反义寡核苷酸对淋巴瘤细胞Livin基因表达及细胞凋亡的影响

目的 分析凋亡抑制蛋白Livin基因的反义寡核苷酸(ASODN)对人淋巴瘤细胞株(Raji)Livin mR-NA表达的抑制作用及其对细胞凋亡的影响.方法 合成Livin特异性全硫代修饰的ASODN及其对照错义寡核苷酸(MSODN),通过脂质体转染Raji细胞,MTT法检测细胞的增殖抑制率;RT-PCR法检测转染前后Livin mRNA表达水平的变化;Hoechst染色观察细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仅检测细胞的凋亡率.结果 Livin ASODN能显著抑制Raji细胞的增殖(P<0.01),并呈现一定的剂量效应关系.0.6μmol/L的A-SODN作用Raji细胞48h后,Livin mRNA的表达水平明显下调,细胞出现凋亡的形态学改变,细胞凋亡率为(37.54±2.65)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01).结论 Livin ASODN能有效降低Livin mRNA表达水平,抑制Raji细胞增殖,并增强细胞凋亡的敏感性,有望成为淋巴瘤基因治疗的分子靶向.     

KDR反义寡核苷酸对人前列腺癌PC-3细胞增殖调控的研究

目的探讨血管内皮生长因子受体2(kinase insert domain-containing receptor,KDR)反义寡核苷酸(antisense oligode-oxynucleotides,ASODN)对人前列腺癌PC-3细胞的增殖调控作用。方法设计并合成KDR的正义、反义寡核苷酸,经脂质体介导转染人前列腺癌PC-3细胞。用噻唑盐法观察不同浓度(0.01,0.05,0.1,0.2,0.4μmol/L)正义、反义寡核苷酸及阳离子脂质体对肿瘤细胞增殖的抑制作用,RT-PCR方法检测不同浓度(0.01,0.05,0.1,0.2,0.4μmol/L)ASODN转染后KDRmRNA的表达情况,流式细胞仪分析细胞周期分布和细胞凋亡。结果转染ASODN后48 h达抑制高峰,低浓度(0.01μmol/L)即发生抑制,抑制强度与反义寡核苷酸浓度有相关性,而正义寡核苷酸和阳离子脂质体对PC-3细胞的增殖无显著影响。转染KDR反义寡核苷酸各浓度组细胞中KDR mRNA的表达都不同程度地降低,各浓度组与空白对照组相比KDR mRNA表达的差异有统计学意义。各组均出现不同程度的细胞凋亡,但各浓度组间细胞周期分布无显著性差异。结论 KDR基因在促进人前列腺癌PC-3细胞增殖中发挥着一定的作用,有望成为治疗雄激素非依赖性前列腺癌的分子靶点。     

Livin反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的：探讨Livin基因反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides,ASODN）对肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法：用阳离子脂质体介导Livin ASODN转染至A549细胞,反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测Livin基因mRNA的表达;MTT法检测转染细胞的生长抑制情况。结果：转染ASODN后A549细胞的Livin基因mRNA的表达明显减少,Livin基因ASODN显著抑制A549细胞增殖,并呈剂量依赖性,与对照的错义寡核苷酸（missense oligodeoxynucleotides,MSODN）比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：Livin反义寡核苷酸能明显抑制A549细胞Livin基因mRNA的表达,抑制细胞增殖,Livin基因有望成为肺癌基因治疗的新靶点。     

生存素反义寡核苷酸对人子宫内膜癌细胞增殖的抑制作用

 目的 探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）对人子宫内膜癌细胞HEC-1B增殖的抑制作用。方法 实验分空白对照组（control组）、单纯脂质体对照组（Lip组）、正义链转染对照组（SODN组）、ASODN转染组（ASODN组）4组。人工合成正、反义寡核苷酸,经脂质体将survivin正、反义寡核苷酸转染入子宫内膜癌细胞48 h后收集各组细胞。免疫印迹（Western blot）法检测各组细胞生存素表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝试验（MTT）法检测细胞生长抑制情况。结果 脂质体介导生存素反义寡核苷酸转染后的子宫内膜癌细胞出现生存素蛋白表达明显下降;ASODN转染组细胞凋亡率和增殖抑制率均明显高于各对照组（P<0.05）,而各对照组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论 生存素反义寡核苷酸转染子宫内膜癌细胞能下调生存素蛋白表达,诱导子宫内膜癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,对子宫内膜癌是一种有效的基因疗法。     

