定。RT-PCR检测诱导后慨的AFP、AIb、CK-18的mRNA表达。电镜观察诱导细胞的超微结构。结果贴壁的MSCs单个存在或形成克隆,细胞形态比较均一,为长梭形,7～10天达汇合。免疫细胞化学及流式细胞仪均证明培养的细胞为MSCs。实验组MSCS在培养21天时表现为类肝细胞的形态特点。RT-PCR：AFP mRNA在第7天呈阳性表达,AIb mRNA及CK-18 mRNA开始即有表达,21天增强。电镜观察见诱导21天的Mats形态结构与肝细胞相吻合。结论Mats在体外容易分离培养和扩增,HGF＋EGF可诱导MSCs向类肝细胞分化,为细胞移植治疗肝衰竭提供新的探索思路。     

MARCH1:一种新的树突细胞功能调控者

近期研究发现树突细胞(DCs)表面MHC-Ⅱ类分子的含量是通过MHC-Ⅱ类分子β链的泛素化水平来调控的[1],而MARCH1,一种E3泛素连接酶,在这一过程中起关键性的作用.但目前MARCH1在体内如何调控MHC-Ⅱ类分子的表达尚不清楚.研究表明,许多生理学上重要的受体都是细胞表面跨膜蛋白,与相应的配体发生作用后表达下调以避免对细胞的过度刺激.在很多情况下,表达的下调是通过受体的降解来完成的.表皮生长因子(EGF)受体即为其中的一种,研究发现泛素化是该受体降解过程中一种重要的蛋白修饰方式,E3泛素连接酶c-Cbl被认为是EGF受体泛素化的关键酶[2 3].近年来有学者证实泛素化对于免疫应答相关膜蛋白的稳态具有重要作用,许多生物学作用过程中涉及的膜蛋白均受泛素化调控[4 7].     

干细胞分子影像标记示踪技术现状

干细胞具有自我更新和多向分化潜能,能分化成神经细胞、心肌细胞、胰岛细胞、成骨细胞、肝细胞和造血祖细胞等,是细胞治疗的理想资源[1].例如,神经干细胞能向受损脑组织迁移,分化成神经元和神经胶质细胞,且基因修饰后能表达治疗性分子;移植骨髓间充质干细胞、血管内皮祖细胞和胚胎干细胞能改善缺血损伤心脏功能[2].细胞分子影像技术能在活体状态下对移植干细胞进行纵向研究,示踪细胞迁移,评价治疗效果,帮助优化细胞应用和选择合适治疗窗口[3].     

大鼠肝干细胞体外诱导分化的实验研究

目的 分离成体大鼠肝干细胞,观察体外培养条件下肝干细胞分化为肝细胞和胆管细胞的过程以及形态学变化.方法 采用AAF/PH肝干细胞刺激模型,通过胶原酶Ⅳ分步消化分离和Percoll梯度离心纯化的方法得到肝干细胞,联合应用地塞米松、DMSO和EGF、HGF、SCF等生长因子诱导肝干细胞增殖并分化为肝实质细胞.结果 分离得到的肝干细胞呈卵圆型,直径是肝细胞的1/4～1/6,免疫荧光检测显示其表达c-kit和OV6两种干细胞抗原,PCR分析显示其表达CK19和白蛋白mRNA.体外诱导培养条件下细胞首先分化成大而圆的成熟肝细胞,继而出现分支样的胆管细胞,而且可见从卵圆形细胞到成熟肝细胞的中间变化过程.结论 新分离的肝干细胞同时表达c-kit、OV6、CK19和白蛋白多种抗原,诱导分化条件下可见从体积较小的卵圆形肝干细胞到体积大许多倍的肝细胞的形态学变化过程.     