Survivin ASODN诱导胃癌细胞凋亡并增强OPT化疗敏感性的研究

目的 探讨转染survivin反义寡核苷酸(ASODN)对BGC-823细胞survivin mRNA表达及细胞增殖,凋亡和对羟基喜树碱(OPT)化疗敏感性的影响.方法 脂质体转染survivin ASODN,MTT检测生长抑制率,流式细胞术(FCM)及电镜检测细胞凋亡,RT-PCR检测survivin mRNA表达.结果 Survivin ASODN能抑制BGC-823细胞生长,促进其凋亡,并呈剂量依赖性.电镜下见BCC-823细胞呈早期凋亡改变.OFT处理组survivin mRNA表达明显高于对照组和ASODN OPT组(P<0.05).结论 Survivin ASODN可以抑制BGC-823细胞Survivin表达,诱导癌细胞凋亡并抑制其增殖.Survivin ASODN对OPT化疗有增敏作用,即使是多次给予OFF者仍可增敏.     

VEGF反义寡核苷酸抑制胆囊癌生长增殖和凋亡的体外实验研究

目的:探讨VEGF反义寡核苷酸转染对人胆囊癌GBC-SD细胞生长、增殖和凋亡的影响。方法:运用Oligofectamine介导VEGF反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)和错义寡核苷酸(Scrambled Oligodeoxynucleotide,SODN)转染人胆囊癌(GBC-SD)细胞。采用MTT法测定转染后各组细胞的生长曲线及抑制率,流式细胞术检测转染后不同时间各组细胞凋亡情况。结果:SODN组、SODN十Oligofectamine组对GBC-SD细胞生长无显著影响(P>0.05),ASODN组及ASODN十Oligofectamine组则能显著抑制GBC-SD细胞生长(P<0.05),且ASODN十Oligofectamine组对GBC-SD细胞生长增殖抑制作用较ASODN组更为强(P<0.05)。流式细胞术检测结果发现ASODN十Oligofectamine组能促进GBC-SD细胞凋亡(P<0.05)。结论:VEGFASODN转染能抑制胆囊癌GBC-SD细胞生长和增殖,Oligofectamine介导能明显增强VEGF ASODN的抑制作用;Oligofectamine介导VEGF反义寡核苷酸转染能促进胆囊癌GBC-SD细胞的凋亡。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对裸鼠人肺癌细胞皮下移植瘤的抑制作用

目的 探讨乙酰肝素酶反义寡核苷酸(HPSE ASODN)对人肺癌A549细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用.方法 设计合成互补于HPSE mRNA起始密码区的HPSE ASODN,以阳离子脂质体Lipofectamine包埋后转染人肺癌A549细胞进行培养.实验分ASODN组、脂质体组和对照组,采用Western-blotting检测各组A549细胞HPSE蛋白的表达;将反义寡核苷酸(ASODN)转染成功的人肺癌A549细胞注射于裸鼠皮下复制移植瘤模型(ASODN组),绘制移植瘤生长曲线,以免疫组织化学方法检测移植瘤肿瘤微血管密度(MVD),比较3组间肿瘤体积和MVD的差异.结果 与对照组和脂质体组比较,ASODN组A549细胞HPSE蛋白的表达受到明显抑制,差异有统计学意义(P ＜0.01);ASODN组裸鼠成瘤时间晚,移植瘤体积明显小于脂质体组和对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).ASODN组、脂质体组和对照组移植瘤的MVD计数分别为(13.5±1.8)、(24.3±2.5)和(24.7±2.6),与脂质体组、对照组比较,ASODN组MVD计数明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 HPSE ASODN明显抑制棵鼠人肺癌移植瘤的生长和血管生成,有希望成为一种有效的肺癌基因治疗方法.     

CTGF反义寡核苷酸治疗肺纤维化的实验研究

目的:观察CGTF反义寡核苷酸对体外培养的人肺成纤维细胞的抗增殖作用。方法:将人肺成纤维细胞随机分为对照组、空载体转染组、CTGF反义寡核苷酸(CTGF-ASODN)组、CTGF正义寡核苷酸(CTGF-SODN)组。CTGF错义寡核苷酸(CT-GF-SCDN)组,转染后观察细胞的增殖程度以及CTGF mRNA的表达。结果:转染了CTGF反义寡核苷酸(CTGF-ASODN)组人成纤维细胞的增殖明显受到抑制,其CTGF mRNA的表达明显减少。结论:应用CGTF反义寡核苷酸可以起到对人肺成纤维细胞的抗增殖作用。     

脂质体介导反义核苷酸转染骨肉瘤细胞后Survivin与VEGF表达的相互影响

目的探讨脂质体介导Survivin与VEGF反义核苷酸转染骨肉瘤细胞后表达的相互影响。方法分别采用脂质体介导Survivin基因的反义寡核苷酸(ASODN)和VEGF因子的反义寡核苷酸(ASODN)转染骨肉瘤细胞(9607细胞系),空脂质体处理对照组细胞;采用MTT法检测各组细胞的抑制率,RT-PCR法检测各组细胞Survivin和VEGF mRNA的表达。结果9607细胞转染两种ASODN后生长均受到抑制且呈时间依赖性。在Survivin-ASODN组和VEGF-ASODN组9607细胞中,SurvivinmRNA的相对表达量低于对照组;VEGF mRNA的相对表达量也较对照组降低。经统计软件相关分析Survivin-ASODN组Sur-vivin mRNA与VEGF mRNA表达量抑制率的相关系数r=0.602(p=0.038);VEGF-ASODN组中VEGF mRNA与Survivin mR-NA表达量的抑制率相关系数r=0.702(p=0.011)。结论Survivin-ASODN和VEGF-ASODN均能下调骨肉瘤细胞中Survivin和VEGF mRNA的表达,Survivin-ASODN和VEGF-ASODN能够抑制骨肉瘤细胞(9607细胞系)增殖,诱导其调亡。两者的表达具有相关性。     

Survivin与VEGF基因反义寡核苷酸联合应用人肺腺癌A549细胞作用研究

目的：探讨脂质体介导的血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）与生存素（Survivin）基因反义寡核苷酸联合应用对人肺腺癌细胞系A549生长的影响。方法：构建 VEGF 与 Survivin基因反义寡核苷酸,以脂质体转染人肺腺癌A549细胞。实验分为对照组、脂质体对照组、VEGF反义转染组（VEGF ASODN组）、Survivin反义转染组（Survivin ASODN组）、联合转染组（VEGF ASODN+Survivin ASODN组）。采用RT-PCR检测VEGF与Survivin基因表达;流式细胞仪分析细胞周期和凋亡、检测VEGF与Survivin蛋白表达;MTT观测细胞生长;平板集落实验分析细胞增殖克隆能力。结果：脂质体介导的VEGF与Survivin基因反义寡核苷酸联合转染组A549细胞存活率和增殖克隆能力明显低于其余组,差异有统计学意义（P=0.043,P=0.049,P=0.038,P=0.023）。流式细胞仪分析显示联合转染组细胞周期被阻滞,Survivin蛋白表达低于其余组,与对照组差异有统计学意义（P=0.017,P=0.002）,VEGF蛋白表达低于其余组,与对照组差异有统计学意义（P=0.013,P=0.003）。RT-PCR检测结果显示联合转染组VEGF与Survivin基因表达低于其余组。结论：VEGF与Survivin基因反义寡核苷酸联合应用抑制人肺腺癌A549细胞的增殖,延长细胞周期,抑制 VEGF与Survivin基因表达。为后续的动物实验打下了理论依据。     

PCNA的反义寡聚核苷酸抑制子宫颈癌HeLa细胞的研究

目的　检测脂质体介导增殖细胞核抗原 (PCNA)反义寡聚核苷酸抑制子宫颈癌细胞体外增殖活性效果。方法　应用细胞生长曲线和MTT比色法检测细胞增殖活性 ,并采用免疫组织化学方法 (SABC法 )检测PCNA蛋白的表达。结果　反义寡聚核苷酸处理组细胞与对照组比较生长曲线差异有显著性 ,增殖显著受抑 (P <0 0 5 ) ,PCNA蛋白表达完全抑制。而正义寡聚核苷酸组则无此作用 (P >0 0 5 )。结论　提示PCNA反义寡聚核苷酸可以显著抑制子宫颈癌细胞体外增殖活性 ,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现     