肝细胞生长因子对心肌细胞及血管平滑肌细胞、血管内皮细胞生长因子分泌的作用

观察肝细胞生长因子(HGF)对体外培养的牛冠状动脉血管内皮细胞 (BCAEC)、牛冠状动脉血管平滑肌细胞 (BCASMC)和小鼠心肌细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)分泌的影响。BCAEC对照组与HGF组 12hVEGF浓度分别为 10 5 1± 2 90和 9 31± 2 78pg/ml;BCASMC对照组和HGF组 12hVEGF浓度分别为 3h的 3 35倍和 3 93倍 ,HGF组 3h和 12hVEGF浓度分别为对照组的 2 0 6倍和 2 4 2倍 ;心肌细胞对照组和HGF组 12hVEGF浓度分别为 3h的 5 4 3倍和 4 0 9倍 ,HGF组 3h和 12hVEGF浓度分别为对照组的 2 74倍和 2 0 6倍。提示BCAEC、BCASMC及小鼠心肌细胞均具有自分泌VEGF的作用 ,HGF促进BCASMC和心肌细胞VEGF的分泌 ,对BCAEC无影响     

人HGF基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的构建和鉴定

目的 :构建携带肝细胞生长因子 (HGF)的逆转录病毒载体 ,并建立高效、稳定生产HGF的包装细胞株。方法 :以pcDNA3.0 HGF质粒为模板进行PCR反应扩增出HGF基因全长序列 ,亚克隆至逆转录病毒载体pMSCVneo构建重组逆转录病毒质粒 ,以脂质体介导转染包装细胞PT6 7,经G4 18筛选 ,进而挑选抗性集落扩大培养后 ,用靶细胞NIH3T3测定病毒滴度 ,筛选出高效产毒细胞株。扩大培养后进行RT PCR鉴定HGFmRNA的表达。扩大培养NIH3T3细胞抗性集落 (NIH3T3/HGF) ,并用细胞培养上清进行人肝癌细胞系HepG2的扩散试验。结果 :PCR反应扩增出 2 2 0 0bp的HGF基因 ,构建了重组逆转录病毒表达载体pMSCV HGF ,测序鉴定正确。经脂质体介导转染包装细胞、G4 18筛选和NIH3T3测定病毒滴度 ,筛选出具有最高病毒滴度 (8.8× 10 7cfu /ml)的细胞集落 ,扩大培养后建立高效表达HGF的包装细胞株PT/HGF ,RT PCR证实HGF基因在PT/HGF中有转录。NIH3T3/HGF培养上清可使HepG2细胞扩散 ,形态改变。结论 :成功构建了携带HGF的逆转录病毒载体pMSCV HGF ,并建立了稳定、高效生产有活性的HGF的产毒细胞株PT/HGF。     

骨形成蛋白家族成员2、7对小鼠胚胎肝干细胞分化的体外研究

目的 探讨骨形成蛋白2、7(BMP2、BMP7)对小鼠胚胎肝干细胞(HP14.5)定向诱导分化为肝细胞样细胞的影响.方法 将表达BMP2、BMP7、肝细胞生长因子(HGF)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒作为4个组分别感染HP14.5,诱导其分化,在病毒感染后的第1、4、7天通过检测荧光素酶报告基因读数,在第7天通过细胞免疫荧光染色,观察肝细胞标志物白蛋白(ALB)的表达情况;并在第4、7、10天通过PAS染色、尿素氮合成功能检测,观察诱导后HP14.5向肝细胞方向的分化成熟度.结果 BMP2组、HGF组荧光素酶读数较GFP对照组明显上升;免疫荧光染色显示,诱导7d后BMP2组、HGF组细胞质内表达肝细胞特有的ALB,而GFP对照组几乎无表达;糖原染色可见BMP2组、HGF组胞质存在紫红色颗粒,呈阳性反应;尿素合成功能检测显示BMP2组、HGF组培养液中尿素氮随时间而升高.BMP7组诱导后,细胞免疫荧光染色、荧光素酶活性、PAS染色和尿素合成检测均呈阴性或弱阳性反应.结论 BMP2具有一定的诱导HP14.5向成熟肝细胞分化的作用,并初步具备肝细胞的合成分泌功能,而BMP7对其无诱导作用.     

脐带间充质干细胞对肝星状细胞活化、凋亡的调控作用研究

目的观察人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)对肝星状细胞LX-2活化和凋亡的影响,并分析其可能机制。方法体外分离、培养人UC-MSCs,将UC-MSCs与LX-2细胞按1:1和3:1比例进行混合共培养或Transwell共培养。通过流式细胞仪检测UC-MSCs对LX-2细胞活化、凋亡的影响。结果 HE、油红O、碱性磷酸酶染色及表型检测证实本实验所用UC-MSCs符合MSCs标准。LX-2细胞单独培养及与UC-MSCs混合共培养或Transwell共培养情况下,表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的LX-2细胞比例分别为52.7%,43.9%(1:1)和34.2%(3:1),50.9%(1:1)和31.2%(3:1)。肝细胞生长因子(HGF)阻断实验未逆转UC-MSCs对LX-2细胞活化的抑制作用。与单独培养比较,LX-2细胞与UC-MSCs以1:1和1:3比例在Transwell共培养情况下,表达Annexin V单阳性的LX-2细胞比例由7.1%增加至14.9%和12.8%(P<0.01)。结论人UCMSCs可以抑制肝星状细胞系的活化并促进其凋亡,其抑制活化和促进凋亡不直接依赖于细胞间的相互接触,而是以细胞因子分泌的方式发生。     

c-Met及HGF在胃癌及其肝转移灶中的表达

目的:探讨胃癌肝细胞生长因子受体(c-Met)及肝细胞生长因子(HGF)表达与胃癌肝转移间的相关性。方法:晚期胃癌标本59例,其中11例同时有取自左肝外叶的肝转移标本,应用免疫组化方法对上述组织石蜡标本进行检测。结果:59例胃癌中,c-Met阳性率55.8%(33/59),HGF阳性率28.8%(17/59);在29例发生了同时或异时性肝转移的胃癌标本中,c-Met表达率为75.9%(22/29),HGF阳性率为37.9%(11/29),其中c-Met表达率在有和无肝转移组间有显著差异(P<0.05);在11例胃癌肝转移灶中,9例c-Met阳性表达率为81.8%,3例HGF阳性表达率为27.3%。结论:胃癌组织c-Met表达可能与胃癌肝转移行为相关。     

HGF基因转染促进同种瓣移植后体内再内皮化研究

目的探讨同种瓣经去内皮和肝细胞生长因子(HGF)转染处理后,不同移植时间点的再内皮化效果及CD137、Gab1表达情况。方法成年健康近交系中国雄性家兔为供体,近交系成年新西兰雌性大白兔为受体,行同种瓣补片法移植。受体随机分为3组,每组20只,新鲜组不做任何处理,作为对照;去内皮组行去内皮细胞处理;HGF组医用生物蛋白胶携载HGF质粒,对去内皮处理的移植物进行基因转染。分别于术后2、4、8、12周取出移植物,移植物行光镜与电镜观察组织形态变化,免疫组化法测定CD137与移植后2周Gab1的表达。结果去内皮组与新鲜组分别于移植后4周与8周出现新生内皮细胞,早期伴有不同程度的平滑肌细胞损伤;术后2周,HGF组移植物表面即出现大量内皮细胞覆盖,且无平滑肌细胞钙化坏死。新鲜组与去内皮组4、8、12周3个不同时间点的CD137表达较HGF组显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);HGF组样本中,移植物各时间点CD137表达情况比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组CD137的表达高峰均出现在第2周。移植2周时,HGF组Gab1表达量(0.198 2±0.024 3)明显高于新鲜组(0.107 7±0.010 4)与去内皮组(0.110 2±0.014 5),差异有统计学意义(P<0.01);新鲜组与去内皮组Gab1表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论去内皮及HGF基因转染处理同种瓣能够上调Gab1的表达,在移植早期(2周)实现体内再内皮化,同时抑制早期免疫反应。     