CTGF反义寡核苷酸对人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的研究结缔组织生长因子（CTGF）反义寡核苷酸（ASODN）对人肾小管上皮细胞（HKC）转分化的影响。方法用巨噬细胞趋化因子-1（MCP-1）和马兜铃酸Ⅰ（AAⅠ）联合诱导HKC转分化模型。实验设空白对照组、模型对照组、PEI组、CTGFASODN10ng/mL组和CTGF ASODN100ng/mL组,分别采用WST-8法、流式细胞术、RT-PCR法、细胞免疫组织化学法检测不同浓度的CTGF ASODN对HKC转分化模型细胞增殖和细胞周期的影响,以及α-SMA mRNA表达和α-SMA、TGF-β1、Fibronectin（FN）蛋白表达的变化。结果 100ng/mL的CTGF ASODN对MCP-1和AAⅠ联合诱导HKC转分化细胞具有促进细胞增殖的作用,并可减少实验模型导致的细胞S期阻滞,降低α-SMA mRNA表达,减少α-SMA、TGF-β1和FN蛋白的表达。结论 CTGFASODN能够抑制MCP-1和AAⅠ导致的人HKC转分化。     

靶向Livin反义寡核苷酸对结肠癌LoVo细胞增殖及对卡铂敏感性的影响

目的探讨靶向Livin反义寡核苷酸(ASODN)对结肠癌LoVo细胞增殖及Livin基因表达的影响,并观察其对卡铂敏感性的变化。方法 (1)用靶向Livin ASODN、随机寡核苷酸(RODN)分别转染LoVo细胞,反转录-聚合酶链式扩增反应检测Livin mRNA表达量变化;(2)流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况;(3)采用CCK-8法检测卡铂联合靶向Livin ASODN作用对肿瘤细胞的增殖抑制率。结果 Livin ASODN转染LoVo细胞明显抑制Livin mRNA表达,与空白对照组、RODN组比较差异均有统计学意义(P<0.01);流式细胞术碘化丙锭单染色显示,空白对照组、RODN组均未出现细胞亚二倍体峰;Livin ASODN组存在LoVo早期凋亡细胞,200、400 nmol.L-1的Livin ASODN组细胞亚二倍体百分率分别为(10.59±1.05)%、(11.63±1.27)%;卡铂单药半数抑制浓度(IC50)为3.33 mg.L-1,卡铂与Livin ASODN(100 nmol.L-1)联合,IC50为0.22 mg.L-1,表现为协同作用(Q≥1.15),增敏倍数15.14。结论靶向Livin ASODN下调Livin mRNA表达,诱导LoVo细胞凋亡并提高其对卡铂的敏感性。     

Beta-微管蛋白ⅢASODN对Ec9706/P-1细胞凋亡的影响

目的:观察β-微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ,TUBB3)反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide,ASODN)对Ec9706/P-1细胞凋亡的影响。方法:以体外诱导的人食管癌紫杉醇耐药细胞株Ec9706/P-1为模型,设ASODN组和无关序列寡核苷酸(Nonsense oligonucleotide,NSODN)组,应用免疫细胞化学方法检测NF-κBppabp65、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达;采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测NF-κBppabp65、bcl-2和caspase-3 mRNA的表达;采用DNA凝胶电泳和吖啶橙荧光染色法检测细胞凋亡变化。结果:免疫细胞化学方法显示ASODN组NF-κBppabp65蛋白表达率与NSODN组比较差异无统计学意义(P>0.05),ASODN组Bcl-2蛋白表达率与NSODN组比较差异有统计学意义(P<0.05),ASODN组Caspase-3蛋白表达率与NSODN组比较,差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR法显示ASODN组caspase-3 mRNA条带亮度强于NSODN组,bcl-2 mRNA条带亮度低于NSODN组,ASODN组NF-κBppab mRNA条带亮度与NSODN组相近;DNA凝胶电泳显示紫杉醇作用后ASODN组有凋亡特征的DNA改变,而NSODN组细胞却未出现;吖啶橙荧光染色法表明ASODN组凋亡率与NSODN组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TUBB3反义寡核苷酸增加了紫杉醇对Ec9706/P-1细胞的诱导凋亡能力,证明了Bcl-2和Caspase-3的表达变化很可能是产生紫杉醇耐药的主要机制之一。     