肝细胞生长因子及其c-Met受体表达与原发性小肝癌术后复发关系的初步研究

目的　探讨原发性小肝癌 (SHCC)切除术后血清肝细胞生长因子 (HGF)水平和癌组织中c Met受体表达与术后复发的关系。方法　采用ELISA对手术前后血清HGF浓度变化进行检测 ,并利用Western、Northern印迹杂交方法 ,测定肿瘤与非肿瘤组织内c Met蛋白表达量。结果　术前血清HGF浓度为 0 64± 0 15ng/ml,术后 3天为 1 41±0 2 8ng/ml,二者差异有显著性意义 (P <0 0 0 1)。术后 3天血清HGF浓度是术前的 2 3 2± 0 5 5倍。术后HGF的增长倍数与肿瘤组织内c Met蛋白的过度表达在术后复发与未复发者中差别有显著性意义(P <0 0 5 ) ,两年内复发者明显高于两年后复发及未复发者。结论　SHCC切除术后血清HGF水平明显增高 ,肿瘤组织本身c Met蛋白过度表达 ,可能与SHCC术后早期复发有关     

HGF+FGF-4体外定向诱导人骨髓来源的多能成体祖细胞向肝样细胞分化的特征性表型鉴定

目的 探索人骨髓来源多能成体祖细胞(hMAPCs)在肝细胞生长因子(HGF) 成纤维生长因子4(FGF4)诱导F分化为肝细胞的可行性,为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法 取健康成人适量骨髓,采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞并行贴壁培养,获取骨髓间充质干细胞(MSCs),将MSCs通过CD5、GIyA免疫微磁珠负分选得到hMAPCs;将获取的hMAPCs用HGF(20ng／m1) IFGF-4(10ng／m1)进行诱导分化,L-02人肝细胞株为阳性对照,未加任何诱导因素的hMAPCs为阴性对照;免疫细胞化学染色鉴定不同诱导分化阶段细胞的ALB、AFP、CK-18、CK-19等肝细胞特征的表型变化,并计数阳性细胞比率;Western blot检测诱导分化第21天、35天后细胞的ALB表达。结果 ALB、CK-18在诱导组中基本为阳性着色,CK-19均为阴性着色,AFP仅在诱导第7天有阳性着色。在诱导分化第21天、35天,ALB均有阳性表达。结论hMAPCs在一定诱导条件下具有向肝样细胞分化的潜能。     

大鼠肝卵圆细胞体外分离培养和诱导分化为肝细胞的初步研究

目的 探索体外诱导成年Wistar大鼠肝卵圆细胞(HOCs)分化为肝细胞的可行性.方法 雄性Wistar大鼠36只,建立肝卵圆细胞增殖模型,采用两步法灌注和Percoll密度梯度离心法分离纯化HOCs,行体外培养并添加HGF、OSM和FGF4诱导其分化.结果 每只模型大鼠肝脏体外分离可获得约1.34×105/ml HOCs,细胞为圆形、椭圆形或多角形,大小为正常肝细胞1/6～1/3,核质比例大,2周后可呈克隆样增殖生长.所获HOCs胞浆和胞膜表达干细胞标志Thy-1及C-kit,其原始细胞标志AFP呈阳性表达;能稳定传代,在HGF、OSM和FGF4刺激下形态逐渐发生改变,细胞伸展且体积渐增大,贴壁能力减弱,诱导14天后分化细胞Alb表达明显阳性,且随着诱导时间延长阳性率逐渐升高;诱导分化的细胞胞浆G-6-P及PAS染色均呈阳性.结论 HOCs在体外一定条件刺激下可诱导分化为肝细胞.     

肝细胞生长因子与脑保护

最早是由Nakamura等从部分肝切除大鼠的血清中分离到一种能刺激原代培养的肝细胞生长和合成的肝源性因子,并将其命名为肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)[1],又名离散因子(scatter factor).