Survivin反义寡核苷酸诱导人膀胱移行细胞癌T24细胞凋亡的实验研究

目的Survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白家族新成员，在多数恶性肿瘤组织中丰富表达。因此，观察Survivin反义寡核苷酸（ASODN）转染对人膀胱移行细胞癌T24细胞凋亡、增殖、细胞对化疗药物敏感性的影响。方法设计合成针对Survivn mRNA特异性的ASODN，透射电镜观察细胞形态变化，流式细胞术检测各组细胞增殖指数（proliferative index，PI）和碉亡指数（apoptotic index，AI），RT-PCR法分析转染后Sur-vivn mRNA及Caspase-3 mRNA的变化，Western Blot法检测各组Survivn蛋白表达情况，荧光分光光度法测定Caspase-3的活性水平；MTT实验测定T24细胞对丝裂霉素（mitomycin，MMC）的敏感性。结果A—SODN转染组透射电镜下观察到凋亡的征象，而各对照组未见凋亡证据；各转染组细胞AI明显高于各对照组，PI明显低于各对照组（P〈0．01），且在一定范围内呈量一效关系，各对照组间差异无显著性（P〉0．05）；各转染组细胞Survivin mRNA、Survivin的表达较各对照组明显下调（P〈0．01），各对照组间差异无显著性（P〉0．05）；Caspase-3 mRNA的表达在各组细胞间差异无显著性（P〉0．05）；各转染组细胞Caspase-3活化水平较各对照组明显提高（P〈0．01），各对照组间差异无显著性（P〉0．05）；MTT实验显示，转染组MMC半数抑制浓度（IC50）较对照组明显下降，ASODN可提高T24细胞对MMC的敏感性。结论Survivin ASODN转染L细胞后可特异性封闭Survivin的表达，对Caspase-3 mRNA的表达无明显作用，能激活Caspase-3无活性前体，从而诱导T24细胞凋亡，抑制细胞增殖，提高T24细胞对化疗药物MMC的敏感性。     

白细胞介素-6反义核苷酸抑制胆管癌细胞增殖和诱导其凋亡的实验研究

目的:研究白细胞介素-6(IL-6)反义核苷酸(ASODN)对人肝内胆管癌HCCC-9810细胞增殖和凋亡的影响.方法:通过脂质体Lipofectamine"2000介导IL-6 ASODN转染人肝内胆管癌HCCC-9810细胞.细胞克隆率形成实验和MTT实验检测IL-6 ASODN对胆管癌细胞增殖的影响,流式细胞仪检...     

Bmi-1基因沉默对人视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞生长的体外抑制作用

[目的] 探讨体外沉默Bmi-1基因对人视网膜母细胞瘤SO-RB50瘤细胞增殖和凋亡的影响。[方法] 免疫组织化学和RT-PCR分别检测Bmi-1基因在人视网膜母细胞瘤瘤组织和SO-RB50瘤细胞中表达。体外化学合成法合成靶向Bmi-1基因的siRNA双链转染培养的人SO-RB50瘤细胞。荧光定量RT-PCR和western-blot分别检测转染Bmi-1 siRNA后的人SO-RB50瘤细胞中Bmi-1 mRNA和蛋白水平的变化。MTT法测定Bmi-1基因干扰后SO-RB50瘤细胞增殖情况。流式细胞仪检测Bmi-1 siRNA对人SO-RB50瘤细胞凋亡的影响。[结果] 免疫组化和RT-PCR显示Bmi-1基因在人视网膜母细胞瘤瘤组织和SO-RB50瘤细胞中表达。人SO-RB50瘤细胞经Bmi-1沉默处理后,与阴性对照组相比,Bmi-1在mRNA和蛋白水平抑制率分别为（83.9±3.2）%和（82.8±1.1）%。MTT结果显示干扰组细胞在第3天增殖抑制作用最明显,抑制率达（52.5±1.9）%。干扰组人SO-RB50瘤细胞凋亡率为（20.67±1.1）%,阴性组细胞凋亡率为（1.9±0.2）%,两者有统计学差异。[结论] Bmi-1特异性siRNA能显著抑制人SO-RB50瘤细胞 Bmi-1基因的表达,抑制细胞生长,可能通过促进瘤细胞凋亡而起作用,Bmi-1基因可能为RB治疗的新靶点。     

RNAi干扰Notch-1对人肝癌细胞BEL-7402 AFP表达及细胞增殖的影响

目的采用RNAi干扰细胞通讯因子Notch-1对肝癌细胞BEL-7402中AFP表达及细胞增殖的影响。方法通过siRNA抑制BEL-7402细胞中Notch-1的表达,采用qRT-PCR和Western blotting法,检测其对AFP表达的影响,采用MTI法测定细胞增殖情况。结果 siRNA抑制Notch-1达后,AFP mRNA及其蛋白水平显著下降,RNAi干扰组与对照组比较BEL-7402细胞生长明显受抑制(P<0.01)。结论 Notch-1 siRNA可以下调肝癌细胞BEL-7402中AFP mRNA及其蛋白的表达水平,抑制BEL-7402细胞的生长,提示Notch-1基因在肝癌细胞的发生、发展中具有重要作用,Notch-1可能是AFP过量表达肝癌的治疗靶点。